Summary
Er wordt een reeks protocollen gepresenteerd die de meting van de contractiele functie beschrijven via sarcomeerlengtedetectie samen met calcium (Ca2+) voorbijgaande meting in geïsoleerde rattenmyocyten. De toepassing van deze aanpak voor studies in diermodellen van hartfalen is ook inbegrepen.
Abstract
Contractiele disfunctie en Ca2+ transiënten worden vaak geanalyseerd op cellulair niveau als onderdeel van een uitgebreide beoordeling van cardiale letsels en / of remodellering. Een benadering voor het beoordelen van deze functionele veranderingen maakt gebruik van onbelaste verkorting en Ca2 + voorbijgaande analyses in primaire volwassen cardiale myocyten. Voor deze aanpak worden volwassen myocyten geïsoleerd door collagenasevertering, Ca2 + tolerant gemaakt en vervolgens gehecht aan laminine-gecoate coverslips, gevolgd door elektrische pacing in serumvrije media. Het algemene protocol maakt gebruik van volwassen cardiale myocyten bij ratten, maar kan gemakkelijk worden aangepast voor primaire myocyten van andere soorten. Functionele veranderingen in myocyten van gewonde harten kunnen worden vergeleken met sham myocyten en/of met in vitro therapeutische behandelingen. De methodologie omvat de essentiële elementen die nodig zijn voor myocytenpacing, samen met de celkamer en platformcomponenten. Het gedetailleerde protocol voor deze aanpak omvat de stappen voor het meten van onbelaste verkorting door sarcomeerlengtedetectie en cellulaire Ca2 + transiënten gemeten met de ratiometrische indicator Fura-2 AM, evenals voor ruwe gegevensanalyse.
Introduction
De analyse van de hartpompfunctie vereist vaak een reeks benaderingen om voldoende inzicht te krijgen, vooral voor diermodellen van hartfalen (HF). Echocardiografie of hemodynamische metingen geven inzicht in in vivo cardiale disfunctie1, terwijl in vitro benaderingen vaak worden gebruikt om te identificeren of disfunctie ontstaat door veranderingen in het myofilament en/of de Ca2+ transiënt die verantwoordelijk is voor het koppelen van excitatie, of het actiepotentiaal, met contractiele functie (bijv. Excitatie-contractie [E-C] koppeling). In vitro benaderingen bieden ook de mogelijkheid om de functionele respons op neurohormonen, vector-geïnduceerde genetische veranderingen en potentiële therapeutische middelen2 te screenen voordat dure en / of moeizame in vivo behandelingsstrategieën worden nagestreefd.
Er zijn verschillende benaderingen beschikbaar om de in vitro contractiele functie te onderzoeken, waaronder krachtmetingen in intacte trabeculae3 of gepermeabiliseerde myocyten4, evenals onbelaste verkorting en Ca2+ transiënten in intacte myocyten in de aan- en afwezigheid van HF 5,6. Elk van deze benaderingen richt zich op de cardiale myocytencontractiele functie, die direct verantwoordelijk is voor de hartpompfunctie 2,7. De analyse van zowel contractie als E-C-koppeling samen wordt echter meestal uitgevoerd door verkorting van de spierlengte en Ca2+ transiënten in geïsoleerde, Ca2+ tolerante volwassen myocyten te meten. Het laboratorium maakt gebruik van een gedetailleerd gepubliceerd protocol om myocyten uit rattenharten te isoleren voor deze stap8.
Zowel de Ca2+ transiënten als myofilamenten dragen bij aan verkorting en herverlenging in intacte myocyten en kunnen bijdragen aan contractiele disfunctie 2,7. Deze aanpak wordt dus aanbevolen wanneer in vitro functionele analyse een intacte myocyt vereist die de Ca2+ fietsmachines plus de myofilamenten bevat. Intacte geïsoleerde myocyten zijn bijvoorbeeld wenselijk voor het bestuderen van de contractiele functie na het wijzigen van de myofilament- of Ca2+ fietsfunctie via genoverdracht9. Daarnaast wordt een intacte myocytenbenadering voorgesteld voor het analyseren van de functionele impact van neurohormonen bij het bestuderen van de impact van downstream tweede boodschapper signaleringsroutes en /of respons op therapeutische middelen2. Een alternatieve meting van belastingsafhankelijke kracht in enkele myocyten wordt meestal uitgevoerd na membraanpermeabilisatie (of skinning) bij lage temperaturen (≤15 °C) om de Ca2+ voorbijgaande bijdrage te verwijderen en zich te concentreren op myofilamentfunctie10. De meting van belastingsafhankelijke kracht plus Ca2+ transiënten in intacte myocyten is zeldzaam, grotendeels vanwege de complexe en technische uitdaging van de aanpak11, vooral wanneer een hogere doorvoer nodig is, zoals voor het meten van reacties op neurohormone signalering of als een scherm voor therapeutische middelen. De analyse van cardiale trabeculae overwint deze technische uitdagingen, maar kan ook worden beïnvloed door niet-myocyten, fibrose en / of extracellulaire matrixremodellering2. Elk van de hierboven beschreven benaderingen vereist een preparaat dat volwassen myocyten bevat, omdat neonatale myocyten en myocyten afgeleid van induceerbare pluripotente stamcellen (iPSC's) nog niet het volledige complement van volwassen myofilamenteiwitten tot expressie brengen en meestal het niveau van myofilamentorganisatie missen dat aanwezig is in de volwassen staafvormige myocyt2. Tot op heden wijst bewijs in iPSC's erop dat de volledige overgang naar volwassen isovormen meer dan 134 dagen in cultuur12 overschrijdt.
Gezien de focus van deze collectie op HF, omvatten de protocollen benaderingen en analyse om contractiele functie te onderscheiden in falende versus niet-falende intacte myocyten. Representatieve voorbeelden worden gegeven van rattenmyocyten die 18-20 weken na een supra-renale coarctatie zijn bestudeerd, eerder beschreven 5,13. Vervolgens worden vergelijkingen gemaakt met myocyten van met sham behandelde ratten.
Het hier beschreven protocol en beeldvormingsplatform worden gebruikt om veranderingen in verkorting en Ca2+ transiënten in staafvormige hartmyocyten tijdens de ontwikkeling van HF te analyseren en te monitoren. Voor deze analyse worden 2 x 104 Ca2+-tolerante, staafvormige myocyten verguld op 22 mm2 laminine-gecoate glazen coverslips (CSs) en 's nachts gekweekt, zoals eerder beschreven8. De componenten die voor dit beeldvormingsplatform zijn geassembleerd, samen met de media en buffers die worden gebruikt voor optimale beeldvorming, zijn opgenomen in de materiaaltabel. Een gids voor data-analyse met behulp van een software en de representatieve resultaten worden hier ook gegeven. Het algemene protocol is onderverdeeld in afzonderlijke subsecties, waarbij de eerste drie secties zich richten op geïsoleerde rattenmyocyten en gegevensanalyse, gevolgd door cellulaire Ca2 + voorbijgaande experimenten en gegevensanalyse in myocyten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Studies uitgevoerd op knaagdieren volgden het public health service policy on humane care and use of laboratory animals en werden goedgekeurd door de University of Michigan Institutional Animal Care and Use Committee. Voor deze studie werden myocyten geïsoleerd uit 3-34 maanden oude Sprague-Dawley en F344BN ratten met een gewicht van ≥ 200 g5. Zowel mannelijke als vrouwelijke tarieven werden gebruikt.
