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Artículo de método

Medición repetida y en tiempo real del crecimiento del músculo esquelético en peces cebra vivos individuales sometidos a actividad eléctrica alterada

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DOI:

10.3791/64063

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16 de junio de 2022

 ,  ,  , 
1Randall Centre for Cell and Molecular Biophysics, School of Basic and Medical Biosciences, King’s College London

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

La claridad óptica es una gran ventaja para el trabajo biológico y fisiológico celular en el pez cebra. Se describen métodos robustos para medir el crecimiento celular en animales individuales que permiten nuevos conocimientos sobre cómo el crecimiento del músculo esquelético y los tejidos vecinos se integran con el crecimiento de todo el cuerpo.

Resumen

Se pueden utilizar varios métodos para visualizar células individuales en todo el cuerpo de peces cebra embrionarios vivos, larvales o juveniles. Mostramos que los peces vivos con membranas plasmáticas marcadas con fluorescencia se pueden escanear en un microscopio de escaneo láser confocal para determinar el volumen de tejido muscular y el número de fibras musculares presentes. Se describen y validan enfoques eficientes para la medición del número y tamaño de células en animales vivos a lo largo del tiempo contra métodos de segmentación más arduos. Se describen métodos que permiten el control de la actividad eléctrica muscular y, por lo tanto, contráctil. La pérdida de la actividad contráctil del músculo esquelético redujo en gran medida el crecimiento muscular. En larvas, se describe un protocolo que permite la reintroducción de la actividad contráctil evocada eléctricamente modelada. Los métodos descritos minimizan el efecto de la variabilidad interindividual y permitirán el análisis del efecto de estímulos eléctricos, genéticos, farmacológicos o ambientales en una variedad de parámetros de crecimiento celular y fisiológico en el contexto del organismo vivo. Posteriormente se puede realizar un seguimiento a largo plazo de los efectos medidos de una intervención definida en los primeros años de vida en los individuos.

Introducción

El crecimiento regulado del tejido, que comprende el aumento del número de células (hiperplasia) y / o el tamaño de las células (hipertrofia), es un factor crucial en el desarrollo, la regeneración y la adaptación ecológica y evolutiva. A pesar de los enormes avances en la comprensión genética molecular de la biología celular y del desarrollo en las últimas décadas, la comprensión mecanicista de la regulación del tamaño de los tejidos y órganos todavía está en su infancia. Una de las razones de esta laguna en el conocimiento es la dificultad de cuantificar el crecimiento de tejidos en organismos vivos con la precisión espacial y temporal necesaria.

Varios aspectos del crecimiento de organismos enteros se pueden medir repetidamente a lo largo del tiempo, revelando curvas de crecimiento para cada individuo 1,2,3,4,5. Los métodos de exploración cada vez más sofisticados, como la absorciometría dual de rayos X (DXA), la tomografía computarizada (TC) y la resonancia magnética (RM), permiten el seguimiento del crecimiento de órganos completos y otras regiones del cuerpo (por ejemplo, músculos esqueléticos identificados individualmente) en individuos individuales, tanto humanos como en organismos modelo 6,7,8,9,10 . Sin embargo, estos métodos aún no tienen la resolución para revelar células individuales y, por lo tanto, los vínculos entre los comportamientos celulares y el crecimiento a nivel de tejido han sido difíciles de discernir. Para establecer tales vínculos, los estudios tradicionales a menudo se han basado en cohortes de animales individuales similares, algunos de los cuales se sacrifican en puntos de tiempo sucesivos y luego se analizan en detalle citológico. Tales enfoques requieren promediar los cambios observados entre grupos de individuos (preferiblemente similares, pero no obstante variables) y, por lo tanto, sufren de una falta de resolución temporal y espacial, lo que dificulta encontrar eventos correlacionados a nivel celular que sugieran causa y efecto.

