Análisis de disfunción contráctil cardíaca y transitorios de Ca2+ en miocitos de roedores

Summary

Se presenta un conjunto de protocolos que describen la medición de la función contráctil a través de la detección de la longitud del sarcómero junto con la medición transitoria de calcio (Ca²⁺) en miocitos aislados de rata. También se incluye la aplicación de este enfoque para estudios en modelos animales de insuficiencia cardíaca.

Abstract

La disfunción contráctil y los transitorios de Ca²⁺ a menudo se analizan a nivel celular como parte de una evaluación integral de la lesión y / o remodelación inducida por el corazón. Un enfoque para evaluar estas alteraciones funcionales utiliza el acortamiento descargado y los análisis transitorios de Ca²⁺ en miocitos cardíacos adultos primarios. Para este enfoque, los miocitos adultos se aíslan mediante digestión de colagenasa, se hacen tolerantes al Ca²⁺ y luego se adhieren a cubreobjetos recubiertos de laminina, seguidos de estimulación eléctrica en medios sin suero. El protocolo general utiliza miocitos cardíacos de rata adulta, pero se puede ajustar fácilmente para miocitos primarios de otras especies. Las alteraciones funcionales en los miocitos de los corazones lesionados se pueden comparar con los miocitos simulados y/o con los tratamientos terapéuticos in vitro . La metodología incluye los elementos esenciales necesarios para la estimulación de los miocitos, junto con la cámara celular y los componentes de la plataforma. El protocolo detallado para este enfoque incorpora los pasos para medir el acortamiento descargado mediante la detección de longitud del sarcómero y los transitorios celulares de Ca²⁺ medidos con el indicador ratiométrico Fura-2 AM, así como para el análisis de datos sin procesar.

Introduction

El análisis de la función de la bomba cardíaca a menudo requiere una variedad de enfoques para obtener una visión adecuada, especialmente para modelos animales de insuficiencia cardíaca (IC). La ecocardiografía o las mediciones hemodinámicas proporcionan información sobre la disfunción cardíaca in vivo ¹, mientras que los enfoques in vitro a menudo se emplean para identificar si la disfunción surge de cambios en el miofilamento y / o el transitorio Ca²⁺ responsable de acoplar la excitación, o el potencial de acción, con la función contráctil (por ejemplo, acoplamiento excitación-contracción [E-C]). Los enfoques in vitro también brindan la oportunidad de detectar la respuesta funcional a las neurohormonas, las alteraciones genéticas inducidas por vectores, así como los posibles agentes terapéuticos² antes de seguir estrategias de tratamiento in vivo costosas y / o laboriosas.

Existen varios enfoques para investigar la función contráctil in vitro, incluyendo mediciones de fuerza en trabéculas^{intactas 3} o miocitos permeabilizados⁴, así como acortamiento descargado y transitorios de Ca²⁺ en miocitos intactos en presencia y ausencia de HF ^5,6. Cada uno de estos abordajes se centra en la función contráctil de los miocitos cardíacos, que es directamente responsable de la función de la bomba cardíaca ^2,7. Sin embargo, el análisis de la contracción y el acoplamiento E-C se realiza con mayor frecuencia midiendo el acortamiento de la longitud muscular y los transitorios de Ca 2+ en miocitos adultos aislados tolerantes a Ca²⁺. El laboratorio utiliza un protocolo detallado publicado para aislar miocitos de corazones de ratas para este paso⁸.