1. Myocytenpacing voor contractiele functiestudies
- Maak verse op M199 gebaseerde media voor elke set geïsoleerde myocyten (Tabel met materialen). 1 dag voor het pacen, plaat 2 x 104 Ca2+-tolerante, staafvormige myocyten op 22 mm2 laminine-gecoate glazen coverslips (CSs), zoals eerder beschreven8.
- Om de kamers te bereiden, weekt u elke kamer gedurende 1 uur in 10% bleekmiddel. Spoel vervolgens de kamers met stromend kraanwater gedurende 30-45 minuten, gevolgd door gedestilleerd water dat elke 5 minuten gedurende 30 minuten wordt vervangen, gevolgd door gedeïoniseerd water dat elke 5 minuten gedurende 30 minuten wordt vervangen en een laatste spoeling in gedeïoniseerd water.
- Droog de kamers op een schoon oppervlak gedurende 20-30 minuten (aanvullende figuur 1A-C). Vervolgens behandelt UV de kamers in een bioveiligheidskast gedurende 5 minuten in elke richting (totaal = 20 min). Deze stap is niet nodig voor vooraf gesteriliseerde kamers.
LET OP: Verlaat het gebied om uv-blootstelling te minimaliseren. - Verwijder het deksel uit de kamer, voeg 3 ml op M199 gebaseerde media (zie materiaaltabel) toe aan elke put (aanvullende figuur 1B), vervang de deksel en verwarm de kamer voor in een incubator van 37 °C met 5% CO2 en 20% O2.
- Steriliseer een tang in een hete kraalsterilisator bij 250 °C gedurende 20-25 s. Breng de voorverwarmde stimulatiekamer over van de incubator naar een bioveiligheidskast.
- Breng elke coverslip (CS) met cardiale myocyten over naar individuele putten in de stimulatiekamer met behulp van een steriele tang. Breng CSs vier tegelijk over, gevolgd door verwarming gedurende 10 minuten voorafgaand aan de overdracht van de resterende vier CS'en om de mediatemperatuur te handhaven.
- Bevestig bananenaansluitingen aan de stimulatiekamer aan het ene uiteinde (aanvullende figuur 1C) en aan de stimulator aan het andere uiteinde (aanvullende figuur 1D).
- Stel de stimulatorfrequentie in op 0,2 Hz en stel de spanning (~ 12 V) in om contractie te bereiken in ~ 10% -20% van alle staafvormige hartmyocyten in een put. Om het aantal samentrekkende myocyten te bepalen, plaatst u de kamer onder een omgekeerde microscoop met een vergroting van 4x tot 10x.
- Plaats de stimulatiekamer in een couveuse bij 37 °C in 5% CO2 (aanvullende figuur 1E). Vervang de media elke 12 uur met behulp van media die voorverwarmd zijn in een 37 °C, 5% CO2-incubator gedurende 20-25 minuten. Ga door met elektrische stimulatie gedurende maximaal 3 dagen met de media elke 12 uur vervangen.
2. Contractiele functieanalyse van volwassen cardiale myocyten bij ratten
- Verwarm een gelpack en media voor in een incubator van 37 °C gedurende 30 minuten voorafgaand aan het experiment.
- Schakel de componenten van het contractiele functieplatform in die zijn vermeld in de tabel met materialen en worden weergegeven in aanvullende figuur 2, met speciale aandacht voor de belangrijkste componenten, waaronder een antitrillingstabel (aanvullende figuur 2A-1) met een omgekeerde microscoop met een dieprood (590 nm) filter (aanvullend figuur 2A-2,3) en CCD-camera (aanvullende figuur 2A-4) aangesloten op een CCD-controller (aanvullende figuur 2A-5 en Aanvullende figuur 2C-5) en geïntegreerd met een pc-computer (aanvullende figuur 2B-14).
- Monteer slangen in de peristaltische pomp (aanvullende figuur 2A-8; Aanvullende figuur 2A-8), breng het voorverwarmde gelpakket over in de buishouder (aanvullende figuur 2A-9) en schakel het vacuüm (aanvullende figuur 2A-11) en de voeding naar de celstimulator in (aanvullende figuur 2B-13).
- Plaats een buis van 50 ml met media in de geïsoleerde buishouder (aanvullende figuur 2A-9) en begin met perfusie bij ~ 0,5 ml / min door de peristaltische pompslang (aanvullende figuur 2E-8).
- Voeg een kleine hoeveelheid voorverwarmd medium toe aan een kleine weegboot (~ 2 ml). Breng één CS met myocyten over van de stimulatiekamer naar de weegboot. Breng de stimulatiekamer terug naar 37 °C in de 5% CO2-incubator .
- Verwijder de CS van de weegboot en veeg de onderkant voorzichtig af. Breng de CS over in een vers ingevette CS-kamer (aanvullende figuur 2A, F-10; zwarte pijl) en voeg voorzichtig een druppel media (~ 200 μL) toe aan de CS.
- Plaats een platina-elektrodebevestiging over de CS (aanvullende figuur 2F; grijze pijl) en leg een nieuwe CS over de bovenkant met behulp van een tang. Plaats een bovenste bevestiging (aanvullende figuur 2F; witte pijl) over de CS-sandwich en installeer vervolgens twee of vier # 0 pankopschroeven om de montage van de kamer te voltooien.
- Zodra de media in de pompbuis aanwezig zijn, bevestigt u de slang aan de voorverwarmer en sluit u de voorverwarmer aan op de CS-kamer die in stap 2.7 is geassembleerd. Begin met de perfusie op 0,5 ml /min en plaats een doekje onder de kamer om er zeker van te zijn dat er geen lekken zijn.
- Plaats de CS-kamer in de podiumadapter. De doordrenkte media worden verzameld aan het andere uiteinde van de kamer met buizen die zijn aangesloten op een vacuümsysteem. Schakel het verwarmingssysteem in (aanvullende figuur 2A, D-7) en breng de kamer, het objectief en de voorverwarmer gedurende ~ 5-10 minuten in evenwicht om een constante mediatemperatuur van 37 °C te bereiken. Visualiseer myocyten met het 40x water onderdompelingsobjectief op de microscoop tijdens deze evenwichtstijd.
- Activeer de pacingstimulator (aanvullende figuur 2B-13) door de spanning in te stellen op 1,5x de instelling die nodig is om 80% van de staafvormige cellen samen te trekken, wat meestal 35-40 V is. Stel de stimulatiefrequentie in op 0,2 Hz om de contractiele functie en myocytenoverleving te optimaliseren.
- Verzamel contractiele verkortings- en herverlengingssporen van continu doordrenkte en getemporeerde myocyten. Om verkortingsmetingen te verzamelen, gebruikt u een CCD-camera (aanvullende figuur 2A-4) die is aangesloten op een CCD-controller (aanvullende figuur 2B-5, C) en een speciale computer met een I/O-controllerkaart (aanvullende figuur 2B-14; zie materiaaltabel). Het platform meet sarcomeerverkorting in myocyten van ratten, hoewel vergelijkbare resultaten worden verkregen uit myocytenmetingen verzameld aan de lengteranden van myocyten (zie Ecklerle et al.14).
