Análisis de disfunción contráctil cardíaca y transitorios de Ca²⁺ en miocitos de roedores

El análisis de la función de la bomba cardíaca a menudo requiere una variedad de enfoques para obtener una visión adecuada, especialmente para modelos animales de insuficiencia cardíaca (IC). La ecocardiografía o las mediciones hemodinámicas proporcionan información sobre la disfunción cardíaca in vivo ¹, mientras que los enfoques in vitro a menudo se emplean para identificar si la disfunción surge de cambios en el miofilamento y / o el transitorio Ca²⁺ responsable de acoplar la excitación, o el potencial de acción, con la función contráctil (por ejemplo, acoplamiento excitación-contracción [E-C]). Los enfoques in vitro también brindan la oportunidad de detectar la respuesta funcional a las neurohormonas, las alteraciones genéticas inducidas por vectores, así como los posibles agentes terapéuticos² antes de seguir estrategias de tratamiento in vivo costosas y / o laboriosas.

Existen varios enfoques para investigar la función contráctil in vitro, incluyendo mediciones de fuerza en trabéculas^{intactas 3} o miocitos permeabilizados⁴, así como acortamiento descargado y transitorios de Ca²⁺ en miocitos intactos en presencia y ausencia de HF ^5,6. Cada uno de estos abordajes se centra en la función contráctil de los miocitos cardíacos, que es directamente responsable de la función de la bomba cardíaca ^2,7. Sin embargo, el análisis de la contracción y el acoplamiento E-C se realiza con mayor frecuencia midiendo el acortamiento de la longitud muscular y los transitorios de Ca 2+ en miocitos adultos aislados tolerantes a Ca²⁺. El laboratorio utiliza un protocolo detallado publicado para aislar miocitos de corazones de ratas para este paso⁸.

Tanto el transitorio Ca²⁺ como los miofilamentos contribuyen al acortamiento y re-alargamiento en los miocitos intactos y pueden contribuir a la disfunción contráctil ^2,7. Por lo tanto, este enfoque se recomienda cuando el análisis funcional in vitro requiere un miocito intacto que contenga la maquinaria ciclista Ca²⁺ más los miofilamentos. Por ejemplo, los miocitos aislados intactos son deseables para estudiar la función contráctil después de modificar la función cíclica del miofilamento o Ca²⁺ a través de la transferencia de genes⁹. Además, se sugiere un enfoque de miocitos intactos para analizar el impacto funcional de las neurohormonas cuando se estudia el impacto de las vías de señalización del segundo mensajero aguas abajo y / o la respuesta a los agentes terapéuticos². Una medición alternativa de la fuerza dependiente de la carga en miocitos individuales se realiza con mayor frecuencia después de la permeabilización de la membrana (o despellejamiento) a bajas temperaturas (≤15 ° C) para eliminar la contribución transitoria de Ca²⁺ y centrarse en la función del miofilamento¹⁰. La medición de la fuerza dependiente de la carga más los transitorios de Ca²⁺ en miocitos intactos es rara debido en gran parte al desafío complejo y técnico del enfoque¹¹, especialmente cuando se necesita un mayor rendimiento, como para medir las respuestas a la señalización de neurohormonas o como pantalla para agentes terapéuticos. El análisis de las trabéculas cardíacas supera estos desafíos técnicos, pero también puede estar influenciado por no miocitos, fibrosis y/o remodelación de la matriz extracelular². Cada uno de los enfoques descritos anteriormente requiere una preparación que contenga miocitos adultos porque los miocitos neonatales y los miocitos derivados de células madre pluripotentes inducibles (iPSC) aún no expresan el complemento completo de proteínas de miofilamentos adultos y generalmente carecen del nivel de organización de miofilamentos presente en el^{miocito 2} en forma de bastón adulto. Hasta la fecha, la evidencia en iPSCs indica que la transición completa a isoformas adultas excede más de 134 días en cultivo¹².

Dado el enfoque de esta colección en la IC, los protocolos incluyen enfoques y análisis para diferenciar la función contráctil en miocitos intactos fallidos versus no defectuosos. Se proporcionan ejemplos representativos de miocitos de rata estudiados 18-20 semanas después de una coartación suprarrenal, descrita anteriormente ^5,13. Luego se hacen comparaciones con miocitos de ratas tratadas con simulacro.