Los estudios sobre organismos modelo de invertebrados, inicialmente en C. elegans y D. melanogaster, han eludido estos problemas mediante el desarrollo de microscopía óptica para lograr la resolución celular y medir con precisión el crecimiento a lo largo del tiempo en individuos individuales. Tales estudios han revelado comportamientos de linaje celular sorprendentemente invariantes en el crecimiento de estos pequeños organismos modelo 11,12,13,14,15,16,17. Sin embargo, muchos animales, incluidos todos los vertebrados, tienen linajes celulares indeterminados y controlan el crecimiento de los tejidos mediante misteriosos procesos de retroalimentación que sirven para convertir el programa de crecimiento codificado genéticamente en un organismo tridimensional funcional con todos sus tejidos y órganos constituyentes adecuadamente emparejados en tamaño. Para comprender estos complejos procesos de crecimiento, es deseable obtener imágenes de tejidos u órganos completos a lo largo del tiempo en individuos individuales que puedan manipularse experimentalmente mediante intervenciones genéticas, farmacológicas u otras en el momento de su elección y el efecto se analice posteriormente.

Cada músculo esquelético vertebrado tiene un tamaño, forma y función definidos, e interacciones bien caracterizadas con tejidos adyacentes, como huesos, tendones y nervios. Algunos músculos son pequeños, se encuentran justo debajo de la piel y, por lo tanto, son buenos candidatos para estudios de imágenes de alta resolución. Al igual que la mayoría de los órganos, cada músculo crece a lo largo de la vida embrionaria, postnatal y juvenil, antes de alcanzar un tamaño adulto estable. El músculo, sin embargo, también tiene una capacidad única para cambiar de tamaño durante la vida adulta, dependiendo del uso y la nutrición18, y esta propiedad tiene un gran impacto en la aptitud del organismo, el rendimiento deportivo y la vida independiente. La pérdida de masa muscular y de función en la vejez, la sarcopenia, es un tema de creciente preocupación para las sociedades que se enfrentan a una población envejecida 19,20,21.

Nosotros y otros nos hemos centrado en el crecimiento de bloques definidos de tejido muscular esquelético en el cuerpo segmentariamente repetitivo de larvas de pez cebra, como un sistema aparentemente cerrado que contiene varios cientos de células en las que se puede observar y manipular el crecimiento, mantenimiento y reparación de tejidos 22,23,24,25,26. Si bien se ha informado previamente de algunos trabajos cuantitativos 25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35, no se dispone de un método detallado y validado para medir el crecimiento muscular en detalle celular en organismos vertebrados individuales a lo largo del tiempo. Aquí se describe un protocolo eficiente sobre cómo realizar tales mediciones repetidas, junto con la validación, y se proporciona un ejemplo de su uso para analizar los cambios en el crecimiento hipertrófico e hiperplásico en respuesta a la actividad eléctrica alterada.

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Protocolo

Toda la investigación descrita se realizó de conformidad con las directrices institucionales y bajo licencias adecuadas del Ministerio del Interior del Reino Unido de acuerdo con la Ley de Animales (Procedimientos Científicos) de 1986 y modificaciones posteriores. Los embriones/larvas deben criarse a 28,5 °C hasta completar la gastrulación, pero luego pueden mantenerse a 22-31 °C para controlar la velocidad de desarrollo. El pescado puede ser escaneado o estimulado a temperatura ambiente.

1. Anestesiar larvas de pez cebra

  1. Cruza peces adultos reporteros fluorescentes adecuados como Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP)vu119Tg referencia 36 o Tg(α-actina:mCherry-CAAX)pc22Tg referencia37 y recolecta embriones como se describe38.
  2. En el momento de la elección, como 2 días después de la fertilización (dpf), anestesiar brevemente los embriones utilizando un medio de pescado que contenga tricocaína (ya sea agua de pescado o medio E3) y detectar EGFP o mCherry bajo un microscopio de fluorescencia, como un Leica MZ16F. Si uno tiene muchos embriones, seleccione aquellos con la señal más brillante. Devolver los embriones al medio normal de pescado inmediatamente después del cribado.