- Als u sarcomeerverkortingssporen wilt verzamelen, opent u de software op de computer, selecteert u OK en vervolgens Bestand > Nieuw. Bereid een schermsjabloon voor door Traces > Gebruikerslimieten bewerken > Sarcomere-lengte te selecteren en vervolgens maximum- en minimumwaarden in te stellen, die meestal tussen 2,0 μm en 1,5 μm liggen. Kalibreer de CCD-camera met een graticule van 0,01 mm voordat de myocyten worden gemeten (figuur 1D).
- Als u sporen van de sarcomeerlengte wilt vastleggen, selecteert u Bestand > Nieuw. Identificeer een samentrekkende myocyt en plaats de myocyt langs de lengteas van de camera, zodat het dwarsdoorsnedepatroon verticaal is (figuur 1B).
- Gebruik de computermuis om het vak 'area of interest' (ROI) (roze vak) over de myocyt te plaatsen (figuur 1C). Selecteer Verzamelen en starten om de contractiele functie vast te leggen. Record verkorting gedurende 60 s van elke myocyt bij lage stimulatiefrequenties (≤0,5 Hz).
- Registreer sarcomeerverkorting van 5-10 cellen per CS. Voer metingen uit bij 1 cel/CS als studies behandeling met agonisten/antagonisten omvatten. Bereid afzonderlijke voorverwarmde media en een ander, speciaal stuk perfusiebuis voor dat in een meerkanaals peristaltische pomp is geladen en volg de stappen 2.9.-2.14. om de impact van medicijn- of neurohormoonafgifte op de contractiele functie van myocyten te meten.
- Om verkorting over een reeks frequenties te meten, versnelt u myocyten op elke frequentie om steady-state verkorting te verkrijgen voordatu 5 opneemt. Verdubbel voor deze studies de perfusiesnelheid en begin met het opnemen van 15-20 s na stimulatie op een nieuwe frequentie om consistente steady-state contractiele responsen te verkrijgen voor frequenties in het bereik van 0,2 Hz en 2 Hz. Neem doorgaans niet meer dan 2 myocyten / CS op voor verkorting over het gegeven bereik van stimulatiefrequenties.
- Neem ten minste 7 contracties/cellen op om betrouwbare signaalgemiddelde gegevens te verkrijgen bij het analyseren van de opnames (zie stap 3.).
3. Gegevensanalyse van de contractiele functie in geïsoleerde myocyten
- Selecteer om te beginnen Bestand, kies een opgenomen tracering en selecteer vervolgens Openen. Selecteer Tab 1 (linkerkant) van de basistracering en stel vervolgens het gele paneel boven aan de trace in op Sarc-Length. Selecteer Traces en de schermsjabloon die in stap 2.12 zijn voorbereid.
- Als u een analysesjabloon wilt voorbereiden, selecteert u Bewerkingen, Monotone transiënte analyseopties, TTL-gebeurtenismarkering in het vak Definitie van t0 en de volgende opties in het menu: Basislijn (rustsarcomeerlengte), Vertreksnelheid ten opzichte van t0 (dep v), Piek (piekhoogte en %piekhoogte/basislijn of bl%piek h), Retoursnelheid ten opzichte van tPeak (ret v), Time to Peak 50% (TTP50%) met t0 en Time to Baseline 50% (TTR50%) met tPeak. Sla deze analyseopties op door Sjablonen te selecteren > Analysesjabloon opslaan met een id. Laad deze analysesjabloon voordat u elke tracering analyseert.
- Als u wilt beginnen met gegevensanalyse, selecteert u Markeringen > Gate > Tijdelijke > converteren vanuit gebeurtenismarkering > analysebereik. Stel nu het tijdsbereik in van -0,01 s tot 1,20 s voor myocyten met een tempo van 0,2 Hz (figuur 2A, rode markeringen op het onderste deel van het onbewerkte spoor). Selecteer een korter tijdsbereik voor myocyten gestimuleerd op hogere frequenties.
- Produceer een signaalgemiddelde tracering door Bewerkingen > gemiddelde gebeurtenissen te selecteren. Een signaalgemiddelde opname wordt weergegeven onder het oorspronkelijke basisspoor.
- Selecteer Tab 1 van de signaalgemiddelde tracering (linkerkant van het scherm) en selecteer vervolgens Markeringen in het bovenste menu, gevolgd door Transiënt toevoegen. Selecteer Bewerkingen in het bovenste menu en Monotone transiënte analyse om de signaalgemiddelde waarden voor baseline sarcomeerlengte, piekhoogte, bl%peak h, dep v, ret v, TTP50% en TTR50% weer te geven in het signaalgemiddelde weergavepaneel.
- Breng elke sarcomeertransiënte analyse over naar een spreadsheet voor de samengestelde analyse van meerdere myocyten door Export > Monotone Transiënte Analyse > Klembordstroom te selecteren. Plak deze gegevens in de spreadsheet voor elke tracering.
- Als u de signaalgemiddelde tracering wilt kopiëren, selecteert u > huidige tracering > Klembord exporteren > Opties en stelt u de decimalen in op 5, selecteert u vervolgens Tabs Scheidingsteken en klikt u op OK en OK. Plak de signaalgemiddelde sporen voor elke myocytenopname in een tweede spreadsheet.
4. Opname ca2+ transiënten in volwassen hartmyocyten van ratten
- Voordat u Ca2+ transiënten meet, schakelt u de platformcomponenten in die zijn beschreven in stap 2.2., samen met aanvullende fluorescentiebeeldvormingscomponenten (zie aanvullende componenten voor Ca2+ beeldvormingsanalyse in de tabel met materialen; Aanvullende figuur 2A-5,6; 2B-12).
- Bereid Fura-2AM stamoplossing met 1 mM Fura-2AM plus 0,5 M probenecide in dimethylsulfoxide (DMSO). Probenecide minimaliseert Fura-2AM lekkage15.
- Verdun de stamoplossing tot 5 μM Fura-2AM en 2,5 mM probenecide in 2,5 ml media (zie Materiaaltabel) in één putje van een 6-well plaat. Voeg alleen 2,5 ml media (geen Fura-2AM) toe aan drie extra putjes in de plaat, bedek de plaat met aluminiumfolie en verwarm de media voor op 37 °C.
- Breng een CS met myocyten over van de pacingkamer naar de put met Fura-2AM, dek af en breng de plaat terug naar de incubator van 37 °C met 5% CO2 gedurende 4 minuten. Monteer slangen in de perfusiepomp en perfuseer met media tijdens de Fura-2AM-laadperiode, zoals beschreven in stap 2.4.
- Schakel kamerverlichting uit of minimaliseer deze om fluorescentiefotobleaching te verminderen en het fluorescentiesignaal te optimaliseren. Verwijder de 6-wellsplaat uit de incubator en was vervolgens de CS gedurende 10 s in elk van de drie putjes die alleen media bevatten. Breng de CS over op een kleine weegboot met voorgewarmde media (geen toegevoegde Fura-2AM).
- Monteer de CS op een vers ingevette CS-kamer nadat u de onderkant van de CS voorzichtig hebt afgeveegd. Voeg voorzichtig een druppel media toe aan de CS en monteer vervolgens de elektrodebevestiging over de CS, gevolgd door een tweede CS en de bovenste houder. Gebruik #0 pan-head schroeven om de montage van de celkamer te voltooien, zoals beschreven in stap 2.6.-2.7.