El protocolo y la plataforma de imágenes descritos aquí se utilizan para analizar y monitorear los cambios en el acortamiento y los transitorios de Ca²⁺ en los miocitos cardíacos en forma de bastón durante el desarrollo de IC. Para este análisis, 2 x 10⁴ Ca 2+-tolerantes, miocitos en forma de bastoncillos se colocan en cubreobjetos de vidrio recubiertos de laminina (CS) de²² mm² y se cultivan durante la noche, como se describió anteriormente⁸. Los componentes ensamblados para esta plataforma de imágenes, junto con los medios y búferes utilizados para una imagen óptima, se proporcionan en la Tabla de materiales. Aquí también se proporciona una guía para el análisis de datos utilizando un software y los resultados representativos. El protocolo general se divide en subsecciones separadas, con las tres primeras secciones centradas en miocitos de rata aislados y análisis de datos, seguidas de experimentos transitorios celulares de Ca²⁺ y análisis de datos en miocitos.

Los estudios realizados en roedores siguieron la Política del Servicio de Salud Pública sobre el Cuidado Humanitario y el Uso de Animales de Laboratorio y fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Michigan. Para este estudio, se aislaron miocitos de ratas Sprague-Dawley y F344BN de 3-34 meses de edad con un peso ≥ de 200 g⁵. Se utilizaron tasas masculinas y femeninas.

1. Estimulación de miocitos para estudios de función contráctil

1. Haga medios frescos basados en M199 para cada conjunto de miocitos aislados (Tabla de materiales). 1 día antes de la estimulación, placa 2 x 10⁴ Miocitos tolerantes a Ca 2+, en forma de bastoncillos en cubredos de vidrio (CS) recubiertos de laminina de²² mm² , como se describió anteriormente⁸.
2. Para preparar las cámaras, remoje cada cámara en lejía al 10% durante 1 h. Luego, enjuague las cámaras con agua corriente del grifo durante 30-45 minutos, seguido de agua destilada reemplazada cada 5 minutos durante 30 minutos, seguida de agua desionizada reemplazada cada 5 minutos durante 30 minutos, y un enjuague final en agua desionizada.
3. Seque las cámaras sobre una superficie limpia durante 20-30 min (Figura suplementaria 1A-C). A continuación, trate las cámaras UV en un gabinete de bioseguridad durante 5 minutos en cada dirección (total = 20 min). Este paso no es necesario para cámaras preesterilizadas.
   PRECAUCIÓN: Abandone el área para minimizar la exposición a los rayos UV.
4. Retire la cubierta de la cámara, agregue 3 ml de medios a base de M199 (consulte la Tabla de materiales) a cada pocillo (Figura suplementaria 1B), reemplace la cubierta y precaliente la cámara en una incubadora a 37 °C con 5% de CO2 y 20% de_O2.
5. Esterilizar las pinzas en un esterilizador de perlas calientes a 250 °C durante 20-25 s. Transfiera la cámara de estimulación precalentada de la incubadora a un gabinete de bioseguridad.
6. Transfiera cada cubreobjetos (CS) que contiene miocitos cardíacos a pocillos individuales en la cámara de estimulación utilizando fórceps estériles. Transfiera los CS de cuatro en cuatro, seguidos de calentamiento durante 10 minutos antes de la transferencia de los cuatro CS restantes para mantener la temperatura del medio.
7. Conecte los gatos de plátano a la cámara de estimulación en un extremo (Figura suplementaria 1C) y al estimulador en el otro extremo (Figura suplementaria 1D).
8. Ajuste la frecuencia del estimulador a 0.2 Hz y ajuste el voltaje (~ 12 V) para lograr la contracción en ~ 10% -20% de todos los miocitos cardíacos en forma de bastón dentro de un pozo. Para determinar el número de miocitos que se contraen, coloque la cámara bajo un microscopio invertido con un aumento de 4x a 10x.
9. Colocar la cámara de estimulación en una incubadora a 37 °C en_CO2 al 5% (Figura suplementaria 1E). Cambiar los medios cada 12 h utilizando medios precalentados en una incubadora de_CO2 al 5% a 37 °C durante 20-25 min. Continúe la estimulación eléctrica durante un máximo de 3 días con el medio cambiado cada 12 h.

