Method Article

Ampliación de la comprensión del microambiente tumoral mediante imágenes de espectrometría de masas de muestras de tejido fijadas en formalina e incrustadas en parafina

DOI:

10.3791/64015

⸱

June 29th, 2022

 ,  ,  , 
1Department of Translational Molecular Pathology, The University of Texas MD Anderson Cancer Center

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En la era de la inmunoterapia contra el cáncer, el interés en dilucidar la dinámica del microambiente tumoral ha aumentado sorprendentemente. Este protocolo detalla una técnica de imagen de espectrometría de masas con respecto a sus pasos de tinción e imagen, que permiten un análisis espacial altamente multiplexado.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los avances en las terapias basadas en el sistema inmunitario han revolucionado el tratamiento y la investigación del cáncer. Esto ha desencadenado una creciente demanda para la caracterización del paisaje inmune tumoral. Aunque la inmunohistoquímica estándar es adecuada para estudiar la arquitectura de los tejidos, se limita al análisis de un pequeño número de marcadores. Por el contrario, técnicas como la citometría de flujo pueden evaluar múltiples marcadores simultáneamente, aunque se pierde información sobre la morfología del tejido. En los últimos años, las estrategias multiplexadas que integran el análisis fenotípico y espacial han surgido como enfoques integrales para la caracterización del paisaje inmune tumoral. Aquí, discutimos una tecnología innovadora que combina anticuerpos marcados con metal y espectrometría de masas de iones secundarios que se centra en los pasos técnicos en el desarrollo y optimización de ensayos, la preparación de tejidos y la adquisición y procesamiento de imágenes. Antes de la tinción, se debe desarrollar y optimizar un panel de anticuerpos marcado con metal. Este sistema de imagen hi-plex admite hasta 40 anticuerpos marcados con metal en una sola sección de tejido. Cabe destacar que el riesgo de interferencia de señal aumenta con el número de marcadores incluidos en el panel. Después del diseño del panel, se debe prestar especial atención a la asignación de isótopos metálicos al anticuerpo para minimizar esta interferencia. Las pruebas preliminares de panel se realizan utilizando un pequeño subconjunto de anticuerpos y pruebas posteriores de todo el panel en tejidos de control. Las secciones de tejido fijadas en formalina e incrustadas en parafina se obtienen y montan en portaobjetos recubiertos de oro y se tiñen aún más. La tinción dura 2 días y se parece mucho a la tinción inmunohistoquímica estándar. Una vez que las muestras se tiñen, se colocan en el instrumento de adquisición de imágenes. Se seleccionan los campos de vista y se adquieren, cargan y almacenan las imágenes. La etapa final es la preparación de la imagen para el filtrado y la eliminación de interferencias utilizando el software de procesamiento de imágenes del sistema. Una desventaja de esta plataforma es la falta de software analítico. Sin embargo, las imágenes generadas son compatibles con diferentes software de patología computacional.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La importancia de los numerosos tipos de células que rodean a las poblaciones de tumores clonales es un elemento crucial en la categorización de la carcinogénesis. El interés en dilucidar esta composición e interacciones del microambiente tumoral (TME) ha aumentado continuamente después del establecimiento de la terapia basada en el sistema inmunitario como parte del arsenal de tratamiento del cáncer. Por lo tanto, las estrategias de tratamiento han pasado de un enfoque centrado en el tumor a uno centrado en TME1.

Los esfuerzos para dilucidar el papel de las células inmunes en la vigilancia tumoral y el desarrollo del cáncer han aumentado notablemente en los últimos años 2,3. En la investigación médica, surgió una gran cantidad de métodos, incluidos los métodos basados en citometría y las tecnologías de imágenes singleplex y multiplex, como parte de este intento de descifrar las interacciones únicas de múltiples elementos de TME.

Los métodos pioneros como la citometría de flujo (inventada en la década de 1960), la clasificación celular activada por fluorescencia y la citometría de masas se centran principalmente en identificar y cuantificar los componentes de TME4. Aunque las técnicas cuantitativas basadas en la citometría permiten el fenotipado del paisaje inmune, determinar la distribución espacial celular es imposible. Por el contrario, métodos como la inmunohistoquímica singleplex estándar preservan la arquitectura tisular y permiten a los investigadores analizar la distribución celular, aunque un número reducido de dianas en una sola sección de tejido es una limitación de estos métodos 5,6. En los últimos años, las tecnologías de imágenes multiplexadas para la resolución de una sola célula, como la inmunofluorescencia múltiple, las imágenes de fluorescencia de código de barras y la espectrometría de masas de imágenes, han surgido como estrategias integrales para adquirir información sobre la tinción simultánea de marcadores utilizando la misma sección7 de tejido.

