Ampliación de la comprensión del microambiente tumoral mediante imágenes de espectrometría de masas de muestras de tejido fijadas en formalina e incrustadas en parafina

La importancia de los numerosos tipos de células que rodean a las poblaciones de tumores clonales es un elemento crucial en la categorización de la carcinogénesis. El interés en dilucidar esta composición e interacciones del microambiente tumoral (TME) ha aumentado continuamente después del establecimiento de la terapia basada en el sistema inmunitario como parte del arsenal de tratamiento del cáncer. Por lo tanto, las estrategias de tratamiento han pasado de un enfoque centrado en el tumor a uno centrado en TME¹.

Los esfuerzos para dilucidar el papel de las células inmunes en la vigilancia tumoral y el desarrollo del cáncer han aumentado notablemente en los últimos años ^2,3. En la investigación médica, surgió una gran cantidad de métodos, incluidos los métodos basados en citometría y las tecnologías de imágenes singleplex y multiplex, como parte de este intento de descifrar las interacciones únicas de múltiples elementos de TME.

Los métodos pioneros como la citometría de flujo (inventada en la década de 1960), la clasificación celular activada por fluorescencia y la citometría de masas se centran principalmente en identificar y cuantificar los componentes de TME⁴. Aunque las técnicas cuantitativas basadas en la citometría permiten el fenotipado del paisaje inmune, determinar la distribución espacial celular es imposible. Por el contrario, métodos como la inmunohistoquímica singleplex estándar preservan la arquitectura tisular y permiten a los investigadores analizar la distribución celular, aunque un número reducido de dianas en una sola sección de tejido es una limitación de estos métodos ^5,6. En los últimos años, las tecnologías de imágenes multiplexadas para la resolución de una sola célula, como la inmunofluorescencia múltiple, las imágenes de fluorescencia de código de barras y la espectrometría de masas de imágenes, han surgido como estrategias integrales para adquirir información sobre la tinción simultánea de marcadores utilizando la misma sección⁷ de tejido.

Aquí presentamos una tecnología que combina anticuerpos marcados con metales y espectrometría de masas de iones secundarios y permite la cuantificación de resolución de células individuales, la coexpresión de marcadores (fenotipado) y el análisis espacial utilizando muestras de tejido fijado en formalina, embebido en parafina (FFPE) y congelado fresco (FF) ^8,9. Las muestras FFPE son los materiales más utilizados para el archivo de muestras de tejidos y representan un recurso más fácilmente disponible para las tecnologías de imágenes multiplexadas que las muestras congeladas frescas¹⁰. Además, esta tecnología ofrece la posibilidad de volver a adquirir imágenes meses después. Aquí, discutimos nuestros protocolos de tinción y procesamiento de imágenes utilizando muestras de tejido FFPE.

Las muestras de tejido se obtuvieron con fines de investigación de acuerdo con la Junta de Revisión Institucional del MD Anderson Cancer Center de la Universidad de Texas, y las muestras se desidentificaron aún más.

1. Selección de anticuerpos

1. Definir las preguntas de investigación para elegir los mejores clones de anticuerpos disponibles. Utilice el Atlas de proteínas humanas, la investigación publicada y los sitios web de fabricantes de anticuerpos como recursos de investigación.
   NOTA: La selección de controles adecuados de tejido humano y los mismos controles de tejido humano para ser teñidos en los diferentes pasos es fundamental para asegurarse de que los marcadores se tiñan correctamente, en el lugar correcto y en el compartimiento celular correcto. Siempre se recomienda un microarray de tejido pequeño (TMA) que incluya tejido normal y tejidos neoplásicos para la validación de la tinción.
2. Use solo anticuerpos libres de portadores para diseñar el panel.
   NOTA: Se requiere el uso de formulaciones de anticuerpos sin portador si no se dispone de un anticuerpo comercial sin portador; Los kits de purificación se pueden utilizar para ajustar el anticuerpo a la formulación correcta. Se sabe que los aditivos proteicos como la albúmina sérica bovina disminuyen la capacidad de conjugación.
3. Probar y valorar cada anticuerpo utilizando inmunohistoquímica cromogénica estándar para determinar el patrón subcelular de la expresión de un marcador; tinción de membrana, citoplasmática o nuclear; y expresión en células específicas en tejidos de control.
   NOTA: Sin embargo, cada anticuerpo debe probarse en citrato de pH 6 y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) de pH 9, y se debe determinar si el panel se teñirá con citrato de pH 6 o EDTA de pH 9. Se recomienda el uso de pH 9 EDTA para obtener buenas señales, especialmente cuando se trabaja con esta metodología.
4. Elegir la concentración de tinción óptima según el patrón de expresión en controles positivos.
5. Asigne cada anticuerpo a uno de los isótopos metálicos disponibles de acuerdo con la abundancia del marcador inmunohistoquímico, la localización subcelular y la coexpresión celular con los otros objetivos.
6. Teñir el anticuerpo con el metal asignado correspondiente y compararlo con la expresión en el mismo tejido control utilizado anteriormente.
   NOTA: La conjugación de metales de anticuerpos comienza con la preparación, reducción y conjugación posterior de anticuerpos (Archivo complementario 1). Cada tubo de polímero cargado de metal es suficiente para etiquetar 100 μg de un anticuerpo.