2. Montaje de peces para escaneo confocal

  1. Encienda el sistema de escaneo láser confocal y los láseres, para permitir que el sistema se estabilice durante 30-60 minutos.
    NOTA: Aquí, utilizamos un microscopio Zeiss LSM 5 Exciter con soporte de materiales verticales (que mejora la distancia de trabajo) equipado con un objetivo de inmersión en agua de 20x / 1.0 W.
  2. Prepare agarosa de bajo punto de fusión al 1% (LMA) y manténgala en un bloque de calor a 37 °C para uso repetido en un tubo de 1,5 ml. Para evitar el choque térmico, retire la alícuota LMA del bloque de calor y déjela enfriar justo por encima del ajuste antes de aplicarla a la larva, probando contra la piel para juzgar la temperatura adecuada, como cuando se evalúa la temperatura de la leche de fórmula para bebés.
  3. Seleccione los peces que se montarán y anestesiar transitoriamente cada pez a su vez con Tricaine (0,6 mM en medio de pescado).
  4. Tome una placa de Petri de 60 mm de diámetro que haya sido recubierta con una capa de agarosa al 1% y colóquela en el escenario de un microscopio de disección.
  5. Transfiera la larva con una pipeta de plástico Pasteur de 1 ml a la placa de Petri recubierta de 60 mm y retire la mayor cantidad posible de medio transferido. Luego, aún usando la pipeta Pasteur, coloque de 5 a 10 gotas de LMA sobre el pez y colóquelo rápidamente horizontalmente en vista lateral con pinzas (o una aguja de vidrio fino pulido al fuego) antes de que la LMA se asiente. Para obtener imágenes óptimas, es deseable colocar la larva cerca de la superficie superior de la LMA.
    1. Alternativamente, utilizando una pipeta Pasteur de plástico de 1 ml, recolecte la larva con el menor medio de pescado posible y transfiera la larva a la alícuota de LMA enfriada. Permita que la larva se hunda durante 5 s para que quede completamente rodeada por LMA. Luego, recupere la larva y transfiérala en una gota de LMA a la placa de Petri recubierta de agarosa. Oriente y posicione rápidamente la larva como se describió anteriormente.
  6. Orientar la larva con sus ejes anteroposterior y dorsoventral dentro de los 10° de la horizontal (véase la nota «Sobre el error y su corrección», en el punto 4.6).
    1. Si la larva no está correctamente montada horizontalmente cerca de la superficie de la gota de agarosa, retire y vuelva a incrustar. Las larvas se pueden recuperar fácilmente mediante succión suave con una pipeta microfina de plástico Pasteur de 1 ml, y la LMA se puede eliminar suavemente con Kimwipes. La práctica realmente hace perfecto en el procedimiento de montaje; Pase una tarde incrustando algunas larvas sin importancia antes de probar esto en un experimento real.
      NOTA: Sobre el diseño del microscopio: Muchos laboratorios utilizan microscopios confocales invertidos para obtener imágenes a través de un cubreobjetos. Hemos encontrado que la incrustación repetida y la eliminación de peces mantenidos en agarosa bajo un cubreobjetos para su observación en un microscopio invertido conduce a una mayor pérdida de muestras durante el escaneo repetido que en el procedimiento descrito con un microscopio vertical. Por esta razón, se recomienda el uso de un sistema vertical, si está disponible. Sin embargo, una clave para los datos de alta calidad es la selección y el uso adecuados de parámetros objetivos y de escaneo, un tema demasiado grande para discutirlo aquí.