Tanto el transitorio Ca²⁺ como los miofilamentos contribuyen al acortamiento y re-alargamiento en los miocitos intactos y pueden contribuir a la disfunción contráctil ^2,7. Por lo tanto, este enfoque se recomienda cuando el análisis funcional in vitro requiere un miocito intacto que contenga la maquinaria ciclista Ca²⁺ más los miofilamentos. Por ejemplo, los miocitos aislados intactos son deseables para estudiar la función contráctil después de modificar la función cíclica del miofilamento o Ca²⁺ a través de la transferencia de genes⁹. Además, se sugiere un enfoque de miocitos intactos para analizar el impacto funcional de las neurohormonas cuando se estudia el impacto de las vías de señalización del segundo mensajero aguas abajo y / o la respuesta a los agentes terapéuticos². Una medición alternativa de la fuerza dependiente de la carga en miocitos individuales se realiza con mayor frecuencia después de la permeabilización de la membrana (o despellejamiento) a bajas temperaturas (≤15 ° C) para eliminar la contribución transitoria de Ca²⁺ y centrarse en la función del miofilamento¹⁰. La medición de la fuerza dependiente de la carga más los transitorios de Ca²⁺ en miocitos intactos es rara debido en gran parte al desafío complejo y técnico del enfoque¹¹, especialmente cuando se necesita un mayor rendimiento, como para medir las respuestas a la señalización de neurohormonas o como pantalla para agentes terapéuticos. El análisis de las trabéculas cardíacas supera estos desafíos técnicos, pero también puede estar influenciado por no miocitos, fibrosis y/o remodelación de la matriz extracelular². Cada uno de los enfoques descritos anteriormente requiere una preparación que contenga miocitos adultos porque los miocitos neonatales y los miocitos derivados de células madre pluripotentes inducibles (iPSC) aún no expresan el complemento completo de proteínas de miofilamentos adultos y generalmente carecen del nivel de organización de miofilamentos presente en el^{miocito 2} en forma de bastón adulto. Hasta la fecha, la evidencia en iPSCs indica que la transición completa a isoformas adultas excede más de 134 días en cultivo¹².

Dado el enfoque de esta colección en la IC, los protocolos incluyen enfoques y análisis para diferenciar la función contráctil en miocitos intactos fallidos versus no defectuosos. Se proporcionan ejemplos representativos de miocitos de rata estudiados 18-20 semanas después de una coartación suprarrenal, descrita anteriormente ^5,13. Luego se hacen comparaciones con miocitos de ratas tratadas con simulacro.

El protocolo y la plataforma de imágenes descritos aquí se utilizan para analizar y monitorear los cambios en el acortamiento y los transitorios de Ca²⁺ en los miocitos cardíacos en forma de bastón durante el desarrollo de IC. Para este análisis, 2 x 10⁴ Ca 2+-tolerantes, miocitos en forma de bastoncillos se colocan en cubreobjetos de vidrio recubiertos de laminina (CS) de²² mm² y se cultivan durante la noche, como se describió anteriormente⁸. Los componentes ensamblados para esta plataforma de imágenes, junto con los medios y búferes utilizados para una imagen óptima, se proporcionan en la Tabla de materiales. Aquí también se proporciona una guía para el análisis de datos utilizando un software y los resultados representativos. El protocolo general se divide en subsecciones separadas, con las tres primeras secciones centradas en miocitos de rata aislados y análisis de datos, seguidas de experimentos transitorios celulares de Ca²⁺ y análisis de datos en miocitos.

Protocol

Los estudios realizados en roedores siguieron la Política del Servicio de Salud Pública sobre el Cuidado Humanitario y el Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Michigan. Para este estudio, se aislaron miocitos de ratas Sprague-Dawley y F344BN de 3-34 meses de edad con un peso ≥ de 200 g⁵. Se utilizaron tasas masculinas y femeninas.