- Sluit de pompslang gevuld met media aan op de voorverwarmer, sluit de voorverwarmer aan op de CS-kamer en plaats deze in een podiumadapter, zoals beschreven in stap 2.8. Verzamel de media met het vacuümslangsysteem en schakel het verwarmingssysteem in (aanvullende figuur 2A, D-7) om de kamer in evenwicht te brengen tot 37 °C, zoals beschreven in stap 2.8.-2.9.
- Activeer de pacingstimulator (aanvullende figuur 2B-13) ingesteld op 35-40 V en 0,2 Hz, zoals beschreven in stap 2.10.
- Voordat u een Ca2+ transiënt opneemt, schakelt u een kleine zaklamp of booklight in die in de buurt van het toetsenbord van de computer is gemonteerd om het toetsenbord te helpen zien. Noteer bovendien de fluorescentieachtergrond in een gebied zonder cardiale myocyten. Selecteer om te beginnen Bestand > Start > Nieuw, zoals beschreven in stap 2.12.
- Selecteer een ROI en stel één tabblad (of traceerbalk, linkerkant) in voor de onbewerkte teller en een tweede tabblad voor de onbewerkte noemer, gedefinieerd in het midden boven op elk tabblad. Neem de achtergrond op voor 10-20 s. Klik met de rechtermuisknop en sleep over één traceerbalkpaneel om de onbewerkte signaalgemiddelde teller- en noemerwaarden te verkrijgen. Voer deze waarden in door de bewerkingen > constanten te selecteren en voer de onbewerkte waarden in.
- Bereid een nieuwe schermsjabloon voor om zowel verkorting als Ca2+ transiënten te verzamelen. Voor de lengte van sarcomeer selecteert u Tab 1 en gebruikt u hetzelfde proces als beschreven in stap 2.13. Voor Ca2+ -afbeeldingen selecteert u Tab 2 > Ratio (boven het midden van het tabblad) > Traces > Gebruikerslimieten bewerken om de minimum- en maximumniveaus voor de verhouding in te stellen, die doorgaans tussen 1 en 5 worden ingesteld. Gebruik hetzelfde proces om de teller- en noemerbereiken voor tabbladen 3 en 4 (linkerkant) te definiëren.
- Plaats een ROI-vak boven een myocytenafbeelding, zoals beschreven in stap 2.14. Selecteer Bestand > Nieuwe > verzamelen. Selecteer nu Start om verkortings- en ratiometrische Ca2+ gegevens te verzamelen. Noteer ≥7 contracties/cel voor signaalgemiddelde analyse.
- Herhaal de achtergrondspooropname die wordt beschreven in stap 4.10. na opname van 2-4 myocyten. Noteer meestal 4-5 myocyten / CS of minder myocyten als er significante veranderingen zijn in de achtergrondmeting.
5. Data-analyse van Ca2+ transiënten in geïsoleerde myocyten.
- Open het gewenste bestand voor analyse en selecteer Sjablonen > Schermsjabloon voor verkorting plus Ca2+ transiënten. Selecteer vervolgens de tabbladen 1 en 2 (links) om respectievelijk de sarcomeerlengte en ca2+ -verhouding weer te geven. Selecteer Bewerkingen > constanten en voer de waarden van de teller en noemer in de ca2+ achtergrondtracering in.
- Bereid analysesjablonen voor voor verkorting plus Ca2+ transiënte gegevens. Selecteer tabblad 1 (linkerkant) en gebruik hetzelfde proces als beschreven in stap 3.2. om de sarcomeerlengteanalysesjabloon in te stellen.
- Selecteer tabblad 2 (linkerkant) en selecteer Bewerkingen, Monotone transiënte analyseopties, TTL-gebeurtenismarkering in het vak Definitie van t0 en de volgende opties in het menu: Basislijn (basale verhouding), Vertreksnelheid ten opzichte van t0 (dep v), Piek (piekhoogte en %piekhoogte/basislijn of bl%piek h), Vervalsnelheid ten opzichte van tPeak (ret v), Time to Peak 50% (TTP50%) met t0 en Time to Baseline 50% (TTR50%) met tPeak. Sla deze analyseopties op door Sjablonen en Analysesjabloon opslaan te selecteren met een nieuwe id-naam. Laad deze analysesjabloon voordat u elke tracering analyseert.
- Gebruik hetzelfde proces als beschreven in stap 3.3.-3.6. om het signaal te gemiddelden en vervolgens de sarcomeerlengte te analyseren, gevolgd door dezelfde stappen voor Ca2+ transiënten. Stel afzonderlijke markeringen in voor de lengte van de sarcomeer en voor het ca2+ transiënte ratiospoor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Contractiele functiestudies worden uitgevoerd op myocyten van ratten vanaf de dag na isolatie (dag 2) tot 4 dagen na isolatie. Hoewel myocyten de dag na isolatie (d.w.z. dag 2) kunnen worden geregistreerd, zijn vaak langere kweektijden nodig na genoverdracht of behandelingen om de contractiele functie te wijzigen8. Voor myocyten die langer dan 18 uur na isolatie zijn gekweekt, helpt het in sectie 1 beschreven pacingprotocol t-tubuli en consistente verkortings- en verlengingsresultaten te behouden.
Een representatief deel van een CS met myocyten voor verkortingsstudies wordt weergegeven in figuur 1A, samen met een goed gepositioneerde myocyt voorafgaand aan het instellen van de ROI (figuur 1B). Zodra een ROI is geïdentificeerd (figuur 1C; roze vak), helpt de algoritme-informatie onder de myocyt ook om de positionering van myocyten voorafgaand aan de opname te optimaliseren. In het bijzonder is de lineaire optische dichtheid (LOD; zwarte lijn) een indicator voor het aantal en de afstand van sarcomeres, en een scherp vermogensspectrum in het snelle Fouriertransformatiespoor (FFT, rode lijn) helpt om optimale uitlijning te bereiken voor de opname van verkorting en herverlenging. Het graticulepatroon dat wordt gebruikt voor de kalibratie van sarcomeerlengte (en randdetectie) is weergegeven in figuur 1D. Een typische uitgelijnde opname van sarcomeerlengteverkorting wordt weergegeven in figuur 2A (bovenpaneel), samen met de signaalgemiddelde analyse beschreven in sectie 3 (onderste paneel).
Disfunctie wordt vaak gedetecteerd in myocyten wanneer er in vivo disfunctie is in diermodellen. Systolische disfunctie waargenomen door echocardiografie als reactie op drukoverbelasting (PO)13 wordt bijvoorbeeld ook gedetecteerd in myocytenverkortingsstudies5. Om gegevenssporen te illustreren, worden representatieve ruwe (figuur 2; bovenste paneel) en signaalgemiddelde (figuur 2; onderste paneel) sporen verkregen bij 0,2 Hz weergegeven voor myocyten van sham- (figuur 2A) en PO-behandelde (figuur 2B) ratten. Om te testen of de myocytenfunctie na PO kon worden gered, werd virale gemedieerde genoverdracht ten tijde van myocytenisolatie ook gebruikt om endogene cardiale troponine I (cTnI) te vervangen door een fosfo-mimetische cTnI T144D-substitutie (T144D) in het sarcomeer16. De eerste analyse toont aan dat de PO-geïnduceerde vermindering van de contractiele functie (tabel 1, bovenste paneel) terugkeerde naar schijnniveaus in PO-myocyten 4 dagen na genoverdracht van cTnIT144D (tabel 1; onderste paneel).