2. Diseño del panel de anticuerpos

1. Cree pequeños lotes de tinción de anticuerpos. Prueba hasta cinco marcadores en un cóctel.
   NOTA: La prueba de anticuerpos ya conjugados y analizados mediante inmunohistoquímica en lotes facilita la identificación temprana de interferencias de canal y brinda la oportunidad de reconjugar los anticuerpos con otro metal. También proporciona una oportunidad para evaluar la coexpresión adecuada del marcador.
2. Manche cada lote pequeño con cuatro concentraciones diferentes de anticuerpos (0,05 μg/ml, 0,2 μg/ml, 1 μg/ml y 4,0 μg/ml).
   NOTA: Comparando diferentes títulos, identifique la concentración de anticuerpos que da como resultado la ubicación correcta y la expresión más alta con una tinción de fondo mínima (mejor relación señal-ruido).

3. Sección de tejido FFPE

1. Seleccione portaobjetos recubiertos de oro (específicos para este propósito) y manténgalos cerca del micrótomo. Prepare el microtomo insertando una nueva cuchilla en el soporte. Ajuste el grosor de la sección a 4-5 μm.
2. Coloque los bloques FFPE en hielo antes de seccionar. Preparar un baño de flotación de tejidos calentando agua destilada o agua desionizada (_diH2O) a 40-45 °C.
   NOTA: El uso de_diH2Oo agua destilada reduce la posibilidad de contaminación.
3. Comience a seccionar. Coloque la sección de tejido en el agua con pinzas y deje que se aplana. Use los portaobjetos para eliminar secciones de tejido del agua.
4. Coloque los portaobjetos en una rejilla deslizante y déjelos secar a temperatura ambiente durante la noche.

4. Tinción de anticuerpos FFPE

NOTA: El proceso de tinción se lleva a cabo en dos días separados.

PRECAUCIÓN: Las soluciones empleadas en este protocolo son potencialmente corrosivas y representan peligros para la piel y los ojos. Se recomienda usar guantes, una bata de laboratorio y equipo protector para los ojos y la cara y parte de la política de bioseguridad de nuestra institución.