1. Estimulación de miocitos para estudios de función contráctil

1. Haga medios frescos basados en M199 para cada conjunto de miocitos aislados (Tabla de materiales). 1 día antes de la estimulación, placa 2 x 10⁴ Miocitos tolerantes a Ca 2+, en forma de bastoncillos en cubredos de vidrio (CS) recubiertos de laminina de²² mm² , como se describió anteriormente⁸.
2. Para preparar las cámaras, remoje cada cámara en lejía al 10% durante 1 h. Luego, enjuague las cámaras con agua corriente del grifo durante 30-45 minutos, seguido de agua destilada reemplazada cada 5 minutos durante 30 minutos, seguida de agua desionizada reemplazada cada 5 minutos durante 30 minutos, y un enjuague final en agua desionizada.
3. Seque las cámaras sobre una superficie limpia durante 20-30 min (Figura suplementaria 1A-C). A continuación, trate las cámaras UV en un gabinete de bioseguridad durante 5 minutos en cada dirección (total = 20 min). Este paso no es necesario para cámaras preesterilizadas.
   PRECAUCIÓN: Abandone el área para minimizar la exposición a los rayos UV.
4. Retire la cubierta de la cámara, agregue 3 ml de medios a base de M199 (consulte la Tabla de materiales) a cada pocillo (Figura suplementaria 1B), reemplace la cubierta y precaliente la cámara en una incubadora a 37 °C con 5% de CO2 y 20% de_O2.
5. Esterilizar las pinzas en un esterilizador de perlas calientes a 250 °C durante 20-25 s. Transfiera la cámara de estimulación precalentada de la incubadora a un gabinete de bioseguridad.
6. Transfiera cada cubreobjetos (CS) que contiene miocitos cardíacos a pocillos individuales en la cámara de estimulación utilizando fórceps estériles. Transfiera los CS de cuatro en cuatro, seguidos de calentamiento durante 10 minutos antes de la transferencia de los cuatro CS restantes para mantener la temperatura del medio.
7. Conecte los gatos de plátano a la cámara de estimulación en un extremo (Figura suplementaria 1C) y al estimulador en el otro extremo (Figura suplementaria 1D).
8. Ajuste la frecuencia del estimulador a 0.2 Hz y ajuste el voltaje (~ 12 V) para lograr la contracción en ~ 10% -20% de todos los miocitos cardíacos en forma de bastón dentro de un pozo. Para determinar el número de miocitos que se contraen, coloque la cámara bajo un microscopio invertido con un aumento de 4x a 10x.
9. Colocar la cámara de estimulación en una incubadora a 37 °C en_CO2 al 5% (Figura suplementaria 1E). Cambiar los medios cada 12 h utilizando medios precalentados en una incubadora de_CO2 al 5% a 37 °C durante 20-25 min. Continúe la estimulación eléctrica durante un máximo de 3 días con el medio cambiado cada 12 h.