Aquí presentamos una tecnología que combina anticuerpos marcados con metales y espectrometría de masas de iones secundarios y permite la cuantificación de resolución de células individuales, la coexpresión de marcadores (fenotipado) y el análisis espacial utilizando muestras de tejido fijado en formalina, embebido en parafina (FFPE) y congelado fresco (FF) 8,9. Las muestras FFPE son los materiales más utilizados para el archivo de muestras de tejidos y representan un recurso más fácilmente disponible para las tecnologías de imágenes multiplexadas que las muestras congeladas frescas10. Además, esta tecnología ofrece la posibilidad de volver a adquirir imágenes meses después. Aquí, discutimos nuestros protocolos de tinción y procesamiento de imágenes utilizando muestras de tejido FFPE.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Las muestras de tejido se obtuvieron con fines de investigación de acuerdo con la Junta de Revisión Institucional del MD Anderson Cancer Center de la Universidad de Texas, y las muestras se desidentificaron aún más.

1. Selección de anticuerpos

  1. Definir las preguntas de investigación para elegir los mejores clones de anticuerpos disponibles. Utilice el Atlas de proteínas humanas, la investigación publicada y los sitios web de fabricantes de anticuerpos como recursos de investigación.
    NOTA: La selección de controles adecuados de tejido humano y los mismos controles de tejido humano para ser teñidos en los diferentes pasos es fundamental para asegurarse de que los marcadores se tiñan correctamente, en el lugar correcto y en el compartimiento celular correcto. Siempre se recomienda un microarray de tejido pequeño (TMA) que incluya tejido normal y tejidos neoplásicos para la validación de la tinción.
  2. Use solo anticuerpos libres de portadores para diseñar el panel.
    NOTA: Se requiere el uso de formulaciones de anticuerpos sin portador si no se dispone de un anticuerpo comercial sin portador; Los kits de purificación se pueden utilizar para ajustar el anticuerpo a la formulación correcta. Se sabe que los aditivos proteicos como la albúmina sérica bovina disminuyen la capacidad de conjugación.
  3. Probar y valorar cada anticuerpo utilizando inmunohistoquímica cromogénica estándar para determinar el patrón subcelular de la expresión de un marcador; tinción de membrana, citoplasmática o nuclear; y expresión en células específicas en tejidos de control.
    NOTA: Sin embargo, cada anticuerpo debe probarse en citrato de pH 6 y ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) de pH 9, y se debe determinar si el panel se teñirá con citrato de pH 6 o EDTA de pH 9. Se recomienda el uso de pH 9 EDTA para obtener buenas señales, especialmente cuando se trabaja con esta metodología.
  4. Elegir la concentración de tinción óptima según el patrón de expresión en controles positivos.
  5. Asigne cada anticuerpo a uno de los isótopos metálicos disponibles de acuerdo con la abundancia del marcador inmunohistoquímico, la localización subcelular y la coexpresión celular con los otros objetivos.
  6. Teñir el anticuerpo con el metal asignado correspondiente y compararlo con la expresión en el mismo tejido control utilizado anteriormente.
    NOTA: La conjugación de metales de anticuerpos comienza con la preparación, reducción y conjugación posterior de anticuerpos (Archivo complementario 1). Cada tubo de polímero cargado de metal es suficiente para etiquetar 100 μg de un anticuerpo.

2. Diseño del panel de anticuerpos

  1. Cree pequeños lotes de tinción de anticuerpos. Prueba hasta cinco marcadores en un cóctel.
    NOTA: La prueba de anticuerpos ya conjugados y analizados mediante inmunohistoquímica en lotes facilita la identificación temprana de interferencias de canal y brinda la oportunidad de reconjugar los anticuerpos con otro metal. También proporciona una oportunidad para evaluar la coexpresión adecuada del marcador.
  2. Manche cada lote pequeño con cuatro concentraciones diferentes de anticuerpos (0,05 μg/ml, 0,2 μg/ml, 1 μg/ml y 4,0 μg/ml).
    NOTA: Comparando diferentes títulos, identifique la concentración de anticuerpos que da como resultado la ubicación correcta y la expresión más alta con una tinción de fondo mínima (mejor relación señal-ruido).

