Se presenta un conjunto de protocolos que describen la medición de la función contráctil a través de la detección de la longitud del sarcómero junto con la medición transitoria de calcio (Ca2+) en miocitos aislados de rata. También se incluye la aplicación de este enfoque para estudios en modelos animales de insuficiencia cardíaca.
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Artículo de método
Análisis de disfunción contráctil cardíaca y transitorios de Ca2+ en miocitos de roedores
En este artículo
Resumen
Resumen
La disfunción contráctil y los transitorios de Ca2+ a menudo se analizan a nivel celular como parte de una evaluación integral de la lesión y / o remodelación inducida por el corazón. Un enfoque para evaluar estas alteraciones funcionales utiliza el acortamiento descargado y los análisis transitorios de Ca2+ en miocitos cardíacos adultos primarios. Para este enfoque, los miocitos adultos se aíslan mediante digestión de colagenasa, se hacen tolerantes al Ca2+ y luego se adhieren a cubreobjetos recubiertos de laminina, seguidos de estimulación eléctrica en medios sin suero. El protocolo general utiliza miocitos cardíacos de rata adulta, pero se puede ajustar fácilmente para miocitos primarios de otras especies. Las alteraciones funcionales en los miocitos de los corazones lesionados se pueden comparar con los miocitos simulados y/o con los tratamientos terapéuticos in vitro . La metodología incluye los elementos esenciales necesarios para la estimulación de los miocitos, junto con la cámara celular y los componentes de la plataforma. El protocolo detallado para este enfoque incorpora los pasos para medir el acortamiento descargado mediante la detección de longitud del sarcómero y los transitorios celulares de Ca2+ medidos con el indicador ratiométrico Fura-2 AM, así como para el análisis de datos sin procesar.
Introducción
El análisis de la función de la bomba cardíaca a menudo requiere una variedad de enfoques para obtener una visión adecuada, especialmente para modelos animales de insuficiencia cardíaca (IC). La ecocardiografía o las mediciones hemodinámicas proporcionan información sobre la disfunción cardíaca in vivo 1, mientras que los enfoques in vitro a menudo se emplean para identificar si la disfunción surge de cambios en el miofilamento y / o el transitorio Ca2+ responsable de acoplar la excitación, o el potencial de acción, con la función contráctil (por ejemplo, acoplamiento excitación-contracción [E-C]). Los enfoques in <....
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Protocolo
Los estudios realizados en roedores siguieron la Política del Servicio de Salud Pública sobre el Cuidado Humanitario y el Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Michigan. Para este estudio, se aislaron miocitos de ratas Sprague-Dawley y F344BN de 3-34 meses de edad con un peso ≥ de 200 g5. Se utilizaron tasas masculinas y femeninas.
1. Estimulación de miocitos para estudios de función contráctil
- Haga medios frescos basados en M199 para cada conjunto de miocitos aislados (Tabla de materiales
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Resultados
Los estudios de función contráctil se realizan en miocitos de rata comenzando el día después del aislamiento (día 2) hasta 4 días después del aislamiento. Aunque los miocitos pueden registrarse el día después del aislamiento (es decir, el día 2), a menudo se requieren tiempos de cultivo más largos después de la transferencia de genes o tratamientos para modificar la función contráctil8. Para los miocitos cultivados durante más de 18 h después del aislamiento, el protocolo de estimulación descrito .......
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Discusión
El protocolo de estimulación crónica descrito en el paso 1 extiende el tiempo útil para estudiar miocitos aislados y evaluar el impacto de tratamientos más largos. En nuestro laboratorio, se obtuvieron resultados consistentes hasta 4 días después del aislamiento al medir la función contráctil utilizando la longitud del sarcómero en miocitos de ritmo crónico. Sin embargo, la función contráctil de los miocitos se deteriora rápidamente cuando se usan medios mayores de 1 semana para marcar el ritmo de los miocitos.