1. Preparación del reactivo (día 1)
   1. Diluir 50 ml de solución salina tamponada con Tris 20x con Tween (TBS-T) en 950 ml de_diH2Opara producir 1 L de TBS-T.
   2. Diluir 8 ml de ácido tris-etilendiaminotetraacético (EDTA) 10x en 72 ml de_diH2Opara hacer una solución de recuperación de epítopos inducida por calor (HIER) 1x.
   3. Diluir el suero de burro en 1x TBS-T a una concentración final del 5% para hacer tampón de bloqueo. Conservar la solución a 4 °C hasta que esté lista para su uso.
2. Preparación HIER: Módulo de pretratamiento (PT)
   PRECAUCIÓN: Use guantes de protección química cuando manipule cualquier reactivo o pieza sumergida en cualquier reactivo utilizado en el módulo PT.
   1. Diluir 140 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 10x en 1,260 ml de_diH2Opara hacer 1.4 L de 1x PBS. Alternativamente, diluir siete tabletas de PBS en 1.4 L de diH₂O.
   2. Llene un tanque con 1.4 L de PBS y coloque el recipiente de la cámara de deslizamiento preparado con 100 ml de 1x solución HIER en el tanque.
   3. Precaliente el tanque en un módulo PT a 75 °C.
3. Eliminación excesiva de parafina
   1. Hornear se desliza a 70 °C en un horno durante al menos 20 min.
      NOTA: Algunos pañuelos o secciones pueden necesitar tiempos de cocción más largos. El tiempo de cocción recomendado para el tejido cerebral o un TMA es de 1 h. Esto se puede extender a 16 h (durante la noche) o según la experiencia de laboratorio.
   2. Coloque las diapositivas horneadas en un portaportaobjetos y realice los siguientes pasos de lavado en una coctelera debajo de una campana extractora. Lave los portaobjetos en la siguiente solución: Xileno 2x para 30 s (sin metal), 100% alcohol 2x para 30 s (sin metal), 95% de alcohol 2x para 30 s (sin metal), 80% de alcohol para 30 s (sin metal), 70% de alcohol para 30 s (sin metal) y diH₂O 2x para 30 s (sin metal).
   3. Mantenga los portaobjetos en un recipiente nuevo de_diH2Ohasta que estén listos para la recuperación del antígeno.
      NOTA: Los portaobjetos no deben secarse hasta el final del procedimiento.
4. Recuperación de antígenos
   1. Coloque las guías en una cámara de deslizamiento precalentada que contenga 1x búfer HIER dentro del módulo PT. Coloque la tapa en el tanque. Cierre y cierre la tapa.
   2. Pulse el botón Menú del módulo PT para abrir el menú principal y pulse el botón Ciclo de configuración (hora y temperatura) para crear un programa personalizado.
   3. Ejecute el módulo PT a 97 °C durante 40 min. Después, el módulo PT se enfriará automáticamente a 65 °C.
   4. Retire los portaobjetos del módulo PT una vez que se alcance la temperatura de 65 °C. Mantenga los portaobjetos a temperatura ambiente durante 30 min.
      NOTA: El módulo PT no se abrirá hasta que la temperatura se enfríe a 65 °C. No toque la superficie dorada de los portaobjetos durante este proceso, y siempre use guantes.
5. Bloqueo de anticuerpos
   1. Ajuste un agitador a 70 rpm.
   2. Lave los portaobjetos sumergiéndolos en 1x TBS-T durante 5 min 2x.
   3. Con un bolígrafo de barrera hidrófoba, dibuje un borde alrededor de la sección de tejido al menos a 1 mm de distancia de los bordes de la corredera y déjelo secar durante 15-30 s.
      NOTA: Tenga cuidado de evitar que el líquido de la pluma toque la sección de tejido para evitar cualquier interferencia de tejido con la tinción. No presione la pluma demasiado fuerte mientras dibuja la barrera para evitar posibles fugas. Para obtener resultados óptimos de tinción y adquisición de imágenes, las secciones de tejido se colocan en el centro de los portaobjetos recubiertos de oro en un marco no mayor de 15 mm x 30 mm para permitir suficiente espacio para dibujar la barrera sin tocar el tejido o los puntos guía colocados en el borde exterior del portaobjetos.
   4. Para eliminar cualquier residuo de pluma, sumerja las diapositivas en TBS-T.