3. Sección de tejido FFPE

  1. Seleccione portaobjetos recubiertos de oro (específicos para este propósito) y manténgalos cerca del micrótomo. Prepare el microtomo insertando una nueva cuchilla en el soporte. Ajuste el grosor de la sección a 4-5 μm.
  2. Coloque los bloques FFPE en hielo antes de seccionar. Preparar un baño de flotación de tejidos calentando agua destilada o agua desionizada (diH2O) a 40-45 °C.
    NOTA: El uso dediH2Oo agua destilada reduce la posibilidad de contaminación.
  3. Comience a seccionar. Coloque la sección de tejido en el agua con pinzas y deje que se aplana. Use los portaobjetos para eliminar secciones de tejido del agua.
  4. Coloque los portaobjetos en una rejilla deslizante y déjelos secar a temperatura ambiente durante la noche.

4. Tinción de anticuerpos FFPE

NOTA: El proceso de tinción se lleva a cabo en dos días separados.

PRECAUCIÓN: Las soluciones empleadas en este protocolo son potencialmente corrosivas y representan peligros para la piel y los ojos. Se recomienda usar guantes, una bata de laboratorio y equipo protector para los ojos y la cara y parte de la política de bioseguridad de nuestra institución.

  1. Preparación del reactivo (día 1)
    1. Diluir 50 ml de solución salina tamponada con Tris 20x con Tween (TBS-T) en 950 ml dediH2Opara producir 1 L de TBS-T.
    2. Diluir 8 ml de ácido tris-etilendiaminotetraacético (EDTA) 10x en 72 ml dediH2Opara hacer una solución de recuperación de epítopos inducida por calor (HIER) 1x.
    3. Diluir el suero de burro en 1x TBS-T a una concentración final del 5% para hacer tampón de bloqueo. Conservar la solución a 4 °C hasta que esté lista para su uso.
  2. Preparación HIER: Módulo de pretratamiento (PT)
    PRECAUCIÓN: Use guantes de protección química cuando manipule cualquier reactivo o pieza sumergida en cualquier reactivo utilizado en el módulo PT.
    1. Diluir 140 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) 10x en 1,260 ml dediH2Opara hacer 1.4 L de 1x PBS. Alternativamente, diluir siete tabletas de PBS en 1.4 L de diH2O.
    2. Llene un tanque con 1.4 L de PBS y coloque el recipiente de la cámara de deslizamiento preparado con 100 ml de 1x solución HIER en el tanque.
    3. Precaliente el tanque en un módulo PT a 75 °C.
  3. Eliminación excesiva de parafina
    1. Hornear se desliza a 70 °C en un horno durante al menos 20 min.
      NOTA: Algunos pañuelos o secciones pueden necesitar tiempos de cocción más largos. El tiempo de cocción recomendado para el tejido cerebral o un TMA es de 1 h. Esto se puede extender a 16 h (durante la noche) o según la experiencia de laboratorio.
    2. Coloque las diapositivas horneadas en un portaportaobjetos y realice los siguientes pasos de lavado en una coctelera debajo de una campana extractora. Lave los portaobjetos en la siguiente solución: Xileno 2x para 30 s (sin metal), 100% alcohol 2x para 30 s (sin metal), 95% de alcohol 2x para 30 s (sin metal), 80% de alcohol para 30 s (sin metal), 70% de alcohol para 30 s (sin metal) y diH2O 2x para 30 s (sin metal).
    3. Mantenga los portaobjetos en un recipiente nuevo dediH2Ohasta que estén listos para la recuperación del antígeno.
      NOTA: Los portaobjetos no deben secarse hasta el final del procedimiento.
  4. Recuperación de antígenos
    1. Coloque las guías en una cámara de deslizamiento precalentada que contenga 1x búfer HIER dentro del módulo PT. Coloque la tapa en el tanque. Cierre y cierre la tapa.
    2. Pulse el botón Menú del módulo PT para abrir el menú principal y pulse el botón Ciclo de configuración (hora y temperatura) para crear un programa personalizado.
    3. Ejecute el módulo PT a 97 °C durante 40 min. Después, el módulo PT se enfriará automáticamente a 65 °C.
    4. Retire los portaobjetos del módulo PT una vez que se alcance la temperatura de 65 °C. Mantenga los portaobjetos a temperatura ambiente durante 30 min.
      NOTA: El módulo PT no se abrirá hasta que la temperatura se enfríe a 65 °C. No toque la superficie dorada de los portaobjetos durante este proceso, y siempre use guantes.
  5. Bloqueo de anticuerpos
    1. Ajuste un agitador a 70 rpm.
    2. Lave los portaobjetos sumergiéndolos en 1x TBS-T durante 5 min 2x.
    3. Con un bolígrafo de barrera hidrófoba, dibuje un borde alrededor de la sección de tejido al menos a 1 mm de distancia de los bordes de la corredera y déjelo secar durante 15-30 s.