2. Análisis de la función contráctil de miocitos cardíacos de ratas adultas

1. Precaliente un paquete de gel y un medio en una incubadora a 37 °C durante 30 minutos antes del experimento.
2. Encienda los componentes de la plataforma de función contráctil enumerados en la Tabla de materiales y que se muestran en la Figura suplementaria 2, con especial atención a los componentes clave, que incluyen una tabla antivibración (Figura suplementaria 2A-1) con un microscopio invertido con un filtro rojo intenso (590 nm) (Figura suplementaria 2A-2,3) y una cámara CCD (Figura suplementaria 2A-4) conectada a un controlador CCD (Figura complementaria 2A-5 y Figura suplementaria 2C-5) e integrado con una computadora PC (Figura suplementaria 2B-14).
3. Montar el tubo en la bomba peristáltica (Figura suplementaria 2A-8; Figura suplementaria 2A-8), transfiera el paquete de gel precalentado al soporte del tubo (Figura suplementaria 2A-9) y encienda el vacío (Figura suplementaria 2A-11) y encienda el estimulador celular (Figura suplementaria 2B-13).
4. Coloque un tubo de 50 ml con medios en el soporte del tubo aislado (Figura suplementaria 2A-9) y comience la perfusión a ~0.5 ml / min a través del tubo de la bomba peristáltica (Figura suplementaria 2E-8).
5. Agregue una pequeña cantidad de medios precalentados a un bote de pesaje pequeño (~ 2 ml). Transfiera un CS que contenga miocitos de la cámara de estimulación al barco de pesaje. Devolver la cámara de estimulación a 37 °C en la incubadora de_CO2 al 5%.
6. Retire el CS del bote de pesaje y limpie suavemente la parte inferior. Transfiera el CS a una cámara CS recién engrasada (Figura suplementaria 2A, F-10; flecha negra) y agregue suavemente una gota de medio (~ 200 μL) al CS.
7. Coloque un soporte de electrodo de platino sobre el CS (Figura suplementaria 2F; flecha gris) y coloque un nuevo CS sobre la parte superior usando pinzas. Coloque un soporte superior (Figura suplementaria 2F; flecha blanca) sobre el sándwich CS y luego instale dos o cuatro tornillos de cabeza de bandeja #0 para terminar de ensamblar la cámara.
8. Una vez que el medio esté presente en todo el tubo de la bomba, conecte el tubo al precalentador y luego conecte el precalentador a la cámara CS ensamblada en el paso 2.7. Comience la perfusión a 0,5 ml/min y coloque una toallita de pañuelos debajo de la cámara para asegurarse de que no haya fugas.
9. Coloque la cámara CS en el adaptador de escenario. Los medios perfundidos se recogen en el extremo opuesto de la cámara con tubos conectados a un sistema de vacío. Encienda el sistema de calefacción (Figura suplementaria 2A, D-7) y equilibre la cámara, el objetivo y el precalentador durante ~ 5-10 min para lograr una temperatura constante del medio de 37 ° C. Visualice los miocitos con el objetivo de inmersión en agua 40x en el microscopio durante este tiempo de equilibrio.
10. Active el estimulador de estimulación (Figura suplementaria 2B-13) ajustando el voltaje a 1.5x el ajuste necesario para que el 80% de las células en forma de varilla se contraigan, que generalmente es de 35-40 V. Establezca la frecuencia de estimulación en 0.2 Hz para optimizar la función contráctil y la supervivencia de los miocitos.
11. Recolectar trazas de acortamiento y realargamiento contráctil de miocitos perfundidos y con ritmo continuo. Para recopilar mediciones de acortamiento, utilice una cámara CCD (Figura suplementaria 2A-4) conectada a un controlador CCD (Figura suplementaria 2B-5,C) y una computadora dedicada con una placa controladora de E/S (Figura suplementaria 2B-14; consulte la Tabla de materiales). La plataforma mide el acortamiento del sarcómero en miocitos de rata, aunque se obtienen resultados similares a partir de mediciones de miocitos recogidas de los bordes longitudinales de los miocitos (ver Ecklerle et ^al.14).
12. Para recopilar rastros de acortamiento de sarcómero, abra el software en el equipo, seleccione Aceptar y, a continuación, Archivo > Nuevo. Prepare una plantilla de pantalla seleccionando Trazas > Editar límites de usuario > longitud del sarcómero y, a continuación, establezca valores máximos y mínimos, que suelen estar entre 2,0 μm y 1,5 μm. Calibrar la cámara CCD con una retícula de 0,01 mm antes de realizar mediciones en los miocitos (Figura 1D).
13. Para registrar las trazas de longitud del sarcómero, seleccione Archivo > Nuevo. Identifique un miocito que se contrae y colóquelo a lo largo del eje longitudinal de la cámara de modo que el patrón de estriación sea vertical (Figura 1B).
14. Use el mouse de la computadora para colocar el cuadro de región de interés (ROI) (cuadro rosa) sobre el miocito (Figura 1C). Seleccione Recopilar y comenzar para registrar la función contráctil. Registrar el acortamiento durante 60 s de cada miocito a bajas frecuencias de estimulación (≤0,5 Hz).
15. Registre el acortamiento del sarcómero de 5 a 10 células por CS. Realice mediciones a 1 célula/CS si los estudios incluyen tratamiento con agonistas/antagonistas. Prepare un medio precalentado separado y una pieza diferente y dedicada de tubo de perfusión cargada en una bomba peristáltica multicanal y siga los pasos 2.9.-2.14. Medir el impacto de la administración de fármacos o neurohormonas sobre la función contráctil de los miocitos.
16. Para medir el acortamiento en un rango de frecuencias, mantenga el ritmo de los miocitos en cada frecuencia para obtener un acortamiento en estado estacionario antes de registrar⁵. Para estos estudios, duplique la tasa de perfusión y comience a registrar 15-20 s después de la estimulación a una nueva frecuencia para obtener respuestas contráctiles consistentes en estado estacionario para frecuencias en el rango de 0.2 Hz y 2 Hz. Por lo general, registre no más de 2 miocitos / CS para acortar en el rango dado de frecuencias de estimulación.
17. Registre al menos 7 contracciones/celda para obtener datos confiables promediados de señal al analizar las grabaciones (consulte el paso 3).