   5. En una cámara de humedad a temperatura ambiente, incubar la sección de tejido con 100-200 μL de tampón de bloqueo durante 20 min. Deje el tejido incubando en el tampón de bloqueo hasta que esté lista una mezcla maestra de anticuerpos.
6. Preparación del panel de anticuerpos
   NOTA: El volumen final del cóctel del panel de anticuerpos varía de acuerdo con el área de superficie estimada de la sección de tejido. Para cubrir un área de 20 mm x 20 mm, prepare 100-200 μL del cóctel.
   Haga lo siguiente para preparar un cóctel de panel de anticuerpos conjugados con isótopos metálicos:
   1. Confirme el volumen final del cóctel que es igual al volumen del cóctel de anticuerpos agregado al volumen del tampón de bloqueo.
   2. Confirme las especificaciones de todos los anticuerpos, diluciones y/o concentraciones de anticuerpos en una hoja de cálculo de panel para el proyecto.
   3. Haga girar todos los tubos que contienen anticuerpos a 10,000 x g durante 5 min. Agregue anticuerpos individuales al tampón de bloqueo y mezcle muy bien. No altere la parte inferior del tubo de anticuerpos al pipetearlo.
   4. Filtrar el panel de anticuerpos humedeciendo previamente un dispositivo de filtro centrífugo de 0,1 μm con 100 μL de tampón de bloqueo. Gire el filtro a 10.000 x g durante 2 minutos y retire el flujo del búfer de bloqueo con una pipeta.
   5. Transfiera el panel de anticuerpos a una columna de centrifugado y gire el filtro a 10.000 x g durante 2 min. Deseche la columna de centrifugado y utilice el flujo como panel de anticuerpos filtrados.
      NOTA: Realice la tinción inmediatamente después de hacer el cóctel para evitar el intercambio de metales. Si se necesita almacenar el cóctel de anticuerpos durante un tiempo prolongado, puede someterse a liofilización.
7. Tinción de anticuerpos
   1. Retire con cuidado el búfer de bloqueo de las diapositivas inclinando cada diapositiva de lado y golpeando suavemente los bordes contra un limpiaparabrisas de tareas.
   2. Coloque los portaobjetos en una cámara de humedad y agregue 100-200 μL de mezcla maestra de anticuerpos al tejido (evite el contacto con el tejido y la creación de burbujas de aire).
   3. Agregue portaobjetos de control positivo y negativo al lote de tinción.
   4. Incubar los toboganes a 4 °C durante la noche (14-16 h).
8. Preparación del reactivo (día 2)
   1. Diluir 100 ml de 10x PBS bajo en bario, pH 7.4, en 900 mL de_diH2Opara hacer 1x PBS.
   2. Preparar 350 ml de una solución material de trabajo de glutaraldehído al 2% en PBS bajo en bario (340 ml de PBS bajo en bario + 10 ml de glutaraldehído al 70%).
      NOTA: Realice la dilución bajo una campana. El glutaraldehído es un líquido muy viscoso. Use una pipeta de 1 ml y agregue 1 ml de PBS bajo en bario al tubo de glutaraldehído cada vez hasta que se vuelva lo suficientemente líquido como para salir del tubo.
   3. Diluir 10x Tris, pH 8.5, en 900 mL de diH₂0 para hacer 1x Tris.
9. Fijación y deshidratación
   1. Retire la mezcla maestra de anticuerpos de cada portaobjetos inclinando la corredera de lado y golpeando suavemente el borde contra un limpiaparabrisas de tareas.
   2. Lave las diapositivas con agitación ligera a moderada en los siguientes tampones: 1x TBS-T, 3 veces durante 5 minutos cada una (sin metal); glutaraldehído filtrado al 2% durante 5 min; filtrado 1x tris, pH 8.5, 3x durante 30 s; diH₂O 2x filtrado durante 30 s; 70% de alcohol durante 30 s (sin metal); 80% de alcohol durante 30 s (sin metal); 95% de alcohol durante 30 s (sin metal); y 100% alcohol durante 30 s (sin metal).
   3. Golpee suavemente el borde de cada portaobjetos contra un limpiaparabrisas de tareas para eliminar el exceso de alcohol y permitir que el alcohol residual se evapore a temperatura ambiente (~ 5-10 min).
   4. Seque los portaobjetos en un desecador durante al menos 1 hora antes de la adquisición de la imagen o mantenga los portaobjetos en una cámara de vacío para su almacenamiento a largo plazo.