      NOTA: Tenga cuidado de evitar que el líquido de la pluma toque la sección de tejido para evitar cualquier interferencia de tejido con la tinción. No presione la pluma demasiado fuerte mientras dibuja la barrera para evitar posibles fugas. Para obtener resultados óptimos de tinción y adquisición de imágenes, las secciones de tejido se colocan en el centro de los portaobjetos recubiertos de oro en un marco no mayor de 15 mm x 30 mm para permitir suficiente espacio para dibujar la barrera sin tocar el tejido o los puntos guía colocados en el borde exterior del portaobjetos.
    4. Para eliminar cualquier residuo de pluma, sumerja las diapositivas en TBS-T.
    5. En una cámara de humedad a temperatura ambiente, incubar la sección de tejido con 100-200 μL de tampón de bloqueo durante 20 min. Deje el tejido incubando en el tampón de bloqueo hasta que esté lista una mezcla maestra de anticuerpos.
  6. Preparación del panel de anticuerpos
    NOTA: El volumen final del cóctel del panel de anticuerpos varía de acuerdo con el área de superficie estimada de la sección de tejido. Para cubrir un área de 20 mm x 20 mm, prepare 100-200 μL del cóctel.
    Haga lo siguiente para preparar un cóctel de panel de anticuerpos conjugados con isótopos metálicos:
    1. Confirme el volumen final del cóctel que es igual al volumen del cóctel de anticuerpos agregado al volumen del tampón de bloqueo.
    2. Confirme las especificaciones de todos los anticuerpos, diluciones y/o concentraciones de anticuerpos en una hoja de cálculo de panel para el proyecto.
    3. Haga girar todos los tubos que contienen anticuerpos a 10,000 x g durante 5 min. Agregue anticuerpos individuales al tampón de bloqueo y mezcle muy bien. No altere la parte inferior del tubo de anticuerpos al pipetearlo.
    4. Filtrar el panel de anticuerpos humedeciendo previamente un dispositivo de filtro centrífugo de 0,1 μm con 100 μL de tampón de bloqueo. Gire el filtro a 10.000 x g durante 2 minutos y retire el flujo del búfer de bloqueo con una pipeta.
    5. Transfiera el panel de anticuerpos a una columna de centrifugado y gire el filtro a 10.000 x g durante 2 min. Deseche la columna de centrifugado y utilice el flujo como panel de anticuerpos filtrados.
      NOTA: Realice la tinción inmediatamente después de hacer el cóctel para evitar el intercambio de metales. Si se necesita almacenar el cóctel de anticuerpos durante un tiempo prolongado, puede someterse a liofilización.
  7. Tinción de anticuerpos
    1. Retire con cuidado el búfer de bloqueo de las diapositivas inclinando cada diapositiva de lado y golpeando suavemente los bordes contra un limpiaparabrisas de tareas.
    2. Coloque los portaobjetos en una cámara de humedad y agregue 100-200 μL de mezcla maestra de anticuerpos al tejido (evite el contacto con el tejido y la creación de burbujas de aire).
    3. Agregue portaobjetos de control positivo y negativo al lote de tinción.
    4. Incubar los toboganes a 4 °C durante la noche (14-16 h).
  8. Preparación del reactivo (día 2)
    1. Diluir 100 ml de 10x PBS bajo en bario, pH 7.4, en 900 mL dediH2Opara hacer 1x PBS.
    2. Preparar 350 ml de una solución material de trabajo de glutaraldehído al 2% en PBS bajo en bario (340 ml de PBS bajo en bario + 10 ml de glutaraldehído al 70%).
      NOTA: Realice la dilución bajo una campana. El glutaraldehído es un líquido muy viscoso. Use una pipeta de 1 ml y agregue 1 ml de PBS bajo en bario al tubo de glutaraldehído cada vez hasta que se vuelva lo suficientemente líquido como para salir del tubo.
    3. Diluir 10x Tris, pH 8.5, en 900 mL de diH20 para hacer 1x Tris.
  9. Fijación y deshidratación
    1. Retire la mezcla maestra de anticuerpos de cada portaobjetos inclinando la corredera de lado y golpeando suavemente el borde contra un limpiaparabrisas de tareas.
    2. Lave las diapositivas con agitación ligera a moderada en los siguientes tampones: 1x TBS-T, 3 veces durante 5 minutos cada una (sin metal); glutaraldehído filtrado al 2% durante 5 min; filtrado 1x tris, pH 8.5, 3x durante 30 s; diH2O 2x filtrado durante 30 s; 70% de alcohol durante 30 s (sin metal); 80% de alcohol durante 30 s (sin metal); 95% de alcohol durante 30 s (sin metal); y 100% alcohol durante 30 s (sin metal).
    3. Golpee suavemente el borde de cada portaobjetos contra un limpiaparabrisas de tareas para eliminar el exceso de alcohol y permitir que el alcohol residual se evapore a temperatura ambiente (~ 5-10 min).
    4. Seque los portaobjetos en un desecador durante al menos 1 hora antes de la adquisición de la imagen o mantenga los portaobjetos en una cámara de vacío para su almacenamiento a largo plazo.