3. Análisis de datos de función contráctil en miocitos aislados

1. Para comenzar, seleccione Archivo, elija un seguimiento grabado y, a continuación, seleccione Abrir. Seleccione la pestaña 1 (lado izquierdo) de la traza base y, a continuación, establezca el panel amarillo en la parte superior de la traza en Sarc-Length. Seleccione Trazas y la plantilla de pantalla preparada en el paso 2.12.
2. Para preparar una plantilla de análisis, seleccione Operaciones, Opciones de análisis transitorio monotónico, Marca de evento TTL en el cuadro Definición de t0, así como las siguientes opciones del menú: Línea base (longitud del sarcómero en reposo), Velocidad de salida relativa a t0 (dep v), Pico (altura máxima y %altura pico/línea de base o bl%pico h), Velocidad de retorno relativa a tPeak (ret v), Tiempo hasta el pico 50% (TTP 50%) usando t0, y Tiempo hasta la línea de base 50% (TTR_50%) usando tPeak. Guarde estas opciones de análisis seleccionando Plantillas > Guardar plantilla de análisis con un identificador. Cargue esta plantilla de análisis antes de analizar cada seguimiento.
3. Para comenzar el análisis de datos, seleccione Marcas > puerta > Agregar > transitorio Convertir de marca de evento > Rango de análisis. Ahora establezca el rango de tiempo de -0.01 s a 1.20 s para los miocitos con ritmo de 0.2 Hz (Figura 2A, marcas rojas en la parte inferior de la traza cruda). Seleccione un rango de tiempo más corto para los miocitos estimulados a frecuencias más altas.
4. Genere un seguimiento promediado de señal seleccionando Operaciones > Eventos promedio. Aparece una grabación promediada por señal debajo de la traza base original.
5. Seleccione la pestaña 1 del seguimiento promediado de la señal (lado izquierdo de la pantalla) y, a continuación, seleccione Marcas en el menú superior, seguido de Agregar transitorio. Seleccione Operaciones en el menú superior y Análisis de transitorios monotónicos para mostrar los valores promediados de señal para la longitud del sarcómero de referencia, la altura del pico, bl%pico h, dep v, ret v, TTP 50% y TTR_50% en el panel de visualización promediado de señal.
6. Transfiera cada análisis transitorio de sarcómero a una hoja de cálculo para el análisis compuesto de múltiples miocitos seleccionando Exportar > análisis transitorio monotónico > Corriente del portapapeles. Pegue estos datos en la hoja de cálculo para cada seguimiento.
7. Para copiar el seguimiento promediado de señal, seleccione Exportar > Seguimiento actual > Opciones de > del portapapeles y establezca los decimales en 5, luego seleccione Delimitador de pestañas y haga clic en Aceptar y Aceptar. Pegue las trazas promediadas por señal para cada registro de miocitos en una segunda hoja de cálculo.