5. Adquisición de imágenes

1. Configuración de diapositivas
   NOTA: Antes de escanear con el instrumento, las diapositivas deben definirse y configurarse utilizando la aplicación de administración de imágenes basada en web siguiendo los pasos que se describen a continuación.
   1. En la página de diapositivas de la aplicación de administración de imágenes basada en web, haga clic en Adhesión a nueva diapositiva e introduzca los detalles deseados (nombre, identificación de diapositiva, ubicación y descripción).
   2. Cree secciones de escaneo haciendo clic en Agregar sección. Complete la información de cada sección (nombre del proyecto, nombre de la diapositiva, bloque y posición). Para guardar las nuevas diapositivas o secciones creadas, haga clic en Enviar.
   3. En la pestaña de recursos, abra la página de paneles y seleccione el panel que se utilizará. Para paneles nuevos, haga clic en Crear nuevo panel.
   4. Después de seleccionar el panel, haga clic en Secciones. Agregue las secciones creadas en el paso 2. haciendo clic en Editar asignación de sección. Guarde haciendo clic en Enviar.
2. Configuración del instrumento
   NOTA: Este instrumento (ver Tabla de materiales) se opera utilizando un programa de software de control específico (ver Tabla de materiales).
   1. Inicie sesión en el software de control. Haga clic en Despertar si el instrumento está en modo de suspensión.
      NOTA: Al menos 1 h antes de la operación, se recomienda calentar el instrumento, lo que ayuda con la estabilización del enfoque del haz.
   2. Para cargar una diapositiva, haga clic en Ejemplo de Exchange y, a continuación, haga clic en Continuar para abrir la puerta. Coloque la diapositiva en la ranura de carga con la muestra hacia arriba y la etiqueta a la derecha. Haga clic en Continuar para cerrar la puerta.
      NOTA: Si la diapositiva no se carga correctamente, aparecerá un sonido de advertencia y una notificación para ajustar la diapositiva.
   3. Seleccione el proyecto y, a continuación, seleccione el nombre de diapositiva para la muestra cargada.
   4. Visualice la imagen panorámica en el panel de imagen óptica de diapositiva.
3. Selección y adquisición del campo de visión (FOV)
   1. Haga clic en el menú Modo y seleccione SED (Detector de electrones secundario). Haga clic en el menú de modo de imagen y seleccione QC −300 μm.
   2. Haga clic en Jog Stage para controlar la ubicación del campo de visión y luego haga clic en las flechas para navegar y seleccionar la posición del FOV.
   3. Haga clic en Agregar FOV, establezca 400 μm x 400 μm como tamaño de campo y seleccione fino como modo de imagen y 1 ms de tiempo de permanencia. Haga clic en Confirmar.
      NOTA: El tiempo de permanencia establecido dependerá de la resolución deseada. El tiempo de permanencia aumenta a medida que aumenta la resolución. El tiempo de adquisición puede variar dependiendo de múltiples factores, incluido el período de rodaje del detector y la duración de la operación. Nuestro tiempo medio de adquisición para un campo de visión es de aproximadamente 17 minutos. Utilice el instrumento sin parar durante un máximo de 8 h, lo que permite escanear aproximadamente 28 FOG. La calidad de las imágenes adquiridas disminuye después de muchas horas consecutivas de uso.
   4. Después de crear una lista de campo de visión, proceda al enfoque de la imagen y ajuste el estigma moviendo el haz a una región de tejido que no se visualizará. Ajuste los parámetros hasta obtener una imagen central clara.
      NOTA: Para optimizar la adquisición de imágenes, lo ideal es mantener la sección de tejido centralizada en el portaobjetos. Al enfocar, se puede obtener una imagen clara de solo el área central. Si la sección de tejido es demasiado grande, los bordes estarán desenfocados y la imagen se verá borrosa.
   5. Haga clic en Iniciar ejecución. Las imágenes adquiridas se cargarán y almacenarán automáticamente en la aplicación de gestión de imágenes basada en la web.