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Divulgaciones
Los autores no tienen intereses financieros contrapuestos u otros conflictos de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo cuenta con el apoyo de la subvención R01 HL144777 (MVW) de los Institutos Nacionales de Salud (NIH).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| MEDIA | |||
| Albúmina sérica bovina | Sigma (Roche) | 3117057001 | Concentración final = 0,2% (p/v) |
| Glutatión | Sigma | G-6529 | Concentración final = 10 mM |
| HEPES | Sigma | H-7006 | Concentración final = 15 mM |
| M199 | Sigma | M-2520 | 1 botella rinde 1 L; pH 7.45 |
| NaHCO3 | Sigma | S-8875 | Concentración final = 4 mM |
| Penicilina/estreptomicina | Fisher 15140122 | Concentración final = 100 U/mL de penicilina, 100 μ g/mL de estreptomicina | |
| REACTIVOS ESPECÍFICOS PARA Ca2+ IMAGENG | |||
| Dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Fura-2AM | Invitrogen (Sondas Moleculares) | F1221 | 50 μ g/vial; Preparar solución madre de 1 mM de Fura-2AM + 0,5 M de probenicid en DMSO; La concentración final de Fura2-AM en los medios es 5 y mu; M |
| Probenicid | Invitrogen (Fisher) | P36400 | Añadir 7,2 mg de probenicid (0,5 M) a 1 mM de caldo de Fura-2AM; La concentración final en el medio es de 2,5 mM |
| MATERIALES PARA LA ESTIMULACIÓN DE MIOCITOS DE RATA | |||
| #1 22 mm2 cubreobjetos de vidrio | Corning | 2845-22 | |
| Cables de 3 x 36 pulgadas con conectores banana | Pomona Electronics | B-36-2 | Figura suplementaria 1, panel C |
| Incubadora oC con 95% O2:5% CO2 | Formulario | 3110 | Suplementario Figura 1, panel E. Varios modelos son apropiados |
| II A/B3 Cabina de bioseguridad con lámpara UV | Forma | 1286 | Varios modelos son apropiados |
| Pinzas - Dumont #5 5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Esterilizador de perlas | calientes Fine Science Tools | 1800-45 | |
| Microscopio invertido de bajo aumento | Leica | DM-IL | Coloque este microscopio adyacente a la incubadora para monitorear la contracción de los miocitos estimulados al comienzo de la estimulación y después de los cambios de medio. Objetivos 4X y 10X recomendados |
| Cámara de estimulación | Personalizado | Suplementario Figura 1, panel A. El sistema Ionoptix C-pace es una alternativa disponible en el mercado o consulte 22 | |
| Stimulator | Ionoptix | Myopacer | Supplemental Figure 1, panel D. |
| PARA LA FUNCIÓN CONTRÁCTIL y/o Ca2+ ANÁLISIS | Figura 2 y complementaria Alternativas/Opciones recomendadas Componentes | ||
| adicionales para el análisis de imágenes de Ca2+ | Ionoptix | Componentes esenciales del sistema: -- Sistema de conteo de fotones -- Fuente de alimentación de xenón con fuente de luz de doble excitación -- Interfaz de fluorescencia | - El sistema de conteo de fotones contiene un tubo fotomultiplicador (PMT) y un espejo dicroico y se instala junto a la cámara CCD (panel A #4). - La fuente de alimentación para la fuente de luz de bombilla de xenón (consulte el panel A #5 y el panel C, a la izquierda) está integrada con una interfaz de excitación dual (excitación de 340/380 nm y emisión de 510 nm) que se muestra en el panel A #6. - La interfaz de fluorescencia entre la computadora y La fuente de luz se muestra en el panel B, # 12. |
| Cámara CCD con adquisición de imágenes hardware y software (240 fotogramas/s) | Ionoptix | Myocam con controlador CCD | Myocam y el controlador CCD se muestran en la Fig. 2 suplementaria, panel A #4 y panel A #5 y panel C #5 (derecha), respectivamente. El controlador está integrado con un sistema informático PC (panel B #14). |
| Estimulador de cámara | Ionoptix | Panel B | , #13; Alternativa: Césped modelo S48 |