3. Escaneo confocal

  1. Cuando la LMA se haya fijado, inunde el plato con alrededor de 10 ml de medio de pescado que contenga tricocaína. Si planea capturar pilas confocales, deje que el pez montado descanse durante al menos 10 minutos antes de proceder al escaneo, ya que se produce algo de hinchazón de agarosa.
  2. Cargue el plato de muestra en la etapa del sistema confocal, localice la larva y concéntrese en el somita deseado. Se puede elegir Somite 17 debido a su facilidad de localización cerca del respiradero anal y facilidad de obtención de imágenes. Verifique contando somitas desde anterior.
    NOTA: El primer somite está fusionado detrás de la oreja y no tiene borde anterior, pero se puede observar fácilmente que tiene fibras musculares estriadas.
  3. Configure como si fuera a capturar una pila Z definiendo la parte superior (es decir, justo encima de la piel) y la parte inferior (es decir, justo debajo de la notocorda, para incluir todo el somite, incluso si el pez está montado ligeramente sesgado). Tanto el lado izquierdo como el derecho se pueden capturar como se desee. Esto asegurará que todos los escaneos rápidos de YZ capturen la(s) región(es) deseada(s).
  4. Capture una imagen XY de la siguiente manera. Oriente el área de escaneo con respecto a los peces, según lo permita el software confocal. Coloque el pez con el eje anteroposterior paralelo al eje X de la imagen y el eje dorsoventral paralelo al eje Y con somita 17 en el centro del campo, como se muestra en el Archivo complementario 1. Concéntrese en un plano de nivel medio en el miotomo superior en el que todas las mitades de somite epaxial e hipaxial junto con los mioseptos verticales y horizontales sean visibles y capture una imagen XY de alta resolución. Recuerde nombrar y guardar la imagen.
  5. Capture una o más imágenes YZ de la siguiente manera. En los Resultados representativos (a continuación) se compara la precisión de los métodos de 2 y 4 cortes. En el enfoque de 2 cortes, se emplean escaneos XY e YZ individuales. En el enfoque de 4 cortes, se promedian tres escaneos YZ para dar una estimación más precisa del volumen del miotoma. Si el software confocal lo requiere, vuelva a orientar el campo de escaneo.
    1. Dibuje una línea dorsal a ventral precisa a través del somite elegido perpendicular al eje anteroposterior del pez en una posición anteroposterior seleccionada. Realice un escaneo de línea Z-stack.
    2. Repita la exploración de la línea YZ tres veces en posiciones anteroposteriores definidas a lo largo del miotomo seleccionado para capturar YZa, YZm e YZp. Los resultados representativos se muestran en la Figura 2A. Asigne un nombre y guarde estas imágenes junto con la imagen XY relacionada.
      NOTA: En la selección de planos YZ: El miotomo tiene forma de V y su forma cambia durante el crecimiento. Para obtener la evaluación más precisa del volumen del miotomo 17 con el método de 4 cortes, coloque YZa en la punta anterior del miotomo, YZp en las puntas posteriores del miotomo en los extremos dorsal y ventral, e YZm a medio camino entre YZa e YZp. Suponiendo que el somite se estrecha uniformemente, la media de las mediciones de cada sección YZ representará el miotomo como un todo. Para el método de 2 cortes, la exploración YZ única debe colocarse en el extremo posterior del miotabique horizontal, que corresponde aproximadamente al centro anteroposterior del miotomo de interés (como YZm). Alternativamente, se puede tomar un conjunto de tres secciones YZ en la parte anterior, media y posterior del miotabique horizontal, pero, como se muestra a continuación, dicha medición sobrestimará ligeramente o subestimará el volumen del miotomo (para somitas rostral y caudal, respectivamente, debido a la disminución gradual del miotoma). Fundamentalmente, la consistencia en el posicionamiento de los planos de corte YZ entre los peces y los experimentos es clave para la reproducibilidad.