6. Preparación de la imagen

1. Corrección isobárica de imagen
   NOTA: El propósito de la corrección isobárica es eliminar la señal de derrame entre canales resultante de la presencia de isótopos de masa igual o muy similar cuyas diferencias de masa no pueden detectarse utilizando el analizador de masas.
   1. En la aplicación de gestión de imágenes basada en la web, haga clic en el icono verde Descargar para guardar los FOV (imágenes TIFF).
   2. Descargue la versión más actualizada del software de procesamiento de imágenes (consulte la Tabla de materiales) disponible en la pestaña Acerca de en la aplicación de administración de imágenes basada en web y guárdela en un archivo. Abra el archivo de almacenamiento .zip y siga los pasos de instalación. Abra el software una vez completada la instalación.
   3. Seleccione la carpeta que contiene las imágenes a corregir haciendo clic en el icono Archivo en el panel de entrada del software de procesamiento de imágenes. Se cargará una lista FOV.
   4. Haga clic en el icono Filtro en el panel de entrada para aplicar las correcciones predeterminadas. Para cada canal, visualice las imágenes obtenidas antes y después de la corrección en el lado derecho de la pantalla.
   5. Haga clic en el icono Disquete del panel de salida para guardar la imagen corregida.
2. Filtrado de imágenes: teselación Voronoi
   NOTA: Los diagramas de teselación de Voronoi ilustran una partición del espacio que contiene puntos semilla en celdas de Voronoi. El objetivo es estimar la densidad celular y definir los límites celulares. Usando el cálculo de teselación de Voronoi, se genera una máscara y se aplica a la imagen original para filtrar.
   1. Haga clic en la pestaña Filtrado y seleccione Voronoi Tesselation en el menú de parámetros de filtrado.
   2. En el panel de entrada, seleccione la imagen MassCorrected.tiff. Haga clic en el icono Filtro en el panel de entrada.
   3. Haga clic en el icono Disquete del panel de salida para guardar la imagen filtrada. Los dos archivos resultantes tendrán los sufijos -Filtered.tiff y -Filtered.json.
      NOTA: La imagen denominada MassCorrected-Filtered.tiff se puede cargar en un programa de software de análisis digital de terceros o en un programa de software de código abierto.

Se obtuvieron secciones de tejido TMA de adenofégdalas y pulmón (5 mm de espesor) y se colocaron en el centro de portaobjetos recubiertos de oro siguiendo las especificaciones con respecto al tamaño del tejido y los márgenes seguros de los portaobjetos. Los márgenes de vidrio libre de 5 mm y 10 mm entre el borde del tejido y los bordes lateral e inferior de los portaobjetos de vidrio, respectivamente, son necesarios para una tinción óptima. Las secciones de tejido se hornearon durante la noche en un horno antes de la tinción para asegurar la adherencia adecuada de la sección al portaobjetos. El panel de anticuerpos estaba compuesto por 23 marcadores. En el mismo lote de tinción, se incluyeron un portaobjetos de amígdalas y un portaobjetos TMA que contenían múltiples tejidos para evaluar la expresión de marcadores escasamente expresados en muestras de adenocarcinoma de pulmón (Figura 1). Los controles positivos deben elegirse de acuerdo con los objetivos de los anticuerpos utilizados en los paneles; por ejemplo, para evaluar la expresión de SOX10, se necesitan muestras de melanoma, y para evaluar la expresión de GAFP, se necesitan muestras de glioblastoma (Figura 2).

Figura 1: Pureza isotópica y diafonía del canal. La matriz muestra el porcentaje de diafonía derivada de la pureza y los óxidos de la sonda (cajas azules, ≥0,5%; cajas transparentes, <0,5%). Para las etiquetas de masa, se muestran las sondas que contribuyeron con al menos un 0,5% de diafonía en ningún canal (verde), uno o dos canales (amarillo) o más de dos canales (naranja). También se muestran canales masivos que reciben al menos un 0,5% de diafonía sin sondas (verde), una o dos sondas (amarillo) o más de dos sondas (naranja). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Imágenes representativas de tinción en diferentes tejidos . (A) Adenocarcinoma de pulmón. (B) Riñón no neoplásico. c) Amígdalas. CD20 se muestra en amarillo, Ki67 se muestra en magenta, CD3 se muestra en blanco, CD11c se muestra en verde, CD68 se muestra en rojo, citoqueratina se muestra en cian, y el ADN bicatenario (dsDNA) se muestra en azul. Ampliación, 200x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Este procedimiento de tinción se asemeja mucho a la tinción inmunohistoquímica estándar y ocurrió en dos días consecutivos. Los cinco pasos principales del protocolo de tinción son 1) eliminación excesiva de parafina, 2) recuperación de antígenos, 3) bloqueo de anticuerpos, 4) tinción de anticuerpos y 5) fijación y deshidratación (Figura 3). Un paso fundamental en el procedimiento de tinción es tomar precauciones para evitar la contaminación metálica de las muestras, incluido el uso de reactivos libres de metal almacenados en artículos de plástico y el manejo cuidadoso de las muestras para limitar el daño mecánico. Se recomienda preparar el cóctel de anticuerpos inmediatamente antes de la tinción. Esto reduce el intercambio de metales. Una vez que se completó la tinción, almacenamos las diapositivas y las escaneamos al día siguiente. Antes de la adquisición de imágenes, un paso necesario es la configuración de diapositivas mediante una aplicación de administración de imágenes basada en web (Figura 4).