4. Registro de transitorios de Ca²⁺ en miocitos cardíacos adultos de rata

1. Antes de medir los transitorios de Ca 2+, encienda los componentes de la plataforma descritos en el paso 2.2., junto con los componentes adicionales de imágenes de fluorescencia (consulte los componentes adicionales para el análisis de imágenes de Ca²⁺ en la Tabla de materiales; Figura complementaria 2A-5,6; 2B-12).
2. Preparar la solución madre de Fura-2AM que contenga 1 mM de Fura-2AM más 0,5 M de probenecid en dimetilsulfóxido (DMSO). Probenecid minimiza la fuga de Fura-2AM¹⁵.
3. Diluir la solución madre a 5 μM de Fura-2AM y 2,5 mM de probenecid en 2,5 ml de medio (ver Tabla de materiales) en un pocillo de una placa de 6 pocillos. Agregue 2.5 ml de medios solos (sin Fura-2AM) a tres pocillos adicionales en la placa, cubra la placa con papel de aluminio y precaliente el medio a 37 ° C.
4. Transfiera un CS que contenga miocitos de la cámara de estimulación al pocillo que contiene Fura-2AM, cubra y devuelva la placa a la incubadora de 37 °C con 5% de_CO2 durante 4 min. Monte el tubo en la bomba de perfusión y perfunda con medios durante el período de carga Fura-2AM, como se describe en el paso 2.4.
5. Apague o minimice las luces de la habitación para reducir el fotoblanqueo de fluorescencia y optimizar la señal de fluorescencia. Retire la placa de 6 pocillos de la incubadora y luego lave el CS durante 10 s en cada uno de los tres pocillos que contienen medios solos. Transfiera el CS a un bote de pesaje pequeño que contenga medios precalentados (sin Fura-2AM añadido).
6. Monte el CS en la cámara CS recién engrasada después de limpiar suavemente la parte inferior del CS. Agregue suavemente una gota de medio al CS y luego ensamble el soporte del electrodo sobre el CS, seguido de un segundo CS y el soporte superior. Utilice tornillos de cabeza de bandeja #0 para terminar de ensamblar la cámara celular, como se describe en los pasos 2.6.-2.7.
7. Conecte el tubo de la bomba lleno de medios al precalentador, conecte el precalentador a la cámara CS y colóquelo en un adaptador de etapa, como se describe en el paso 2.8. Recoja el medio con el sistema de tubos de vacío y encienda el sistema de calefacción (Figura suplementaria 2A, D-7) para equilibrar la cámara a 37 °C, como se describe en los pasos 2.8.-2.9.
8. Active el estimulador de estimulación (Figura suplementaria 2B-13) ajustado a 35-40 V y 0,2 Hz, como se describe en el paso 2.10.
9. Antes de grabar un transitorio Ca²⁺ , encienda una pequeña linterna o una luz de libro montada cerca del teclado de la computadora para ayudar a ver el teclado. Además, registre el fondo de fluorescencia en un área sin miocitos cardíacos. Para comenzar, seleccione Archivo > Iniciar > nuevo, como se describe en el paso 2.12.
10. Seleccione un ROI y establezca una pestaña (o barra de seguimiento, lado izquierdo) para el numerador sin procesar y una segunda pestaña para el denominador sin procesar, definida en la parte superior central de cada pestaña. Grabe el fondo durante 10-20 s. Haga clic con el botón derecho del ratón y arrastre sobre un panel de barra de seguimiento para obtener los valores de numerador y denominador promediados de señal sin procesar. Introduzca estos valores seleccionando las constantes Operaciones > E introduzca los valores sin procesar.
11. Prepare una nueva plantilla de pantalla para recopilar tanto el acortamiento como los transitorios Ca²⁺ . Para la longitud del sarcómero, seleccione Tab 1 y utilice el mismo proceso que se describe en el paso 2.13. Para imágenes de Ca²⁺ , seleccione Relación > de la pestaña 2 (centro superior de la pestaña) > Seguimientos > Editar límites de usuario para establecer los niveles mínimo y máximo para la proporción, que normalmente se establecen entre 1 y 5. Utilice el mismo proceso para definir los rangos de numerador y denominador para las pestañas 3 y 4 (lado izquierdo).
12. Coloque un cuadro de ROI sobre una imagen de miocitos, como se describe en el paso 2.14. Seleccione Archivo > Nueva > recopilar. Ahora seleccione Iniciar para recopilar datos de acortamiento y ratiométricos Ca²⁺ . Registre ≥7 contracciones / celda para el análisis promediado de señales.
13. Repita la grabación de seguimiento en segundo plano descrita en el paso 4.10. después de registrar 2-4 miocitos. Por lo general, registre 4-5 miocitos / CS o menos miocitos si hay cambios significativos en la lectura de fondo.

5. Análisis de datos de transitorios de Ca²⁺ en miocitos aislados.

1. Abra el archivo deseado para el análisis y seleccione Plantillas > Plantilla de pantalla para acortar más transitorios Ca²⁺ . A continuación, seleccione las pestañas 1 y 2 (izquierda) para mostrar la longitud del sarcómero y la relación Ca²⁺ , respectivamente. Seleccione Operaciones > Constantes e introduzca los valores del numerador y el denominador de la traza de fondo Ca²⁺ .
2. Prepare plantillas de análisis para acortar más datos transitorios de Ca²⁺ . Seleccione la pestaña 1 (lado izquierdo) y utilice el mismo proceso que se describe en el paso 3.2. para establecer la plantilla de análisis de longitud de sarcómero.
3. Seleccione la pestaña 2 (lado izquierdo) y seleccione Operaciones, Opciones de análisis transitorio monotónico, Marca de evento TTL en el cuadro Definición de t0 y las siguientes opciones del menú: Línea de base (relación basal), Velocidad de salida relativa a t0 (dep v), Pico (altura máxima y %altura máxima/línea de base o bl%pico h), Velocidad de decaimiento relativa a tPeak (ret v), Tiempo hasta el pico 50% (TTP 50%) usando t0, y Tiempo hasta la línea de base 50% (TTR_50%) usando tPeak. Guarde estas opciones de análisis seleccionando Plantillas y Guardar plantilla de análisis con un nuevo nombre de identificador. Cargue esta plantilla de análisis antes de analizar cada seguimiento.
4. Utilice el mismo proceso descrito en los pasos 3.3.-3.6. para promediar la señal y luego analizar la longitud del sarcómero, seguido de los mismos pasos para los transitorios de Ca²⁺ . Establezca marcas separadas para la longitud del sarcómero y para la traza de relación transitoria Ca²⁺ .