Dit platform kan ook worden gebruikt om Ca2+ transiënten te meten, samen met verkorting in geïsoleerde myocyten. Verkorting en Ca2+ werden niet geregistreerd na PO omdat PO de hechting van rattenmyocyten aan laminine13 vermindert, en een vergelijkbaar model toonde eerder aan dat veranderde Ca2+ behandeling zich ontwikkelt op een vergelijkbaar tijdstip17. In plaats daarvan werden representatieve experimenten uitgevoerd in Fura-2AM-geladen myocyten geïsoleerd van 2-3 maanden oude ratten. Een representatieve registratie en signaalgemiddelde sporen zijn weergegeven in figuur 3, samen met de gegevensanalyse in tabel 2. Voor deze reeks experimenten werden myocyten geïsoleerd uit volwassen ratten bestudeerd 4 dagen na adenoviral-gemedieerde genoverdracht (multipliciteit van infectie = 100) van cTnIT144D of wild-type cTnI. Zowel sarcomeerverkorting als Ca2+ transiënten werden gemeten na het laden van myocyten met Fura-2AM. Genoverdracht van cTnIT144D verbeterde piekverkorting en verhoogde diastolische Ca2+ niveaus in vergelijking met cTnI in deze initiële studies (tabel 2). Hoewel een uitgebreidere analyse nodig is, suggereren de eerste resultaten dat in vivo vervanging door cTnIT144D een complex cardiaal fenotype zou kunnen produceren als gevolg van veranderingen in zowel contractiele functie als Ca2+ behandeling in de loop van de tijd.
Figuur 1: Cardiale myocyten van volwassen ratten die worden gebruikt voor functionele studies. (A) Representatieve geïsoleerde cardiale myocyten van een volwassen rat (schaalbalk = 50 μm). Arrow wijst naar een representatieve myocyt die is afgebeeld voor contractiele functieanalyse. (B) Representatieve myocyt met een ROI (roze) aan de zijkant (schaalbalk = 20 μm). (C) Representatieve myocyt met een ROI (bovenste paneel), het sarcomeerpatroon voor deze myocyt (onderste paneel, blauw; schaalbalk = 20 μm) en de scherpe piek van het vermogensspectrum (onderste paneel, rood). (D) Schermopname van 0,01 mm graticule om de verkortingsmetingen te kalibreren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatieve opnames van rattenmyocyten. Een ruwe opname (bovenste paneel) en signaalgemiddelde (onderste paneel) trace geregistreerd bij 0,2 Hz in myocyten van (A) sham- en (B) drukoverbelasting (PO) -behandelde ratten. Myocyten werden 18-20 weken na de operatie geïsoleerd, met PO geproduceerd door supra-renale coarctatie13. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Representatieve registratie en analyse van sarcomeerlengte (SL) en Ca2+ transiënten van Fura-2AM-geladen volwassen hartmyocyten. (A) Ruwe sporen voor SL, Ca2+ transiënte ratio (ratio), en de teller- en noemersporen die worden gebruikt om de Ca2+ transiënte ratio te produceren. (B) Een voorbeeld van signaalgemiddelde sporen voor SL (bovenste spoor) en de Ca2+ transiënte ratio (onderste spoor). (C) Sporen worden geanalyseerd op sarcomeerlengte (SL) en de Ca2+ transiënte ratio met behulp van het monotone sporenalgoritme. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Rattengroep | Schijn (n=30) | Po (n=32) |
| Rustende sarcomeer lengte (mm; SL) | 1.761 + 0.006 | 1.748 + 0.004 |
| piekhoogte (% van de basislijn) | 9.003 + 0.409 | 6.680 + 0.552* |
| Piek amplitude (mm) | 0.159 + 0.007 | 0.117 + 0.010* |
| Verkortingssnelheid (mm/s) | -4.674 + 0.285 | -4.143 + 0.335 |
| Herverlengingssnelheid (mm/s) | 3.251 + 0.223 | 2.706 + 0.273 |
| Tijd om te pieken (ms; TTP) | 60 + 2 | 59 + 3 |
| Tijd tot 50% herverlenging (ms; TTR50%) | 35 + 2 | 37 + 3 |
| Rattengroep | Sham + cTnIT144D (n = 14) | PO + cTnIT144D (n=17) |
| Rustende sarcomeer lengte (mm; SL) | 1.768 + 0.009 | 1.776 + 0.004 |
| piekhoogte (% van de basislijn) | 9.038 + 1.339 | 8.414 + 0.960 |
| Piek amplitude (mm) | 0.160 + 0.023 | 0.149 + 0.016 |
| Verkortingssnelheid (mm/s) | -5.972 + 0.711 | -4.173 + 0.726 |
| Herverlengingssnelheid (mm/s) | 3.925 + 0.577 | 3.055 + 0.403 |
| Tijd om te pieken (ms; TTP) | 51 + 5 | 59 + 2 |
| Tijd tot 50% herverlenging (ms; TTR50%) | 31 + 3 | 32 + 2 |
Tabel 1: Vergelijking van de contractiele functie in cardiale myocyten als reactie op drukoverbelasting (PO) en genoverdracht. Myocytenverkortingsresultaten zijn van sham- en PO-rattenharten 18-20 weken na de operatie (bovenste paneel)5,13 en myocyten van sham- en PO-ratten 4 dagen na cTnIT144D-genoverdracht (onderste paneel). De contractiele functie wordt 4 dagen na myocytenisolatie/genoverdracht in alle groepen gemeten. De resultaten worden uitgedrukt als gemiddelde ± SEM (n = aantal myocyten). Elke set van schijn- en PO-gegevens wordt vergeleken door de t-test van een student, waarbij * p < 0,05 als statistisch significant wordt beschouwd. Piekamplituderesultaten voor sham- en PO-myocyten alleen werden eerder gemeld in Ravichandran et al.5.
| Sarcomere lengte analyse | ||
| Genoverdrachtsgroep | cTnI (n=21) | cTnIT144D (n=16) |
| Rustende sarcomeer lengte (mm; SL) | 1.81 + 0.01 | 1.81 + 0.01 |
| Piek amplitude (mm) | 0.11 + 0.01 | 0.14 + 0.02* |
| Verkortingssnelheid (mm/s) | -4.29 + 0.42 | -4.67 + 0.77 |
| Herverlengingssnelheid (mm/s) | 2.92 + 0.43 | 3.71 + 0.64 |
| Tijd om te pieken (ms; TTP) | 50 + 4 | 84 + 28 |
| Tijd tot 50% herverlenging (ms; TTR50%) | 37 + 4 | 35 + 6 |
| Ca2+ transiënte analyse | ||
| Genoverdrachtsgroep | cTnI (n=21) | cTnIT144D (n=19) |
| Rusten Ca2+ Ratio | 0.89 + 0.02 | 1.04 + 0.04* |
| Peak Ca2+ Verhouding | 0.50 + 0.05 | 0.42 + 0.07 |
| Ca2+ Transient Rate (D/sec) | 45.24 + 5.85 | 40.53 + 10.95 |
| Ca2+ Vervalsnelheid (D/s) | -4.91 + 0.99 | -2.87 + 0.57 |
| Tijd tot piek Ca2+ (ms; TTP) | 34 + 2 | 41 + 3 |
| Tijd tot 50% Ca2+ Verval (ms; TTD50%) | 101 + 8 | 117 + 6 |
Tabel 2: Contractiele functie en Ca2+ transiënten bij volwassen rattenmyocyten 4 dagen na cTnIT144D-genoverdracht. Een analyse van de contractiele functie (bovenste paneel) en Ca2+ transiënten (onderste paneel) wordt getoond in myocyten na genoverdracht van cTnIT144D in vergelijking met wild-type cTnI. Myocyten worden geïsoleerd uit volwassen ratten van 2-3 maanden oud en de gegevens worden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM (n = aantal myocyten). Statistische vergelijkingen van contractiele functie (links) en Ca2+ transiënten (rechts) worden uitgevoerd met behulp van een ongepaarde Student's t-test met significantie ingesteld op *p < 0,05.