5. Adquisición de imágenes

  1. Configuración de diapositivas
    NOTA: Antes de escanear con el instrumento, las diapositivas deben definirse y configurarse utilizando la aplicación de administración de imágenes basada en web siguiendo los pasos que se describen a continuación.
    1. En la página de diapositivas de la aplicación de administración de imágenes basada en web, haga clic en Adhesión a nueva diapositiva e introduzca los detalles deseados (nombre, identificación de diapositiva, ubicación y descripción).
    2. Cree secciones de escaneo haciendo clic en Agregar sección. Complete la información de cada sección (nombre del proyecto, nombre de la diapositiva, bloque y posición). Para guardar las nuevas diapositivas o secciones creadas, haga clic en Enviar.
    3. En la pestaña de recursos, abra la página de paneles y seleccione el panel que se utilizará. Para paneles nuevos, haga clic en Crear nuevo panel.
    4. Después de seleccionar el panel, haga clic en Secciones. Agregue las secciones creadas en el paso 2. haciendo clic en Editar asignación de sección. Guarde haciendo clic en Enviar.
  2. Configuración del instrumento
    NOTA: Este instrumento (ver Tabla de materiales) se opera utilizando un programa de software de control específico (ver Tabla de materiales).
    1. Inicie sesión en el software de control. Haga clic en Despertar si el instrumento está en modo de suspensión.
      NOTA: Al menos 1 h antes de la operación, se recomienda calentar el instrumento, lo que ayuda con la estabilización del enfoque del haz.
    2. Para cargar una diapositiva, haga clic en Ejemplo de Exchange y, a continuación, haga clic en Continuar para abrir la puerta. Coloque la diapositiva en la ranura de carga con la muestra hacia arriba y la etiqueta a la derecha. Haga clic en Continuar para cerrar la puerta.
      NOTA: Si la diapositiva no se carga correctamente, aparecerá un sonido de advertencia y una notificación para ajustar la diapositiva.
    3. Seleccione el proyecto y, a continuación, seleccione el nombre de diapositiva para la muestra cargada.
    4. Visualice la imagen panorámica en el panel de imagen óptica de diapositiva.
  3. Selección y adquisición del campo de visión (FOV)
    1. Haga clic en el menú Modo y seleccione SED (Detector de electrones secundario). Haga clic en el menú de modo de imagen y seleccione QC −300 μm.
    2. Haga clic en Jog Stage para controlar la ubicación del campo de visión y luego haga clic en las flechas para navegar y seleccionar la posición del FOV.
    3. Haga clic en Agregar FOV, establezca 400 μm x 400 μm como tamaño de campo y seleccione fino como modo de imagen y 1 ms de tiempo de permanencia. Haga clic en Confirmar.
      NOTA: El tiempo de permanencia establecido dependerá de la resolución deseada. El tiempo de permanencia aumenta a medida que aumenta la resolución. El tiempo de adquisición puede variar dependiendo de múltiples factores, incluido el período de rodaje del detector y la duración de la operación. Nuestro tiempo medio de adquisición para un campo de visión es de aproximadamente 17 minutos. Utilice el instrumento sin parar durante un máximo de 8 h, lo que permite escanear aproximadamente 28 FOG. La calidad de las imágenes adquiridas disminuye después de muchas horas consecutivas de uso.
    4. Después de crear una lista de campo de visión, proceda al enfoque de la imagen y ajuste el estigma moviendo el haz a una región de tejido que no se visualizará. Ajuste los parámetros hasta obtener una imagen central clara.
      NOTA: Para optimizar la adquisición de imágenes, lo ideal es mantener la sección de tejido centralizada en el portaobjetos. Al enfocar, se puede obtener una imagen clara de solo el área central. Si la sección de tejido es demasiado grande, los bordes estarán desenfocados y la imagen se verá borrosa.
    5. Haga clic en Iniciar ejecución. Las imágenes adquiridas se cargarán y almacenarán automáticamente en la aplicación de gestión de imágenes basada en la web.