Results

Los estudios de función contráctil se realizan en miocitos de rata comenzando el día después del aislamiento (día 2) hasta 4 días después del aislamiento. Aunque los miocitos pueden registrarse el día después del aislamiento (es decir, el día 2), a menudo se requieren tiempos de cultivo más largos después de la transferencia de genes o tratamientos para modificar la función contráctil⁸. Para los miocitos cultivados durante más de 18 h después del aislamiento, el protocolo de estimulación descrito ...

Discussion

El protocolo de estimulación crónica descrito en el paso 1 extiende el tiempo útil para estudiar miocitos aislados y evaluar el impacto de tratamientos más largos. En nuestro laboratorio, se obtuvieron resultados consistentes hasta 4 días después del aislamiento al medir la función contráctil utilizando la longitud del sarcómero en miocitos de ritmo crónico. Sin embargo, la función contráctil de los miocitos se deteriora rápidamente cuando se usan medios mayores de 1 semana para marcar el ritmo de los miocitos.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
MEDIA
Albúmina sérica bovina	Sigma (Roche)	3117057001	Concentración final = 0,2% (p/v)
Glutatión	Sigma	G-6529	Concentración final = 10 mM
HEPES	Sigma	H-7006	Concentración final = 15 mM
M199	Sigma	M-2520	1 botella rinde 1 L; pH 7.45
NaHCO3	Sigma	S-8875	Concentración final = 4 mM
Penicilina/estreptomicina	Fisher 15140122		Concentración final = 100 U/mL de penicilina, 100 μ g/mL de estreptomicina
REACTIVOS ESPECÍFICOS PARA Ca2+ IMAGENG
Dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma	D2650
Fura-2AM	Invitrogen (Sondas Moleculares)	F1221	50 μ g/vial;   Preparar solución madre de 1 mM de Fura-2AM + 0,5 M de probenicid en DMSO;   La concentración final de Fura2-AM en los medios es  5 y mu; M
Probenicid	Invitrogen (Fisher)	P36400	Añadir 7,2 mg de probenicid (0,5 M) a 1 mM de caldo de Fura-2AM; La concentración final en el medio es de 2,5 mM
MATERIALES PARA LA ESTIMULACIÓN DE MIOCITOS DE RATA
#1 22  mm2 cubreobjetos de vidrio	Corning	2845-22
Cables de 3 x 36 pulgadas con conectores banana	Pomona Electronics	B-36-2	Figura suplementaria 1, panel C
Incubadora oC  con 95% O2:5% CO2	Formulario	3110	Suplementario Figura 1, panel E. Varios modelos son apropiados
II A/B3 Cabina de bioseguridad con lámpara UV	Forma	1286	Varios modelos son apropiados
Pinzas - Dumont #5 5/45	Fine Science Tools	11251-35
Esterilizador de perlas	calientes Fine Science Tools	1800-45
Microscopio invertido de bajo aumento	Leica	DM-IL	Coloque este microscopio adyacente a la incubadora para monitorear la contracción de los miocitos estimulados al comienzo de la estimulación y después de los cambios de medio. Objetivos 4X y 10X recomendados
Cámara de estimulación	Personalizado		Suplementario Figura 1, panel A. El sistema Ionoptix C-pace es una alternativa disponible en el mercado o consulte 22
Stimulator	Ionoptix	Myopacer	Supplemental Figure 1, panel D.
PARA LA FUNCIÓN CONTRÁCTIL y/o Ca2+ ANÁLISIS			Figura 2 y complementaria Alternativas/Opciones recomendadas Componentes
adicionales para el análisis de imágenes de Ca2+	Ionoptix	Componentes esenciales del sistema: -- Sistema de conteo de fotones                      --  Fuente de alimentación de xenón con fuente de luz de doble excitación                      --  Interfaz de fluorescencia	- El sistema de conteo de fotones contiene un tubo fotomultiplicador (PMT) y un espejo dicroico y se instala junto a la cámara CCD  (panel A #4).                                                                                                                                          - La fuente de alimentación para la fuente de luz de bombilla de xenón (consulte el panel A #5 y el panel C, a la izquierda) está integrada con una interfaz de excitación dual (excitación de 340/380 nm y emisión de 510 nm) que se muestra en el panel A #6.                                                                                                                                                                                                                                                               - La interfaz de fluorescencia entre la computadora y   La fuente de luz se muestra en el panel B, # 12.