4. Análisis

  1. Como el miotomo cambia de tamaño a lo largo del pez de manera gradual, siempre trabaje con el mismo somite en estudios comparativos.
  2. Para medir y calcular el volumen del miotomo, utilice el software confocal (como los archivos .lsm creados con el software de microscopio Zeiss ZEN) o el software de análisis universal de imágenes de código abierto, como Fiji / ImageJ.
    NOTA: Si cambia los formatos de archivo, asegúrese de que el tamaño del paso Z se transfiera correctamente, ya que no todo el software puede leer correctamente los formatos de archivo confocal propietarios. Por ejemplo, para importar una imagen de escaneo de línea ZEN a Fiyi, utilice primero el comando Archivo/Exportar para exportar como .tif en la ventana Imagen de resolución completa - formato de plano único y, a continuación, impórtela a Fiyi. Aunque YZ scan.lsm se puede abrir directamente en Fiji, las imágenes YZ resultantes generalmente se comprimen en la dimensión Z debido a una evaluación incorrecta del tamaño del paso Z.
  3. Análisis mediante ZEN
    1. Primero, abra los archivos XY scan.lsm en ZEN. Vaya a la pestaña Gráficos y seleccione la herramienta Línea. Dibuje una línea entre los dos mioseptos verticales del somite 17 que abarque toda la longitud del miotomo (paralelo al eje anteroposterior del pez). Marque la casilla M para mostrar los valores de la medición (Longitud = 89,71 μm, consulte el Archivo complementario 2).
    2. Abra los archivos scan.lsm de YZ . En la pestaña Gráficos , seleccione la herramienta Curva cerrada . Dibuja alrededor del perímetro del miotomo. Una vez completado, marque la casilla M, esto revelaría el valor de la medición (Área = 11980.01 μm2, consulte el Archivo Suplementario 3).
    3. Registre los valores de cada medición manualmente en una hoja de cálculo. Promedie las mediciones de CSA según sea necesario. El volumen del miotomo se puede calcular como Volumen = longitud del miotomo x CSA, es decir, 89.71 μm x 11980.01 μm2 = 1.075 x 106 μm3.
  4. Análisis mediante Fiji/ImageJ
    1. Abra los archivos XY scan.lsm en Fiji/ImageJ. Compruebe si las imágenes XY abiertas directamente en Fiji están correctamente calibradas en escala, como debería ser.
    2. Seleccione la herramienta Línea recta en los iconos. Dibuje una línea a lo largo del somite 17 como se describe en el paso 4.3.1. Para definir los parámetros de medición, vaya a Analizar, seleccione Establecer medidas... y marque las casillas siguientes Área y Etiqueta de visualización. Para medir, simplemente presione la tecla de acceso rápido M, o vaya al menú Analizar y seleccione Medir. Una ventana emergente resultante enumera todos los valores de medición (es decir, Longitud = 90,023 μm; consulte el Archivo complementario 4). Los resultados se pueden guardar en forma de .csv y abrir en Microsoft Excel o similar para su posterior análisis.
    3. Para medir CSA en las imágenes YZ, abra las imágenes YZ en .tif formato como se describe en el paso 4.2.
    4. Calibre las imágenes YZ .tif, ya que no están calibradas cuando se exportan. Los parámetros para la calibración se pueden obtener en ZEN yendo a la Información de las imágenes seleccionadas: registre los valores de Escala X (0,489 μm) y Escala Z (0,890 μm; consulte el Archivo complementario 5). A continuación, mientras las imágenes están abiertas en Fiji, vaya a Imagen y seleccione Propiedades.... Entrada 0,489 μm para el ancho de píxel y la altura de píxeles, y 0,890 μm para la profundidad de vóxel. Marque la casilla Global para aplicar la calibración universalmente si se prevé la medición repetida de imágenes YZ (consulte el Archivo complementario 6).