Aanvullende figuur 1: Componenten van het pacingsysteem voor myocyten die zijn geplateerd op met laminine gecoate CS'en. (A) Aangepaste pacingkamer met platina-elektroden in elke kamer. (B) Pacing kamer met de eerste vier kamers gevuld met media. (C) Pacingkamer bevestigd aan bananen-jack kabels, die zijn aangesloten op de kamer en (D) de stimulator. (E) De verbinding tussen de stimulator (rechts) en de incubator van 37 °C (links). Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2: Componenten die nodig zijn voor myocytencontractiele functie en/of Ca2+ transiënte metingen. (A) Het contractiele functieplatform dat elke component toont, met de genummerde items die in meer detail worden uitgelegd in de materiaaltabel. Componenten in het platform zijn onder meer een antitrillingstabel (# 1), omgekeerde brightfield-microscoop (# 2,3), CCD-camera (# 4), CCD-controller en xenonvoeding (# 5), dubbele emissielichtbron (# 6), temperatuurregelaar (# 7), peristaltische pomp (# 8), geïsoleerde buishouder (# 9), coverslip-gemonteerde perfusiekamer (# 10) en vacuümsysteem (# 11). (B) Aanvullende componenten zijn de fluorescentie-interface (# 12), kamerstimulator (# 13) en pc-computer (# 14), die in meer detail worden uitgelegd in de tabel met materialen. Close-upweergaven van genummerde items in paneel A worden weergegeven in C-F. (C) Weergave van de xenonvoeding (links) en CCD-controller (rechts). D) Temperatuurregelaar. (E) Peristaltische pomp. (F) Weergave van de basis voor de CS-perfusiekamer (zwarte pijl), de platina-elektrodebevestiging (grijze pijl) en de bovenste houder (witte pijl) met #0 pankopschroeven. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het chronische pacingprotocol dat in stap 1 wordt beschreven, verlengt de nuttige tijd voor het bestuderen van geïsoleerde myocyten en het beoordelen van de impact van langere behandelingen. In ons laboratorium werden consistente resultaten verkregen tot 4 dagen na isolatie bij het meten van de contractiele functie met behulp van sarcomeerlengte op chronisch getemporiseerde myocyten. De contractiele functie van myocyten verslechtert echter snel bij gebruik van media ouder dan 1 week om myocyten te versnellen.
Voor contractiele functiestudies worden de gegevens verzameld bij 37 °C, wat in de buurt komt van de lichaamstemperatuur voor ratten. Om de levensvatbaarheid van myocyten te optimaliseren en consistente sporen voor elke myocyt te verkrijgen, worden deze experimenten uitgevoerd met een pacingfrequentie die lager is dan de fysiologische hartslag van ~ 5 Hz bij ratten. Deze instellingen produceren consistente contractiele functiegegevens, maar de kamertemperatuur en/of pacingfrequentie kunnen worden aangepast als de verkortingssporen consistent blijven over meerdere CS'en die dezelfde behandelingsgroep van myocyten bevatten. Bovendien worden optimale resultaten verkregen door myocyten te kiezen die blebs missen, volledig zijn gehecht aan een CS en samentrekken aan beide uiteinden van een staafvormige cel. Cellen die aan slechts één uiteinde zijn bevestigd, cellen met meerdere blebs en / of myocyten die aan slechts één uiteinde samentrekken, zijn niet wenselijk en zijn vaak moeilijker op te nemen vanwege achtergrondbewegingen. Voor deze studies zijn ≥20 sarcomeren opgenomen in de ROI om een scherpe piek in het vermogensspectrum, reproduceerbare rustsarcomeerlengtes en een optimale signaal / ruisverhouding voor het verkortingsspoor te bereiken. Een ROI met slechts zeven sarcostolen kan worden gebruikt als de piek van het vermogensspectrum scherp blijft. De rustsarcomeerlengte in geïsoleerde rattenmyocyten varieert meestal van 2,00-1,80 μm. Als een rustsarcomeerlengte minder dan 1,5 μm is, is een actieve contractie niet realistisch op basis van ons begrip van sarcomeerarchitectuur18 en is meestal het resultaat van suboptimale myocytenoriëntatie.
De meting van contractiele functie met of zonder Ca2+ transiënte metingen in intacte myocyten is een benadering met een hogere doorvoer die minder investeringen vereist in het ontwikkelen van de technische expertise die nodig is voor krachtmetingen in intacte enkele cellen11. Intacte myocytenstudies richten zich ook uitsluitend op de myocytenfunctie, zonder de bijdrage van andere celtypen in meercellige preparaten2. Een opkomend gebied op dit gebied is de ontwikkeling van analyse met een hogere doorvoer door gelijktijdig verkorting en /of Ca2+ transiënten in meerdere intacte myocyten te meten om de screening van therapeutische middelen op cellulair niveau te versnellen voorafgaand aan een uitgebreidere in vivo analyse.
Contractiele functie en Ca2+ voorbijgaande metingen zijn ook mogelijk in intacte myocyten geïsoleerd van andere knaagdiermodellen zoals muizen, hoewel er enkele belangrijke overwegingen en verschillen zijn in vergelijking met rattenmyocyten. Muismyocyten zijn levensvatbaar in cultuur gedurende 24-36 uur, maar de levensvatbaarheid neemt geleidelijk af in myocyten gekweekt gedurende meer dan 48 h19. Dit verkorte kweekinterval moet worden overwogen bij het gebruik van vectorgebaseerde genoverdracht, vooral voor myofilamenteiwitten die een halfwaardetijd hebben in dagen in plaats van uren20. In tegenstelling tot rattenmyocyten zijn de succesvolle isolatie en kweek van muismyocyten ook afhankelijk van de toevoeging van myosine ATPase-remmers, zoals 2,3-butanedione monoxime of blebbistatine, aan kweekmedia19. Als gevolg hiervan is chronisch pacing geen haalbare optie in myocytenculturen van muizen. Een langere evenwichtstijd van 15-20 minuten is ook nodig om de functionele impact van deze myosineremmers op geïsoleerde muismyocyten te verwijderen. Ten slotte worden muismyocyten optimaal getemporiseerd op 0,5 Hz om reproduceerbare verkortingssporen te verkrijgen in vergelijking met de 0,2 Hz die wordt gebruikt voor rattenmyocyten.