2. Análisis de la función contráctil de miocitos cardíacos de ratas adultas

1. Precaliente un paquete de gel y un medio en una incubadora a 37 °C durante 30 minutos antes del experimento.
2. Encienda los componentes de la plataforma de función contráctil enumerados en la Tabla de materiales y que se muestran en la Figura suplementaria 2, con especial atención a los componentes clave, que incluyen una tabla antivibración (Figura suplementaria 2A-1) con un microscopio invertido con un filtro rojo intenso (590 nm) (Figura suplementaria 2A-2,3) y una cámara CCD (Figura suplementaria 2A-4) conectada a un controlador CCD (Figura complementaria 2A-5 y Figura suplementaria 2C-5) e integrado con una computadora PC (Figura suplementaria 2B-14).
3. Montar el tubo en la bomba peristáltica (Figura suplementaria 2A-8; Figura suplementaria 2A-8), transfiera el paquete de gel precalentado al soporte del tubo (Figura suplementaria 2A-9) y encienda el vacío (Figura suplementaria 2A-11) y encienda el estimulador celular (Figura suplementaria 2B-13).
4. Coloque un tubo de 50 ml con medios en el soporte del tubo aislado (Figura suplementaria 2A-9) y comience la perfusión a ~0.5 ml / min a través del tubo de la bomba peristáltica (Figura suplementaria 2E-8).
5. Agregue una pequeña cantidad de medios precalentados a un bote de pesaje pequeño (~ 2 ml). Transfiera un CS que contenga miocitos de la cámara de estimulación al barco de pesaje. Devolver la cámara de estimulación a 37 °C en la incubadora de_CO2 al 5%.
6. Retire el CS del bote de pesaje y limpie suavemente la parte inferior. Transfiera el CS a una cámara CS recién engrasada (Figura suplementaria 2A, F-10; flecha negra) y agregue suavemente una gota de medio (~ 200 μL) al CS.
7. Coloque un soporte de electrodo de platino sobre el CS (Figura suplementaria 2F; flecha gris) y coloque un nuevo CS sobre la parte superior usando pinzas. Coloque un soporte superior (Figura suplementaria 2F; flecha blanca) sobre el sándwich CS y luego instale dos o cuatro tornillos de cabeza de bandeja #0 para terminar de ensamblar la cámara.
8. Una vez que el medio esté presente en todo el tubo de la bomba, conecte el tubo al precalentador y luego conecte el precalentador a la cámara CS ensamblada en el paso 2.7. Comience la perfusión a 0,5 ml/min y coloque una toallita de pañuelos debajo de la cámara para asegurarse de que no haya fugas.
9. Coloque la cámara CS en el adaptador de escenario. Los medios perfundidos se recogen en el extremo opuesto de la cámara con tubos conectados a un sistema de vacío. Encienda el sistema de calefacción (Figura suplementaria 2A, D-7) y equilibre la cámara, el objetivo y el precalentador durante ~ 5-10 min para lograr una temperatura constante del medio de 37 ° C. Visualice los miocitos con el objetivo de inmersión en agua 40x en el microscopio durante este tiempo de equilibrio.
10. Active el estimulador de estimulación (Figura suplementaria 2B-13) ajustando el voltaje a 1.5x el ajuste necesario para que el 80% de las células en forma de varilla se contraigan, que generalmente es de 35-40 V. Establezca la frecuencia de estimulación en 0.2 Hz para optimizar la función contráctil y la supervivencia de los miocitos.
11. Recolectar trazas de acortamiento y realargamiento contráctil de miocitos perfundidos y con ritmo continuo. Para recopilar mediciones de acortamiento, utilice una cámara CCD (Figura suplementaria 2A-4) conectada a un controlador CCD (Figura suplementaria 2B-5,C) y una computadora dedicada con una placa controladora de E/S (Figura suplementaria 2B-14; consulte la Tabla de materiales). La plataforma mide el acortamiento del sarcómero en miocitos de rata, aunque se obtienen resultados similares a partir de mediciones de miocitos recogidas de los bordes longitudinales de los miocitos (ver Ecklerle et ^al.14).
12. Para recopilar rastros de acortamiento de sarcómero, abra el software en el equipo, seleccione Aceptar y, a continuación, Archivo > Nuevo. Prepare una plantilla de pantalla seleccionando Trazas > Editar límites de usuario > longitud del sarcómero y, a continuación, establezca valores máximos y mínimos, que suelen estar entre 2,0 μm y 1,5 μm. Calibrar la cámara CCD con una retícula de 0,01 mm antes de realizar mediciones en los miocitos (Figura 1D).
13. Para registrar las trazas de longitud del sarcómero, seleccione Archivo > Nuevo. Identifique un miocito que se contrae y colóquelo a lo largo del eje longitudinal de la cámara de modo que el patrón de estriación sea vertical (Figura 1B).
14. Use el mouse de la computadora para colocar el cuadro de región de interés (ROI) (cuadro rosa) sobre el miocito (Figura 1C). Seleccione Recopilar y comenzar para registrar la función contráctil. Registrar el acortamiento durante 60 s de cada miocito a bajas frecuencias de estimulación (≤0,5 Hz).
15. Registre el acortamiento del sarcómero de 5 a 10 células por CS. Realice mediciones a 1 célula/CS si los estudios incluyen tratamiento con agonistas/antagonistas. Prepare un medio precalentado separado y una pieza diferente y dedicada de tubo de perfusión cargada en una bomba peristáltica multicanal y siga los pasos 2.9.-2.14. Medir el impacto de la administración de fármacos o neurohormonas sobre la función contráctil de los miocitos.
16. Para medir el acortamiento en un rango de frecuencias, mantenga el ritmo de los miocitos en cada frecuencia para obtener un acortamiento en estado estacionario antes de registrar⁵. Para estos estudios, duplique la tasa de perfusión y comience a registrar 15-20 s después de la estimulación a una nueva frecuencia para obtener respuestas contráctiles consistentes en estado estacionario para frecuencias en el rango de 0.2 Hz y 2 Hz. Por lo general, registre no más de 2 miocitos / CS para acortar en el rango dado de frecuencias de estimulación.
17. Registre al menos 7 contracciones/celda para obtener datos confiables promediados de señal al analizar las grabaciones (consulte el paso 3).