      NOTA: Asegúrese de que todas las imágenes YZ se capturen utilizando los mismos parámetros de escaneo; reinicie Fiji/ImageJ o modifique los valores de calibración si se requiere un nuevo conjunto de calibración.
    5. Para medir el CSA de las imágenes YZ calibradas, seleccione la herramienta Selecciones de polígonos en los iconos. Dibuje alrededor del perímetro del somita y presione M para revelar los valores de la medición (Área = 11980.395 μm2; consulte el Archivo suplementario 7). El volumen del miotomo se puede calcular como Volumen = longitud del miotomo x CSA, es decir, 90.023 μm x 11980.395 μm2 = 1.079 x 106 μm3.
    6. Repita las mediciones en las otras imágenes XY e YZ. Se recomienda utilizar el mismo software para todas las mediciones dentro de una serie experimental para mayor consistencia. La estimación de volumen de cada software es similar pero no idéntica debido a las distintas herramientas de dibujo, es decir, ZEN = 1.074 × 10 6 μm 3 y Fiji / ImageJ = 1.079 × 106 μm3. El crecimiento del miotomo entre dos puntos de tiempo (es decir, 3 a 4 dpf) se puede calcular como: (Volumen 4 dpf - Volumen 3 dpf) / Volumen 3 dpf × 100%.
      NOTA: Sobre el error y su corrección. Durante el montaje, el pez debe orientarse con su plano sagital (es decir, los ejes anteroposterior y dorsoventral) lo más cerca posible de la horizontal, para evitar la guiñada y el balanceo, respectivamente. Esto se debe a que tanto la longitud del miotomo L medida a partir de la exploración XY como la CSA medida a partir de una exploración YZ se sobreestimarán si el pez muestra guiñada (rotación alrededor del eje dorsoventral) debido al montaje anteroposterior oblicuo. Ni el cabeceo ni el balanceo durante el montaje deben afectar a las mediciones después del escaneo, como se describe en la sección 3. Sin embargo, la rotación dorsoventral (rollo) degrada la calidad de la imagen. La trigonometría simple muestra que hasta 10° de guiñada dará un error del 3% en la medición del volumen, ya que L y CSA medidos aumentan en proporción a (cosq)-1, donde q es el ángulo alejado de la horizontal anteroposterior (guiñada). 15° y 20° de descuento darán un 7% y un 13% de sobreestimación del volumen, respectivamente.
      Como la notocorda es cilíndrica, la inclusión de toda la notocorda en el escaneo YZ se puede usar para calcular el ángulo y la extensión de la oblicuidad a partir de la orientación y magnitud de los ejes mayor y menor y, por lo tanto, corregir la L y CSA medidas para maximizar la precisión. CSA corregido = CSA medido x Eje Notocorda menor/Eje Notocorda mayor. L corregido = L medido x eje Notocorda menor/eje Notocorda en dirección Z del microscopio.
      Una consideración adicional permite una corrección adicional de L. A medida que el miotomo crece, se inclina en el plano coronal (normal al eje dorsoventral) de tal manera que el miotomo medial es ligeramente anterior al miotomo lateral. Visto desde dorsal, los mioseptos verticales en los lados izquierdo y derecho forman un amplio chevron que apunta anterior. Si la guiñada es baja, esta morfología no afecta a la medición de L. Pero si la guiñada es significativa, la corrección trigonométrica se vuelve desafiante y un mejor enfoque es medir True L directamente estimando las coordenadas XYZ de los dos puntos donde los mioseptos verticales anterior y posterior se encuentran con la notocorda en el mioseptum horizontal. La trigonometría simple permite el cálculo de L verdadero a partir de estas coordenadas como L = SQRT[(X 2 - X 1)2 + (Y 2 - Y 1)2 + (Z 2 - Z 1)2]. Las debilidades de este último enfoque son que a) la selección de los puntos puede variar con el operador y b) no se conserva ningún registro visual de los puntos elegidos. Esta consideración no afecta a la corrección de la CSA.