In studies bij PO-behandelde ratten wordt contractiele disfunctie consequent gedetecteerd met laagfrequente pacing in myocyten van ratten. Een grotere frequentieafhankelijke vermindering van verkorting wordt ook gedetecteerd in myocyten na PO in vergelijking met schijnratten wanneer er sprake is van in vivo contractiele disfunctie 5,13. Tijdens een onderzoek met behulp van een reeks frequenties, produceerde het verdubbelen van de pompsnelheid om voldoende media te bieden steady-state verkorting binnen 15-20 s na het veranderen van de stimulatiefrequentie tussen 0,2 en 2 Hz. Ratmyocyten reageren ook op kortetermijnstimulatie bij hogere frequenties tot 8 Hz, hoewel de levensvatbaarheid van cellen snel verslechtert bij deze hogere frequenties. Over het algemeen is gebleken dat de contractiele functie van myocyten een reproduceerbare benadering is om in vivo cardiale disfunctie in rattenmodellen, zoals PO, te bevestigen of te valideren in vergelijking met met schijn behandelde ratten (tabel 1; zie Kim et al.13). Bovendien kan dit platform testen of een behandeling gericht op myocyten de contractiele functie herstelt of schaadt voordat duurdere en / of bewerkelijke in vivo benaderingen worden nagestreefd. Zowel acute bevalling als langere blootstelling aan therapeutische middelen en/of na genafgifte tijdens primaire kweek zijn mogelijk met behulp van deze aanpak. Genoverdrachtsexperimenten om endogene cTnI te vervangen door cTnIT144D wijzen bijvoorbeeld op geen significante verandering in verkortingsamplitude in myocyten van schijnratten. CTnIT144D daarentegen herstelt de piekverkortende amplitude in de richting van schijnwaarden in myocyten van po-behandelde ratten (tabel 1). Een inherente zwakte van deze aanpak is de afwezigheid van de typische belasting die aanwezig is in myocyten onder in vivo omstandigheden. Als gevolg hiervan kunnen reacties verschillen van belastingsafhankelijke functionele responsen, en het voorbeeldexperiment geeft aan dat in vivo benaderingen nodig zijn om verder te onderzoeken of cTnIT144D de hartprestaties tijdens PO verbetert.
Het meten van zowel verkorting als Ca2+ transiënten in dezelfde myocyt is een voordeel van dit platform. De richting van verandering kan bijvoorbeeld verschillen voor Ca2+ transiënten in vergelijking met de contractiele functie. Zoals te zien is in tabel 2, neemt de piekverkorting significant toe na genoverdracht van cTnIT144D naar myocyten van 2-3 maanden oude ratten. Deze uitkomst verschilt van de gegevens die zijn verkregen bij oudere, met sham behandelde myocyten (tabel 1) en kan verband houden met ratten in de leeftijdvan 5 jaar. Er zijn echter verdere tests nodig om deze interpretatie te bewijzen. De gegevens in tabel 2 laten ook zien dat cTnIT144D de piek Ca2+ amplitude niet verandert en in plaats daarvan de neiging heeft om de Ca2+ vervalsnelheid te vertragen en rust Ca2+ te verhogen. Deze bevindingen suggereren dat cTnIT144D-expressie de contractiele functie verbetert, terwijl de Ca2+ fietsmachines dit effect compenseren om dit effect te dempen. Deze resultaten benadrukken het vermogen van deze benadering om onderscheid te maken tussen veranderingen in contractiele functie en Ca2+ fietsen. Hoewel de hier gepresenteerde specifieke resultaten nog niet definitief zijn, bieden ze een solide reden voor het ontwikkelen van een genetisch diermodel om myocardiale cTnIT144D uit te drukken en te evalueren of de expressie ervan disfunctie veroorzaakt door PO in de toekomst afstompt. Een laatste observatie uit de Ca2+ transiënte gegevens is dat fluorescerende kleurstoffen zoals Fura-2AM de contractiele functiekinetiek in myocyten veranderen21. Hoewel de relatieve respons die door een bepaalde behandeling of diermodel wordt geproduceerd vergelijkbaar is met fura-2-geladen myocyten, mogen deze resultaten niet worden gecombineerd met verkortingsmetingen die zijn uitgevoerd in afwezigheid van Fura-2AM. Om het gebruik van Fura-2AM voor Ca2+ transiënte analyse te optimaliseren, meet het laboratorium meestal verkorting in afwezigheid van Fura-2AM en voert het een subset van experimenten uit om Ca2+ transiënten te meten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen concurrerende financiële belangen of andere belangenconflicten.
Acknowledgments
Dit werk wordt ondersteund door national institutes of health (NIH) subsidie R01 HL144777 (MVW).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MEDIA | |||
| Bovine serum albumin | Sigma (Roche) | 3117057001 | Final concentration = 0.2% (w/v) |
| Glutathione | Sigma | G-6529 | Final concentration = 10 mM |
| HEPES | Sigma | H-7006 | Final concentration = 15 mM |
| M199 | Sigma | M-2520 | 1 bottle makes 1 L; pH 7.45 |
| NaHCO3 | Sigma | S-8875 | Final concentration = 4 mM |
| Penicillin/streptomycin | Fisher | 15140122 | Final concentration = 100 U/mL penicillin, 100 μg/mL streptomycin |
| REAGENTS SPECIFICALLY FOR Ca2+ IMAGING | |||
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Fura-2AM | Invitrogen (Molecular Probes) | F1221 | 50 μg/vial; Prepare stock solution of 1 mM Fura-2AM + 0.5 M probenicid in DMSO; Final Fura2-AM concentration in media is 5 μM |
| Probenicid | Invitrogen (Fisher) | P36400 | Add 7.2 mg probenicid (0.5 M) to 1 mM Fura-2AM stock; Final concentration in media is 2.5 mM |
| MATERIALS FOR RAT MYOCYTE PACING | |||
| #1 22 mm2 glass coverslips | Corning | 2845-22 | |
| 3 x 36 inch cables with banana jacks | Pomona Electronics | B-36-2 | Supplemental Figure 1, panel C |
| 37oC Incubator with 95% O2:5% CO2 | Forma | 3110 | Supplemental Figure 1, panel E. Multiple models are appropriate |
| Class II A/B3 Biosafety cabinet with UV lamp | Forma | 1286 | Multiple models are appropriate |
| Forceps - Dumont #5 5/45 | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| Hot bead sterilizer | Fine Science Tools | 1800-45 | |
| Low magnification inverted microscope | Leica | DM-IL | Position this microscope adjacent to the incubator to monitor paced myocytes for contraction at the start of pacing and after media changes; 4X and 10X objectives recommended |
| Pacing chamber | Custom | Supplemental Figure 1, panel A. The Ionoptix C-pace system is a commercially available alternative or see 22 | |
| Stimulator | Ionoptix | Myopacer | Supplemental Figure 1, panel D. |
| MATERIALS FOR CONTRACTILE FUNCTION and/or Ca2+ IMAGING ANALYSIS | ID in Supplemental Figure 2 & Alternatives/Recommended Options | ||
| Additional components for Ca2+ imaging analysis | Ionoptix | Essential system components: -- Photon counting system -- Xenon power supply with dual excitation light source -- Fluorescence interface | - The photon counting system contains a photomultiplier (PMT) tube and dichroic mirrorand is installed adjacent to the CCD camera (panel A #4). - The power supply for the xenon bulb light source (see panel A #5 and panel C, left) is integrated with a dual excitation interface (340/380 nm excitation and 510 nm emission) shown in panel A #6. - The fluorescence interface between the computer and light source is shown in panel B, #12. |