Figura 3: Flujo de trabajo de adquisición de imágenes y la diapositiva asociada. (A) Resumen del flujo de trabajo de adquisición de imágenes. 1) Una sección de tejido FFPE teñida con anticuerpos conjugados con metales se rasteriza utilizando una pistola de iones primarios, liberando iones secundarios. 2) Un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo separa y mide los iones en función de su masa a nivel de píxeles. 3) Cuantificación basada en píxeles de iones secundarios. El eje y corresponde al número de iones detectados (pico), y el eje x corresponde a la masa de cada metal. 4) Sobre la base del pico de cada espectro de masas, se reconstruyen imágenes multidimensionales. (B) Esquema de la diapositiva utilizada en este procedimiento. Para una tinción óptima del tejido, la sección debe colocarse al menos a 5 mm del borde lateral del portaobjetos y a 10 mm de su borde inferior. Al dibujar la barrera hidrófoba alrededor de la sección de tejido, debe mantenerse dentro del rectángulo al menos a 1 mm del borde de la diapositiva. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Configuración de diapositivas en la aplicación de administración de imágenes basada en web. Antes de escanear diapositivas, es necesario configurar cada diapositiva. Introduzca los detalles deseados que pueden ayudar con la identificación de diapositivas. Haga clic en Agregar sección (flecha negra) para incluir la información de bloque y posición. Para guardar, haga clic en Enviar (flecha roja). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El día del escaneo, encienda el instrumento de adquisición con el software de control. Al hacer clic en Exchange Slide se abrió la puerta del instrumento, permitiendo cargar una diapositiva. Colocamos la corredera en la ranura de carga hacia arriba con la etiqueta en el lado derecho. Solo se puede escanear una diapositiva a la vez. El siguiente paso fue seleccionar los FOV y ajustar el enfoque y la estigmatización siguiendo los pasos descritos en el protocolo. Adquirimos imágenes haciendo clic en Start Run. El tiempo de adquisición varía según el tamaño del campo de visión y la resolución deseada. El tamaño del campo de visión varía de 200 μm x 200 μm a 800 μm x 800 μm, lo que corresponde a un rango de tamaño de fotograma de 128 píxeles x 128 píxeles a 2048 píxeles x 2048 píxeles. Hay tres resoluciones estándar disponibles: gruesa, fina y superfina. El escaneo de FOV más grandes a resolución superfina lleva mucho tiempo, y el tiempo de adquisición final para un campo de visión oscila entre 25 s y 4,7 h (Figura 5).

Figura 5: Adquisición de imágenes utilizando el software de control. La configuración de adquisición se puede ajustar como se desee. Para modificar la resolución de escaneo, haga clic en el menú desplegable junto al Modo de imagen (flecha negra). Para modificar el tamaño del campo FOV, introduzca un número en el campo Tamaño del campo FOV (μm) (flecha roja). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Una vez completado el escaneo, se cargó automáticamente un conjunto de imágenes que incluía todos los FOV en la aplicación de administración de imágenes basada en la web. Además del almacenamiento de imágenes, esta aplicación permite la visualización de todos los canales juntos o por separado, ajustes de imagen y descarga de imágenes para su posterior preparación. La imagen visualizada estándar se guarda como un archivo TIFF (Figura 6).