| Cámara de perfusión montada en cubreobjetos | Cámara personalizada para cubreobjetos de 22 mm2 con adaptador de silicona y 2-4 tornillos Phillips de cabeza plana #0 (flecha, panel F) | Panel A #10 y panel F; La temperatura de la cámara se calibra a 37oC utilizando una sonda TH-10Km y el controlador de temperatura TC2BIP (ver controlador de temperatura). Alternativas comerciales: Ionoptix FHD o célula C-stim Cámaras; Sistema de estimulación de cultivo Cell MicroControls | |
| Computadora y software dedicados para la recopilación de datos y el análisis de la función/transitorios de Ca2+ | PC Ionoptix | con placa de PC Ionwizard y software | Panel B, # 14; La función contráctil se mide utilizando los módulos de adquisición SarcLen (longitud del sarcómero) o SoftEdge (longitud del miocito) del software IonWizard. El software Ionwizard también incluye software de adquisición PMT para radiométricos Imágenes 2+ en mioyctos cargados con Fura-2AM. - Se recomienda un gabinete de montaje en rack electrónico de 4 postes y estantes para alojar el somputer y el estimulador celular. La interfaz de fluorescencia para la obtención de imágenes de Ca2+ también se encuentra en este gabinete (ver más abajo). |
| Pinzas - Dumont #5 TI | Fine Science Tools | 11252-40 | Panel F |
| Soporte de tubo aislado para medios | Custom | Panel A #9; Este soporte se ensambla fácilmente con espuma de poliestireno y un paquete de gel precalentado para mantener los medios calientes | |
| Microscopio de campo claro invertido | Nikon | TE-2000S | Instale una torreta giratoria para epifluorescencia (Panel A # 2) para imágenes de Ca2+. También se recomienda un filtro de condensador de color rojo intenso (590 nm) para minimizar el blanqueo de fluorescencia durante las imágenes de Ca2+. |
| Mesa Aisladora | TMC Control de Vibración | 30 x 36 pulgadas | Panel A, #1; Deseable: estanterías elevadas, blindaje de Faraday |
| Oculares de microscopio y objetivo | Nikon | 10X CFI oculares 40X agua CFI Plan Fluor | objetivo Panel A #3; 40X objetivo: n.a. 0.08; w.d. 2 mm. Un calentador de objetivo Cell MicroControls HLS-1 está montado alrededor del objetivo (consulte el controlador de temperatura a continuación). NOTA: Los dispensadores de inmersión en agua también están ahora disponibles para objetivos a base de agua. |
| Bomba peristáltica | Gilson | Minipuls 3 | Panel A #8 y panel E |
| barco de pesaje pequeño | Fisher | 08-732-112 | |
| Controlador de temperatura | Cell MicroControls | TC2BIP | Panel A #7; Panel D. Este controlador de temperatura calienta la cámara de cubreobjetos a 37oC. Se recomienda un precalentador y un calentador de objetivos para esta plataforma. Un precalentador HPRE2 de Cell MicroControls y El calentador de objetivo HLS-1 está controlado por el controlador de temperatura TC2BIP para nuestros estudios. |
| Luz LED debajo del gabinete con sensor de movimiento | Luz LED Sylvania | #72423 | Recomendada para la recopilación de datos durante la toma de imágenes transitorias de Ca2+ bajo una luz ambiental mínima. Alternativa: Un clip en la linterna / luz de libro con cuello flexible: hay varios proveedores disponibles. |
| Línea de vacío con matraz Ehrlenmeyer en línea y filtro protector | Fisher Tygon tubing - E363; matraz de polipropileno Ehrlenmeyer - 10-182-50B; Filtro de vacío - 09-703-90 | Panel A #11 |
Referencias
- Reihle, C., Bauersachs, J. Small animal models of heart failure. Cardiovascular Research. 115 (13), 1838-1849 (2019).
- Peter, A. K., Bjerke, M. A., Leinwand, L. A. Biology of the cardiac myocyte in heart disease. Molecular Biology of the Cell. 27 (14), 2149-2160 (2016). <....
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Reimpresiones y permisos