| CCD camera with image acquisition hardware and software (240 frames/s) | Ionoptix | Myocam with CCD controller | Myocam and CCD controller are shown in Supplemental Fig. 2, panel A #4 and panel A #5 & panel C #5 (right), respectively. The controller is integrated with a PC computer system (panel B #14). |
| Chamber stimulator | Ionoptix | Myopacer | Panel B, #13; Alternative: Grass model S48 |
| Coverslip mounted perfusion chamber | Custom chamber for 22 mm2 coverslip with silicone adapter and 2-4 Phillips pan-head #0 screws (arrow, panel F) | Panel A #10 & panel F; Chamber temperature is calibrated to 37oC using a TH-10Km probe and the TC2BIP temperature controller (see temperature controller). Commercial alternatives: Ionoptix FHD or C-stim cell chambers; Cell MicroControls culture stimulation system | |
| Dedicated computer & software for data collection and analysis of function/Ca2+ transients | Ionoptix | PC with Ionwizard PC board and software | Panel B, #14; Contractile function is measured using either SarcLen (sarcomere length) or SoftEdge (myocyte length) acquisition modules of the IonWizard software. The Ionwizard software also includes PMT acquisition software for ratiometric Ca2+ imaging in Fura-2AM-loaded myoyctes. - A 4 post electronic rack mount cabinet and shelves are recommended for housing the somputer and cell stimulator. The fluorescence interface for Ca2+ imaging also is housed in this cabinet (see below). |
| Forceps - Dumont #5 TI | Fine Science Tools | 11252-40 | Panel F |
| Insulated tube holder for media | Custom | Panel A #9; This holder is easily assembled using styrofoam & a pre-heated gel pack to keep media warm | |
| Inverted brightfield microscope | Nikon | TE-2000S | Install a rotating turret for epi-fluorescence (Panel A #2) for Ca2+ imaging. A deep red (590 nm) condenser filter also is recommended to minimize fluorescence bleaching during Ca2+ imaging. |
| Isolator Table | TMC Vibration Control | 30 x 36 inches | Panel A, #1; Desirable: elevated shelving, Faraday shielding |
| Microscope eyepieces & objective | Nikon | 10X CFI eyepieces 40X water CFI Plan Fluor objective | Panel A #3; 40X objective: n.a. 0.08; w.d. 2 mm. A Cell MicroControls HLS-1 objective heater is mounted around the objective (see temperature controller below). NOTE: water immersion dispensers also are now available for water-based objectives. |
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | Panel A #8 and panel E |
| small weigh boat | Fisher | 08-732-112 | |
| Temperature controller | Cell MicroControls | TC2BIP | Panel A #7; Panel D. This temperature controller heats the coverslip chamber to 37oC. A preheater and objective heater are recommended for this platform. A Cell MicroControls HPRE2 preheater and HLS-1 objective heater are controlled by the TC2BIP temperature controller for our studies. |
| Under cabinet LED light with motion sensor | Sylvania | #72423 LED light | Recommended for data collection during Ca2+ transient imaging under minimal room light.. Alternative: A clip on flashlight/book light with flexible neck - multiple suppliers are available. |
| Vacuum line with in-line Ehrlenmeyer flask & protective filter | Fisher | Tygon tubing - E363; polypropylene Ehrlenmeyer flask - 10-182-50B; Vacuum filter - 09-703-90 | Panel A #11 |
References
- Reihle, C., Bauersachs, J. Small animal models of heart failure. Cardiovascular Research. 115 (13), 1838-1849 (2019).
- Peter, A. K., Bjerke, M. A., Leinwand, L. A. Biology of the cardiac myocyte in heart disease. Molecular Biology of the Cell. 27 (14), 2149-2160 (2016).
- Rossman, E. I., et al. Abnormal frequency-dependent responses represent the pathophysiologic signature of contractile failure in human myocardium. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 36 (1), 33-42 (2004).
- McDonald, K. S., Hanft, L. M., Robinett, J. C., Guglin, M., Campbell, K. S. Regulation of myofilament contractile function in human donor and failing hearts. Frontiers in Physiology. 11, 468 (2020).
- Ravichandran, V. S., Patel, H. J., Pagani, F. D., Westfall, M. V. Cardiac contractile dysfunction and protein kinase C-mediated myofilament phosphorylation in disease and aging. The Journal of General Physiology. 151 (9), 1070-1080 (2019).
- Chaudhary, K. W., et al. Altered myocardial Ca2+ cycling after left ventricular assist device support in failing human heart. Journal of the American College of Cardiology. 44 (4), 837-845 (2004).
- Walker, C. A., Spinale, F. G. The structure and function of the cardiac myocyte: A review of fundamental concepts. The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 118 (2), 375-382 (1999).
- Lang, S. E., Westfall, M. V. Gene transfer into cardiac myocytes. Methods in Molecular Biology. 1299, 177-190 (2015).
- Davis, J., et al. Designing heart performance by gene transfer. Physiological Reviews. 88 (4), 1567-1651 (2008).
- Sweitzer, N. K., Moss, R. L. Determinants of loaded shortening velocity in single cardiac myocytes permeabilized with a-hemolysin. Circulation Research. 73 (6), 1150-1162 (1993).
- Yasuda, S., et al. Unloaded shortening increases peak of Ca2+ transients but accelerates their decay in rat single cardiac myocytes. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 285 (2), 470-475 (2003).
- Racca, A. W., et al. Contractile properties of developing human fetal cardiac muscle. The Journal of Physiology. 594 (2), 437-452 (2016).
- Kim, E. H., et al. Differential protein expression and basal lamina remodeling in human heart failure. Proteomics Clinical Applications. 10 (5), 585-596 (2016).
- Eckerle, L. G., Felix, S. B., Herda, L. R. Measurement of antibody effects on cellular function of isolated cardiomyocytes. Journal of Visualized Experiments. (73), e4237 (2013).
- Robbins, H., Koch, S. E., Tranter, M., Rubinstein, J. The history and future of probenecid. Cardiovascular Toxicology. 12 (1), 1-9 (2012).
- Sakthivel, S., et al. In vivo and in vitro analysis of cardiac troponin I phosphorylation. Journal of Biological Chemistry. 280 (1), 703-714 (2005).
- Qi, M., et al. Downregulation of sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPase during progression of left ventricular hypertrophy. The American Journal of Physiology. 272 (5), 2416-2424 (1997).
- Sonnenblick, E. H., Spiro, D., Spotnitz, H. M. The ultrastructure basis of Starling's law of the heart: the role of the sarcomere is determining ventricular size and stroke volume. American Heart Journal. 68 (3), 336-346 (1964).
- Kabaeva, Z., Zhao, M., Michele, D. E. Blebbistatin extends culture life of adult mouse cardiac myocytes and allows efficient and stable transgene expression. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 294 (4), 1667-1674 (2008).
- Zak, R. Metabolism of myofibrillar proteins in the normal and hypertrophic heart. Basic Research in Cardiology. 72 (2-3), 235-240 (1977).
- Palmer, B. M., Thayer, A. M., Snyder, S. M., Moore, R. L. Shortening and [Ca2+] dynamics of left ventricular myocytes isolated from exercise-trained rats. Journal of Applied Physiology. 85 (6), 2159-2168 (1998).