6. Preparación de la imagen

  1. Corrección isobárica de imagen
    NOTA: El propósito de la corrección isobárica es eliminar la señal de derrame entre canales resultante de la presencia de isótopos de masa igual o muy similar cuyas diferencias de masa no pueden detectarse utilizando el analizador de masas.
    1. En la aplicación de gestión de imágenes basada en la web, haga clic en el icono verde Descargar para guardar los FOV (imágenes TIFF).
    2. Descargue la versión más actualizada del software de procesamiento de imágenes (consulte la Tabla de materiales) disponible en la pestaña Acerca de en la aplicación de administración de imágenes basada en web y guárdela en un archivo. Abra el archivo de almacenamiento .zip y siga los pasos de instalación. Abra el software una vez completada la instalación.
    3. Seleccione la carpeta que contiene las imágenes a corregir haciendo clic en el icono Archivo en el panel de entrada del software de procesamiento de imágenes. Se cargará una lista FOV.
    4. Haga clic en el icono Filtro en el panel de entrada para aplicar las correcciones predeterminadas. Para cada canal, visualice las imágenes obtenidas antes y después de la corrección en el lado derecho de la pantalla.
    5. Haga clic en el icono Disquete del panel de salida para guardar la imagen corregida.
  2. Filtrado de imágenes: teselación Voronoi
    NOTA: Los diagramas de teselación de Voronoi ilustran una partición del espacio que contiene puntos semilla en celdas de Voronoi. El objetivo es estimar la densidad celular y definir los límites celulares. Usando el cálculo de teselación de Voronoi, se genera una máscara y se aplica a la imagen original para filtrar.
    1. Haga clic en la pestaña Filtrado y seleccione Voronoi Tesselation en el menú de parámetros de filtrado.
    2. En el panel de entrada, seleccione la imagen MassCorrected.tiff. Haga clic en el icono Filtro en el panel de entrada.
    3. Haga clic en el icono Disquete del panel de salida para guardar la imagen filtrada. Los dos archivos resultantes tendrán los sufijos -Filtered.tiff y -Filtered.json.
      NOTA: La imagen denominada MassCorrected-Filtered.tiff se puede cargar en un programa de software de análisis digital de terceros o en un programa de software de código abierto.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Se obtuvieron secciones de tejido TMA de adenofégdalas y pulmón (5 mm de espesor) y se colocaron en el centro de portaobjetos recubiertos de oro siguiendo las especificaciones con respecto al tamaño del tejido y los márgenes seguros de los portaobjetos. Los márgenes de vidrio libre de 5 mm y 10 mm entre el borde del tejido y los bordes lateral e inferior de los portaobjetos de vidrio, respectivamente, son necesarios para una tinción óptima. Las secciones de tejido se hornearon durante la noche en un horno antes de la tin...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La elucidación exhaustiva de las complejas e intrincadas interacciones entre los múltiples componentes de un TME sigue siendo un objetivo fundamental de la investigación del cáncer. Los fabricantes han introducido numerosos ensayos multiplexados como parte de este esfuerzo, especialmente en los últimos 5 años. El análisis espacial multiplexado es una herramienta versátil y poderosa que facilita la categorización simultánea de varios objetivos al tiempo que preserva la morfología estructural en muestras tumorales. Las téc...