Cámara CCD con adquisición de imágenes  hardware y software (240 fotogramas/s)	Ionoptix	Myocam con controlador CCD	Myocam y el controlador CCD se muestran en la Fig. 2 suplementaria, panel A #4  y panel A #5 y panel C #5 (derecha), respectivamente.  El controlador está integrado con un sistema informático PC (panel B #14).
Estimulador de cámara	Ionoptix	Panel B	, #13; Alternativa:  Césped modelo S48
Cámara de perfusión montada en cubreobjetos	Cámara personalizada para cubreobjetos de 22 mm2 con adaptador de silicona y 2-4 tornillos Phillips de cabeza plana #0  (flecha, panel F)		Panel A #10 y panel F;     La temperatura de la cámara se calibra a 37oC utilizando una sonda TH-10Km y el controlador de temperatura TC2BIP (ver controlador de temperatura).  Alternativas comerciales:  Ionoptix FHD o célula C-stim  Cámaras; Sistema de estimulación de cultivo Cell MicroControls
Computadora y software dedicados para la recopilación de datos y el análisis de la función/transitorios de Ca2+	PC Ionoptix	con placa de PC Ionwizard y software	Panel B, # 14; La función contráctil se mide utilizando los módulos de adquisición SarcLen (longitud del sarcómero) o SoftEdge (longitud del miocito) del software IonWizard. El software Ionwizard también incluye software de adquisición PMT para radiométricos  Imágenes 2+ en mioyctos cargados con Fura-2AM. - Se recomienda un gabinete de montaje en rack electrónico de 4 postes y estantes para alojar el somputer y el estimulador celular. La interfaz de fluorescencia para la obtención de imágenes de Ca2+ también se encuentra en este gabinete (ver más abajo).
Pinzas - Dumont #5 TI	Fine Science Tools	11252-40	Panel F
Soporte de tubo aislado para medios	Custom		Panel A #9; Este soporte se ensambla fácilmente con espuma de poliestireno y un paquete de gel precalentado para mantener los medios calientes
Microscopio de campo claro invertido	Nikon	TE-2000S	Instale una torreta giratoria para epifluorescencia (Panel A # 2) para imágenes de Ca2+. También se recomienda un filtro de condensador de color rojo intenso (590 nm) para minimizar el blanqueo de fluorescencia durante las imágenes de Ca2+.
Mesa Aisladora	TMC Control de Vibración	30 x 36 pulgadas	Panel A, #1; Deseable:  estanterías elevadas, blindaje de Faraday
Oculares de microscopio y objetivo	Nikon	10X CFI oculares 40X agua CFI Plan Fluor	objetivo Panel A #3; 40X objetivo:  n.a. 0.08; w.d. 2 mm.  Un calentador de objetivo Cell MicroControls HLS-1 está montado alrededor del objetivo (consulte el controlador de temperatura a continuación).                 NOTA:  Los dispensadores de inmersión en agua también están ahora disponibles para objetivos a base de agua.
Bomba peristáltica	Gilson	Minipuls 3	Panel A #8 y panel E
barco de pesaje pequeño	Fisher	08-732-112
Controlador de temperatura	Cell MicroControls	TC2BIP	Panel A #7; Panel D. Este controlador de temperatura calienta la cámara de cubreobjetos a 37oC.     Se recomienda un precalentador y un calentador de objetivos para esta plataforma. Un precalentador HPRE2 de Cell MicroControls y  El calentador de objetivo HLS-1 está controlado  por el controlador de temperatura TC2BIP para nuestros estudios.
Luz LED debajo del gabinete con sensor de movimiento	Luz LED Sylvania	#72423	Recomendada para la recopilación de datos durante la toma de imágenes transitorias de Ca2+ bajo una luz ambiental mínima.   Alternativa:  Un clip en la linterna / luz de libro con cuello flexible: hay varios proveedores disponibles.
Línea de vacío con matraz Ehrlenmeyer en línea y filtro protector		Fisher Tygon tubing - E363;   matraz de polipropileno Ehrlenmeyer - 10-182-50B; Filtro de vacío - 09-703-90	Panel A #11