3. Análisis de datos de función contráctil en miocitos aislados

1. Para comenzar, seleccione Archivo, elija un seguimiento grabado y, a continuación, seleccione Abrir. Seleccione la pestaña 1 (lado izquierdo) de la traza base y, a continuación, establezca el panel amarillo en la parte superior de la traza en Sarc-Length. Seleccione Trazas y la plantilla de pantalla preparada en el paso 2.12.
2. Para preparar una plantilla de análisis, seleccione Operaciones, Opciones de análisis transitorio monotónico, Marca de evento TTL en el cuadro Definición de t0, así como las siguientes opciones del menú: Línea base (longitud del sarcómero en reposo), Velocidad de salida relativa a t0 (dep v), Pico (altura máxima y %altura pico/línea de base o bl%pico h), Velocidad de retorno relativa a tPeak (ret v), Tiempo hasta el pico 50% (TTP 50%) usando t0, y Tiempo hasta la línea de base 50% (TTR_50%) usando tPeak. Guarde estas opciones de análisis seleccionando Plantillas > Guardar plantilla de análisis con un identificador. Cargue esta plantilla de análisis antes de analizar cada seguimiento.
3. Para comenzar el análisis de datos, seleccione Marcas > puerta > Agregar > transitorio Convertir de marca de evento > Rango de análisis. Ahora establezca el rango de tiempo de -0.01 s a 1.20 s para los miocitos con ritmo de 0.2 Hz (Figura 2A, marcas rojas en la parte inferior de la traza cruda). Seleccione un rango de tiempo más corto para los miocitos estimulados a frecuencias más altas.
4. Genere un seguimiento promediado de señal seleccionando Operaciones > Eventos promedio. Aparece una grabación promediada por señal debajo de la traza base original.
5. Seleccione la pestaña 1 del seguimiento promediado de la señal (lado izquierdo de la pantalla) y, a continuación, seleccione Marcas en el menú superior, seguido de Agregar transitorio. Seleccione Operaciones en el menú superior y Análisis de transitorios monotónicos para mostrar los valores promediados de señal para la longitud del sarcómero de referencia, la altura del pico, bl%pico h, dep v, ret v, TTP 50% y TTR_50% en el panel de visualización promediado de señal.
6. Transfiera cada análisis transitorio de sarcómero a una hoja de cálculo para el análisis compuesto de múltiples miocitos seleccionando Exportar > análisis transitorio monotónico > Corriente del portapapeles. Pegue estos datos en la hoja de cálculo para cada seguimiento.
7. Para copiar el seguimiento promediado de señal, seleccione Exportar > Seguimiento actual > Opciones de > del portapapeles y establezca los decimales en 5, luego seleccione Delimitador de pestañas y haga clic en Aceptar y Aceptar. Pegue las trazas promediadas por señal para cada registro de miocitos en una segunda hoja de cálculo.