5. Método opcional: eliminar y reintroducir la actividad eléctrica muscular

  1. Crear una cámara de estimulación.
    1. Tome una placa de pocillo de 6 x 35 mm, cree dos aberturas pequeñas (<5 mm de diámetro, 1 cm de separación) a cada lado de cada pocillo (consulte la figura 1) utilizando un soldador estrecho.
      NOTA: Manipule el soldador caliente con cuidado y trabaje en una campana extractora de humos si lo desea para evitar inhalar vapor.
    2. Enhebra un par de alambres de plata o platino (~20 cm de largo) a través de las aberturas de cada pocillo (ver Figura 1). El material adhesivo reutilizable (por ejemplo, BluTack) se puede aplicar cerca de las aberturas para mantener los cables en su lugar y garantizar una separación de 1 cm entre los cables (consulte la figura 1).
  2. A 3 dpf, divida el pescado en tres condiciones: medio de pescado Control, Inactivo e Inactivo + Stim.
    1. Para los grupos Inactivo e Inactivo+Stim, anestesiar las larvas a las 72 horas después de la fertilización (hpf) con Tricaine (0,6 mM).
      NOTA: Siguiendo la referencia38, las alícuotas congeladas de tricaína se descongelan y diluyen (40 μL/ml de medio de pescado, hasta una concentración final de 0,6 mM) antes de añadirlas al pescado. No agregue tricaína directamente en el agua que contiene peces, ya que algunos peces podrían recibir dosis altas. Las existencias de tricocaína deben usarse dentro de un mes y nunca volver a congelarse.
    2. Para el medio de pescado Peces de control, déjelos sin anestesia.
  3. En momentos seleccionados después del inicio de la exposición a tricaína (es decir, a 80 hpf), prepare el grupo Inactivo + Stim para la estimulación.
    1. Preparar 60 mL de agarosa al 2% (1,2 g de agarosa en polvo en 60 mL de medio de pescado), y derretir completamente usando microondas, enfriar, añadir tricaína y verter 4 mL en cada pocillo de la cámara de estimulación (Figura 1).
    2. Agregue inmediatamente peines de 4 pocillos hechos a medida entre los electrodos (creados cortando plásticos (por ejemplo, polipropileno) de las dimensiones deseadas y pegándolos con Superglue; consulte la Figura 1). Espere 10 minutos para que el gel se asiente. Retire los peines con cuidado para crear cuatro pozos rectangulares.
    3. Llenar cada pocillo con agua tricaína y colocar una sola larva Inactive+Stim anestesiada en cada pocillo utilizando una micropipeta, con su eje anteroposterior perpendicular a los electrodos (ver Figura 1).
    4. Verifique bajo el microscopio fluorescente de disección si cada pez está completamente anestesiado dentro de cada pocillo de la cámara.
  4. Conecte un estimulador electrofisiológico ajustable generador de patrones a la cámara a través de un controlador de polaridad, utilizando clips de cocodrilo conectados a cada uno de los electrodos en un lado de la cámara (ver Figura 1).
    NOTA: El controlador de polaridad se utiliza para invertir la polaridad cada 5 s, a fin de evitar la electrólisis y la corrosión de los electrodos.
  5. Estimular a los peces. Por ejemplo, 1s con un tren de 200, pulsos de 20 V, con una duración de pulso de 0,5 ms y separación de pulsos de 4,5 ms, una vez cada 5 s proporciona un régimen efectivo de resistencia a la contracción tetánica repetida.
  6. Verifique regularmente bajo el microscopio para confirmar que los peces están siendo estimulados; El estímulo eléctrico de ejemplo debe inducir una contracción bilateral visible y un ligero movimiento, una vez cada 5 s.
  7. Para un régimen de resistencia/alta fuerza, estimule a los peces a una frecuencia alta durante un combate de 5 minutos, tres veces, con cada combate separado por 5 minutos de descanso.
    NOTA: Mientras los peces en un lado de la cámara están descansando, los clips de cocodrilo se pueden conectar al par de electrodos en el otro lado de la cámara, y esos peces adicionales estimulados.
  8. Después de la estimulación, retire cuidadosamente el pescado de cada pocillo enjuagándolos suavemente con una pipeta de plástico y regrese a la incubadora en un medio de pescado fresco que contenga tricaína.
  9. Vierta el agua tricaína desde dentro de la cámara y use fórceps para cortar y quitar la agarosa de cada pozo. Enjuague los pocillos con agua del grifo y deje secar.
    NOTA: Si se utilizan electrodos de alambre de plata, ocasionalmente se puede acumular óxido de plata en la superficie del cable después de un experimento de estimulación. Como el óxido de plata es menos conductor que la plata, para mantener la reproducibilidad, frote cuidadosamente el óxido de plata del cable con Kimwipes antes de volver a utilizar la configuración.