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen conflictos que revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores agradecen a Don Norwood de Editing Services, Research Medical Library del MD Anderson por editar este artículo y al Multiplex Immunofluorescence and Image Analysis Laboratory del Department of Translational Molecular Pathology del MD Anderson. Esta publicación resultó en parte de la investigación facilitada por el apoyo científico y financiero para los Centros de Análisis y Monitoreo Inmunológico del Cáncer-Red de Datos Inmunológicos del Cáncer (CIMAC-CIDC) proporcionado a través del Acuerdo de Cooperación del Instituto Nacional del Cáncer (NCI) (U24CA224285) al Centro de Análisis y Monitoreo Inmunológico del Cáncer (CIMAC) del MD Anderson Cancer Center de la Universidad de Texas.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
100% Reactivo AlcoholSigma-AldrichR8382
95% Reactivo AlcoholSigma-AldrichR3404
80% Reactivo AlcoholSigma-AldrichR3279
70% Reactivo AlcoholSigma-AldrichR315
20X TBS-TIonpath567005
10X bajo en bario PBS pH 7.4Ionpath
10X Tris pH 8.5 Ionpath567003
4° C RefrigeradorThermoScientificREVCO
Puntas de pipeta con barrera contra aerosoles P10Olympus24-401
Puntas de pipeta con barrera contra aerosoles P20Olympus24-404
Puntas de pipeta con barrera contra aerosoles P200Olympus24-412
Puntas de pipeta con barrera contra aerosoles P1000Olympus24-430
Filtro centrífugo Ultrafree-MCFisher ScientificUFC30VV00
Ionpath de H2O desionizado567002
suero de burroSigma-AldrichD9663
EasyDip Frasco de tinción de portaobjetos, verdeMicroscopía electrónica Sciences71385-G
EasyDip Tarro de tinción de portaobjetos, amarilloCiencias de la Microscopía Electrónica71385-Y
EasyDip Kit de tinción de portaobjetos (tarro + rejilla), blancoMicroscopía electrónica Ciencias71388-01
EasyDip Soporte de acero inoxidableMicroscopía electrónica Ciencias71388-50
Glutaraldehído 70% Grado EMMicroscopía electrónica Sciences16360
Tampón de recuperación de epítopos inducido por calor (HIER): 10X Tris con EDTA, pH 9DakoS2367
Portaobjetos resistente al calor cámaraMicroscopía electrónica Sciences62705-01
Bolígrafo de barrera hidrofóbicaFisher50-550-221
Software MIBI/OIonpathNA
MIBIsoftware de controlIonpathNA
MIBIslideIonpath567001
MIBIscopeIonpathNA
MicrocentrífugaEppendorf5415D
MicrotomoLeicaRM2135
Cámara de humedad (cámara húmeda)SimportM922-1
Tabletas de solución salina tamponada con fosfato (PBS)Módulo Fisher ScientificBP2944100
PTThermo ScientificA80400012
Unidades de filtro desechables estériles de flujo rápidoFisher Scientific097403A
ShakerBioRockerS2025
Columna de centrifugado (Filtro de centrifugado Ultrafree-MC, 0,5 ml 0,1 mm; m )MillQUFC30VV00
Horno deslizanteFisher Scientific6901
Desecador de gabinete de vacíoVWR30621-076
Látigo de trabajoKimberly Clark34155
XilenoSigma-Aldrich534056-4L
567004

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Laplane, L., Duluc, D., Bikfalvi, A., Larmonier, N., Pradeu, T. Beyond the tumour microenvironment. International Journal of Cancer. 145 (10), 2611-2618 (2019).
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