4. Registro de transitorios de Ca²⁺ en miocitos cardíacos adultos de rata

1. Antes de medir los transitorios de Ca 2+, encienda los componentes de la plataforma descritos en el paso 2.2., junto con los componentes adicionales de imágenes de fluorescencia (consulte los componentes adicionales para el análisis de imágenes de Ca²⁺ en la Tabla de materiales; Figura complementaria 2A-5,6; 2B-12).
2. Preparar la solución madre de Fura-2AM que contenga 1 mM de Fura-2AM más 0,5 M de probenecid en dimetilsulfóxido (DMSO). Probenecid minimiza la fuga de Fura-2AM¹⁵.
3. Diluir la solución madre a 5 μM de Fura-2AM y 2,5 mM de probenecid en 2,5 ml de medio (ver Tabla de materiales) en un pocillo de una placa de 6 pocillos. Agregue 2.5 ml de medios solos (sin Fura-2AM) a tres pocillos adicionales en la placa, cubra la placa con papel de aluminio y precaliente el medio a 37 ° C.
4. Transfiera un CS que contenga miocitos de la cámara de estimulación al pocillo que contiene Fura-2AM, cubra y devuelva la placa a la incubadora de 37 °C con 5% de_CO2 durante 4 min. Monte el tubo en la bomba de perfusión y perfunda con medios durante el período de carga Fura-2AM, como se describe en el paso 2.4.
5. Apague o minimice las luces de la habitación para reducir el fotoblanqueo de fluorescencia y optimizar la señal de fluorescencia. Retire la placa de 6 pocillos de la incubadora y luego lave el CS durante 10 s en cada uno de los tres pocillos que contienen medios solos. Transfiera el CS a un bote de pesaje pequeño que contenga medios precalentados (sin Fura-2AM añadido).
6. Monte el CS en la cámara CS recién engrasada después de limpiar suavemente la parte inferior del CS. Agregue suavemente una gota de medio al CS y luego ensamble el soporte del electrodo sobre el CS, seguido de un segundo CS y el soporte superior. Utilice tornillos de cabeza de bandeja #0 para terminar de ensamblar la cámara celular, como se describe en los pasos 2.6.-2.7.
7. Conecte el tubo de la bomba lleno de medios al precalentador, conecte el precalentador a la cámara CS y colóquelo en un adaptador de etapa, como se describe en el paso 2.8. Recoja el medio con el sistema de tubos de vacío y encienda el sistema de calefacción (Figura suplementaria 2A, D-7) para equilibrar la cámara a 37 °C, como se describe en los pasos 2.8.-2.9.
8. Active el estimulador de estimulación (Figura suplementaria 2B-13) ajustado a 35-40 V y 0,2 Hz, como se describe en el paso 2.10.
9. Antes de grabar un transitorio Ca²⁺ , encienda una pequeña linterna o una luz de libro montada cerca del teclado de la computadora para ayudar a ver el teclado. Además, registre el fondo de fluorescencia en un área sin miocitos cardíacos. Para comenzar, seleccione Archivo > Iniciar > nuevo, como se describe en el paso 2.12.
10. Seleccione un ROI y establezca una pestaña (o barra de seguimiento, lado izquierdo) para el numerador sin procesar y una segunda pestaña para el denominador sin procesar, definida en la parte superior central de cada pestaña. Grabe el fondo durante 10-20 s. Haga clic con el botón derecho del ratón y arrastre sobre un panel de barra de seguimiento para obtener los valores de numerador y denominador promediados de señal sin procesar. Introduzca estos valores seleccionando las constantes Operaciones > E introduzca los valores sin procesar.
11. Prepare una nueva plantilla de pantalla para recopilar tanto el acortamiento como los transitorios Ca²⁺ . Para la longitud del sarcómero, seleccione Tab 1 y utilice el mismo proceso que se describe en el paso 2.13. Para imágenes de Ca²⁺ , seleccione Relación > de la pestaña 2 (centro superior de la pestaña) > Seguimientos > Editar límites de usuario para establecer los niveles mínimo y máximo para la proporción, que normalmente se establecen entre 1 y 5. Utilice el mismo proceso para definir los rangos de numerador y denominador para las pestañas 3 y 4 (lado izquierdo).
12. Coloque un cuadro de ROI sobre una imagen de miocitos, como se describe en el paso 2.14. Seleccione Archivo > Nueva > recopilar. Ahora seleccione Iniciar para recopilar datos de acortamiento y ratiométricos Ca²⁺ . Registre ≥7 contracciones / celda para el análisis promediado de señales.
13. Repita la grabación de seguimiento en segundo plano descrita en el paso 4.10. después de registrar 2-4 miocitos. Por lo general, registre 4-5 miocitos / CS o menos miocitos si hay cambios significativos en la lectura de fondo.