Figura 6: Visualización de imágenes mediante la aplicación de administración de imágenes basada en web. Las imágenes adquiridas se almacenan y visualizan utilizando la plataforma en línea. Es posible ajustar los parámetros de visualización y cambiar el color de cada marcador. Haga clic en Agregar canal de imagen (flecha blanca) para visualizar otros marcadores. Ampliación, 200x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Las interferencias metálicas son inherentes a los métodos de etiquetado de metales a pesar del uso de estrategias para minimizarlas. Para eliminar el exceso de señales de fondo del isótopo metálico conjugado con los anticuerpos y preparar las imágenes para el análisis, utilizamos el software de procesamiento de imágenes asociado (ver Tabla de materiales). El procedimiento de preparación de la imagen tiene dos pasos: 1) corrección isobárica, que elimina las señales entre canales, y 2) filtrado, que elimina las señales causadas por agregados en la imagen.

Para iniciar la corrección isobárica, se seleccionó el archivo que contiene la imagen TIFF guardada haciendo clic en el icono Archivo del panel de entrada. El software carga automáticamente todas las imágenes TIFF archivadas en el archivo, lo que permite el análisis por lotes. A continuación, corregimos la imagen haciendo clic en el icono Filtro del panel de entrada. Se generaron automáticamente dos archivos resultantes con el sufijo -MassCorrected: uno archivado en formato TIFF y el otro archivado en formato JSON. De forma predeterminada, los archivos resultantes se guardaron en el mismo archivo desde el que se cargó la imagen inicial (Figura 7).

Figura 7: Preparación de la imagen: paso de corrección. Para cargar una imagen para su preparación en el software de procesamiento de imágenes, haga clic en el icono Archivo en el panel de entrada (flecha negra) y seleccione la imagen. Para aplicar el procedimiento de corrección predeterminado, haga clic en el icono Filtro en el panel de entrada (flecha roja). Para guardar la imagen actualizada y corregida, haga clic en el icono Disquete del panel de salida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El segundo paso de la preparación de la imagen es el filtrado, que se puede seleccionar en la pestaña superior del software. Seleccionamos la imagen corregida en el panel de entrada. En este paso, se utilizó la teselación automatizada de Voronoi como parámetro de filtrado. Al hacer clic en el icono de filtro en el panel de entrada, se aplicó automáticamente el filtro seleccionado a todos los canales. En ambos pasos de preparación de imágenes (corrección y filtrado), las imágenes de cada canal antes y después del procesamiento y las diferencias de señal se muestran en el lado derecho de la pantalla.

Similar al paso de corrección isobárica, se generaron dos nuevos archivos, uno en formato TIFF y otro en formato JSON. En este paso, el sufijo que seguía al nombre del archivo era -Filtered. Por lo tanto, la imagen final obtenida se denominó MassCorrected-Filtered.tiff. Al completar estos pasos, preparamos la imagen para el análisis utilizando el software de patología digital preferido (Figura 8 y Figura 9). Mediante el uso de esta técnica, pudimos analizar los 23 marcadores en el panel de anticuerpos con interferencias mínimas entre canales a nivel subcelular en una sola sección de tejido.

Figura 8: Preparación de la imagen: paso de filtrado. Seleccione Filtrado en la pestaña superior (flecha negra) en el software de procesamiento de imágenes. En Parámetros de filtrado, seleccione el método deseado (flecha verde). En el panel de entrada, seleccione Imagen corregida por masa. Para aplicar el procedimiento seleccionado a la imagen, haga clic en el icono Filtro en el panel de entrada (flecha roja). Para guardar la imagen filtrada actualizada, haga clic en el icono Disquete del panel de salida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9: Imágenes representativas de la tinción antes y después de la preparación de la imagen. (A) Imagen de una sección de tejido de amígdalas teñida usando esta técnica y visualizada usando un programa de software de análisis de imágenes digitales de terceros antes de filtrar y corregir. (B) Imagen de la misma sección en las mismas condiciones después de los pasos de filtrado y corrección. CD20 se muestra en amarillo, Ki67 se muestra en magenta, CD3 se muestra en blanco, CD11c se muestra en verde, citoqueratina se muestra en cian, y el ADN bicatenario (dsDNA) se muestra en azul. Ampliación, 200x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo complementario 1: Lista de paneles de anticuerpos. Cada anticuerpo se conjugó a un isótopo metálico específico con una masa diferente a la indicada. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Los autores no tienen conflictos que revelar.