5. Análisis de datos de transitorios de Ca²⁺ en miocitos aislados.

1. Abra el archivo deseado para el análisis y seleccione Plantillas > Plantilla de pantalla para acortar más transitorios Ca²⁺ . A continuación, seleccione las pestañas 1 y 2 (izquierda) para mostrar la longitud del sarcómero y la relación Ca²⁺ , respectivamente. Seleccione Operaciones > Constantes e introduzca los valores del numerador y el denominador de la traza de fondo Ca²⁺ .
2. Prepare plantillas de análisis para acortar más datos transitorios de Ca²⁺ . Seleccione la pestaña 1 (lado izquierdo) y utilice el mismo proceso que se describe en el paso 3.2. para establecer la plantilla de análisis de longitud de sarcómero.
3. Seleccione la pestaña 2 (lado izquierdo) y seleccione Operaciones, Opciones de análisis transitorio monotónico, Marca de evento TTL en el cuadro Definición de t0 y las siguientes opciones del menú: Línea de base (relación basal), Velocidad de salida relativa a t0 (dep v), Pico (altura máxima y %altura máxima/línea de base o bl%pico h), Velocidad de decaimiento relativa a tPeak (ret v), Tiempo hasta el pico 50% (TTP 50%) usando t0, y Tiempo hasta la línea de base 50% (TTR_50%) usando tPeak. Guarde estas opciones de análisis seleccionando Plantillas y Guardar plantilla de análisis con un nuevo nombre de identificador. Cargue esta plantilla de análisis antes de analizar cada seguimiento.
4. Utilice el mismo proceso descrito en los pasos 3.3.-3.6. para promediar la señal y luego analizar la longitud del sarcómero, seguido de los mismos pasos para los transitorios de Ca²⁺ . Establezca marcas separadas para la longitud del sarcómero y para la traza de relación transitoria Ca²⁺ .

Los estudios de función contráctil se realizan en miocitos de rata comenzando el día después del aislamiento (día 2) hasta 4 días después del aislamiento. Aunque los miocitos pueden registrarse el día después del aislamiento (es decir, el día 2), a menudo se requieren tiempos de cultivo más largos después de la transferencia de genes o tratamientos para modificar la función contráctil8. Para los miocitos cultivados durante más de 18 h después del aislamiento, el protocolo de estimulación descrito en la sección 1 ayuda a mantener los túbulos T y a acortar y volver a alargar los resultados consistentes.

En la Figura 1A se muestra una porción representativa de un SC que contiene miocitos para estudios de acortamiento, junto con un miocito colocado adecuadamente antes de establecer el ROI (Figura 1B). Una vez que se identifica un ROI (Figura 1C; cuadro rosa), la información del algoritmo que se muestra debajo del miocito también ayuda a optimizar el posicionamiento de los miocitos antes de la grabación. Específicamente, la densidad óptica lineal (LOD; línea negra) es un indicador del número y el espaciado de los sarcómeros, y un espectro de potencia nítido en la traza rápida de la transformada de Fourier (FFT, línea roja) ayuda a lograr una alineación óptima para el registro de acortamiento y re-alargamiento. El patrón de retícula utilizado para la calibración de la longitud del sarcómero (y la detección de bordes) se muestra en la Figura 1D. En la Figura 2A (panel superior) se muestra un registro alineado típico del acortamiento de la longitud del sarcómero, junto con el análisis promediado por señal descrito en la sección 3 (panel inferior).

La disfunción se detecta a menudo en los miocitos cuando hay disfunción in vivo en modelos animales. Por ejemplo, la disfunción sistólica observada por ecocardiografía en respuesta a la sobrecarga de presión (PO)13 también se detecta en estudios de acortamiento de miocitos5. Para ilustrar las trazas de datos, se muestran trazas representativas en bruto (Figura 2; panel superior) y promediadas por señal (Figura 2; panel inferior) obtenidas a 0,2 Hz para miocitos de ratas simuladas (Figura 2A) y tratadas con PO (Figura 2B). Para probar si la función de los miocitos podría ser rescatada después de PO, la transferencia de genes mediada por virus en el momento del aislamiento de miocitos también se utilizó para reemplazar la troponina cardíaca endógena I (cTnI) con una sustitución fosfo-mimética cTnI T144D (T144D) en el sarcómero16. El análisis inicial muestra que la reducción inducida por PO en la función contráctil (Tabla 1, panel superior) regresó a los niveles simulados en los miocitos PO 4 días después de la transferencia génica de cTnIT144D (Tabla 1; panel inferior).

Esta plataforma también se puede utilizar para medir transitorios de Ca2+, junto con el acortamiento en miocitos aislados. El acortamiento y el Ca 2+ no se registraron después de la PO porque la PO reduce la adherencia de los miocitos de rata a la laminina13, y un modelo comparable mostró previamente que el manejo alterado de Ca2+ se desarrolla en un punto de tiempo similar17. En cambio, se realizaron experimentos representativos en miocitos cargados con Fura-2AM aislados de ratas de 2-3 meses de edad. En la Figura 3 se muestra un registro representativo y trazas promediadas por señal, junto con el análisis de datos en la Tabla 2. Para este conjunto de experimentos, se estudiaron miocitos aislados de ratas adultas 4 días después de la transferencia de genes mediada por adenovirus (multiplicidad de infección = 100) de cTnIT144D o cTnI de tipo salvaje. Tanto el acortamiento del sarcómero como los transitorios de Ca 2+ se midieron después de cargar miocitos conFura-2AM. La transferencia génica de cTnIT144D mejoró el acortamiento máximo y elevó los niveles diastólicos de Ca2+ en comparación con cTnI en estos estudios iniciales (Tabla 2). Si bien se necesita un análisis más extenso, los resultados iniciales sugieren que el reemplazo in vivo con cTnIT144D podría producir un fenotipo cardíaco complejo debido a los cambios tanto en la función contráctil como en el manejo de Ca2+ a lo largo del tiempo.

Figura 1: Miocitos cardíacos de rata adulta utilizados para estudios funcionales. (A) Miocitos cardíacos aislados representativos de una rata adulta (barra de escala = 50 μm). La flecha apunta a un miocito representativo fotografiado para el análisis de la función contráctil. (B) Miógeno representativo con un ROI (rosa) localizado en el lateral (barra de escala = 20 μm). (C) Miógeno representativo con un ROI (panel superior), el patrón sarcómero para este miocito (panel inferior, azul; barra de escala = 20 μm) y el pico agudo del espectro de potencia (panel inferior, rojo). (D) Captura de pantalla de retícula de 0,01 mm para calibrar las medidas de acortamiento. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Registros representativos de miocitos de rata. Una traza de grabación cruda (panel superior) y promediada de señal (panel inferior) registrada a 0,2 Hz en miocitos de ratas tratadas con (A) sobrecarga de presión (PO) simulada y (B). Los miocitos fueron aislados 18-20 semanas después de la cirugía, con PO producida por coartación suprarrenal13. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Registro y análisis representativos de la longitud del sarcómero (SL) y los transitorios de Ca 2+ de miocitos cardíacos adultos cargados con Fura-2AM. (A) Trazas brutas para SL, relación transitoria (relación) Ca 2+ y las trazas del numerador y el denominador utilizadas para producir la relación transitoria Ca2+. (B) Un ejemplo de trazas promediadas por señal para SL (traza superior) y la relación transitoria Ca2+ (traza inferior). (C) Las trazas se analizan para determinar la longitud del sarcómero (SL) y la relación transitoria Ca2+ utilizando el algoritmo de traza monótona. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Comparación de la función contráctil en miocitos cardíacos en respuesta a la sobrecarga de presión (PO) y la transferencia génica. Los resultados del acortamiento de miocitos provienen de corazones de ratas simuladas y PO 18-20 semanas después de la cirugía (panel superior)5,13 y miocitos de ratas simuladas y PO 4 días después de la transferencia del gen cTnIT144D (panel inferior). La función contráctil se mide 4 días después del aislamiento de miocitos/transferencia de genes en todos los grupos. Los resultados se expresan como media ± SEM (n = número de miocitos). Cada conjunto de datos simulados y PO se compara mediante una prueba t de Student, con *p < 0,05 considerados estadísticamente significativos. Los resultados de amplitud máxima para los miocitos simulados y PO solos se informaron anteriormente en Ravichandran et al.5.

Tabla 2: Función contráctil y transitorios de Ca2+ en miocitos de rata adulta 4 días después de la transferencia del gen cTnIT144D. Un análisis de la función contráctil (panel superior) y transitorios de Ca2+ (panel inferior) se muestra en miocitos después de la transferencia génica de cTnIT144D en comparación con cTnI de tipo salvaje. Los miocitos se aíslan de ratas adultas de 2-3 meses de edad, y los datos se presentan como media ± SEM (n = número de miocitos). Las comparaciones estadísticas de la función contráctil (izquierda) y los transitorios de Ca2+ (derecha) se realizan utilizando una prueba t de Student no pareada con significación establecida en *p < 0,05.

Figura suplementaria 1: Componentes del sistema de estimulación para miocitos plateados en CS recubiertos de laminina. (A) Cámara de estimulación personalizada que contiene electrodos de platino en cada cámara. (B) Cámara de estimulación con las primeras cuatro cámaras llenas de medios. (C) Cámara de estimulación conectada a cables de toma de plátano, que están conectados a la cámara y (D) al estimulador. (E) La conexión entre el estimulador (derecha) y la incubadora a 37 °C (izquierda). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 2: Componentes necesarios para la función contráctil de los miocitos y/o las mediciones transitorias de Ca2+. (A) La plataforma de función contráctil que muestra cada componente, con los elementos numerados explicados con más detalle en la Tabla de materiales. Los componentes de la plataforma incluyen una mesa antivibración , microscopio de campo claro invertido (# 2,3), cámara CCD (# 4), controlador CCD y fuente de alimentación de xenón (# 5), fuente de luz de emisión dual (# 6), controlador de temperatura # 7, bomba peristáltica # 8, soporte de tubo aislado # 9, cámara de perfusión montada en cubreobjetos (# 10) y sistema de vacío (# 11). (B) Los componentes adicionales incluyen la interfaz de fluorescencia (# 12), el estimulador de cámara (# 13) y la computadora PC (# 14), que se explican con más detalle en la Tabla de materiales. Las vistas en primer plano de los elementos numerados en el panel A se muestran en C-F. (C) Vista de la fuente de alimentación de xenón (izquierda) y el controlador CCD (derecha). (D) Controlador de temperatura. (E) Bomba peristáltica. (F) Vista de la base para la cámara de perfusión CS (flecha negra), el soporte del electrodo de platino (flecha gris) y el montaje superior (flecha blanca) con tornillos de cabeza panorámica #0. Haga clic aquí para descargar este archivo.

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