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Resultados

Una medida rápida y precisa del volumen de somita
Se describe un método de preparación de muestras, adquisición de datos y análisis volumétrico que permite la medición rápida del crecimiento muscular en larvas de pez cebra. El tamaño muscular se puede medir en animales vivos utilizando peces marcados en sus membranas plasmáticas con una GFP dirigida a la membrana (β-actina: HRAS-EGFP) o mCherry (α-actina: mCherry-CAAX). Las larvas fueron anestesiadas transitoriamente usando tricaína,...

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Discusión

Aquí presentamos un método para la estimación precisa y eficiente del volumen muscular de larvas vivas de pez cebra en etapas o en variantes genéticas en las que la pigmentación no es un gran obstáculo para la obtención de imágenes y cuando la anestesia transitoria y / o la inmovilización son bien toleradas. Mientras que hemos empleado microscopía confocal de escaneo láser, los enfoques descritos son aplicables a la microscopía confocal de disco giratorio o de hoja de luz y a cualquier otro método que cree pilas de imáge...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no hay intereses contrapuestos.

Agradecimientos

Los autores están profundamente en deuda con los esfuerzos de los miembros del laboratorio de Hughes, los doctores Seetharamaiah Attili, Jana Koth, Fernanda Bajanca, Victoria C. Williams, Yaniv Hinits, Giorgia Bergamin y Vladimir Snetkov para el desarrollo de los protocolos descritos, y con Henry Roehl, Christina Hammond, David Langenau y Peter Currie por compartir plásmidos o líneas de pez cebra. SMH es un científico del Consejo de Investigación Médica (MRC) con subvenciones del programa G1001029, MR / N021231 / 1 y MR / W001381 / 1 de apoyo. MA tuvo una beca de doctorado del Programa de Formación Doctoral MRC del King's College de Londres. Este trabajo se benefició de la aportación trigonométrica de David M. Robinson, erudito, mentor y amigo.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Adhesivo, Blu TackBostik-de
aerosol  ---
AgarosaSigma-AldrichA9539-Agarosa
, baja temperatura de gelificaciónSigma-AldrichA9414Una vez derretido, manténgalo a 37oC en un calentador de bloque para que permanezca en forma líquida para uso repetido.
Calentadorde bloque Cole-ParmerSBH130-BODIPY
FL C5-ceramidaThermo ScientificD3521Para diluir en agua de pescado y utilizar a 5 µ M para incubación nocturna.
Pinzas y alambres de cocodrilo--
-Fiji/imageJInstitutos Nacionales de Salud, NIH--
Medio para peces, Agua para peces--Agua del sistema de circulación recogida de la instalación de peces.
Medio de pescado, medio E3:E3 se describe en El libro del pez cebra. http://zfin.org (5 mM de NaCl, 0,17 mM de KCl, 0,33 mM de CaCl2 y 0,33 mM de MgSO4 en agua destilada).
Microscopio de fluorescenciaLeica LeicaMZ16FTambién se espera que el microscopio de fluorescencia de otro tipo sea adecuado.
Aguja de vidrioWorld Precision Instruments, Inc.1B100-6Ser pulido al fuego para evitar daños en los embriones durante la manipulación.
Estimulador de céspedGrass InstrumentsS88También se espera que los estimuladores de otro tipo sean adecuados.
Kimwipes, Limpiaparabrisas para tareas delicadas13258179-láser
(LSM) de Kimberly-Clark ZeissZeiss LSM 5 Exciter
También se espera que Zeiss LSM 880		LSM de otro tipo sean adecuados.
Nunc Cell-Culture Tratado, placa de 6 pocillosThermo Scientific140675-Objective
, 20×/1.0W inmersión en aguaZeiss--
Pipeta Pasteur, graduada 1 mLStarlab GroupE1414-0100-Pasteur
Pipeta, Micro Punta Fina 1 mLStarlab GroupE1414-1100-Placade
Petri, 60 mmSigma-AldrichP5481-
Plásmido CMV-CerúleoChristina L. Hammond (Universidad de Bristol)PCS2+_cerulean_kanR plásmido inyectado a 25-75 pg en una etapa celular.  Cita: Bussman J y Schulte-Merker S. (2011) Desarrollo 138:4327-4332. doi: 10.1242/dev.068080.
Plásmido, pCS-mCherry-CAAXHenry Roehl (Universidad de Sheffield)-Para la transcripción in vitro utilizando el promotor SP6 (se pueden utilizar plásmidos que contienen otros marcadores de marcaje de membrana);
ARNm encapsulado sintetizado para inyectar a 100-200 pg en una célula.
Controlador de pulsos Hoefer Scientific InstrumentsPC750-Soldador
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-TricaineSigma-AldrichE105213-aminobenzoato de etilo metanosulfonato / MS-222; para ser disuelto en agua de peces y utilizado a 0.6 mM.
VolocityPerkin Elmer/Quorum Technologies Inc--
Pinzas de relojero, n.º 5---
Alambre, platinoGoodfellowPT005142/120,40 mm de diámetro; una alternativa costosa de la plata.
Alambre, plataAcros Organics3177300100,25 mm de diámetro (se había probado un rango de diámetro, es decir, 0,25-0,5 mm, que produjo resultados similares).
Pez cebra, myog:H2B-mRFPDavid M. Langenau (Hospital General de Massachusetts; Instituto de Células Madre de Harvard)-ZFIN nombre oficial: Tg (myog: Hsa.HIST1H2BJ-mRFP), fb121Tg.  http://zfin.org/ZDB-ALT-160803-2  Citación: Tang Q, Moore JC, Ignatius MS, Tenente IM, Hayes MN, Garcia EG, Torres Yordá n N, Bourque C, He S, Blackburn JS, Look AT, Houvras Y, Langenau DM. Imagen de la heterogeneidad de las células tumorales después del trasplante de células en pez cebra con inmunodeficiencia ópticamente clara. Nat Commun. 21 de enero de 2016;7:10358. doi: 10.1038/ncomms10358.
Pez cebra, α-actina:mCherry-CAAXPeter D. Currrie (ARMI, Universidad de Monash)-ZFIN nombre oficial: Tg(actc1b:mCherry-CAAX), pc22Tg.  http://zfin.org/ZDB-ALT-150224-2 Citación: Berger J, Tarakci H, Berger S, Li M, Hall TE, Arner A y Currie PD. Pérdida de tropomodulina4 en el pez cebra mutante trä La EG causa la formación de bastones citoplasmáticos y debilidad muscular que recuerda a la miopatía nemalínica. Dis Model Mech. 2014 Dic; 7(12):1407-15. doi: 10.1242/dmm.017376.
Pez cebra, β-actina:HRAS-EGFP--Nombre oficial de ZFIN: Tg(Ola.Actb:Hsa.HRAS-EGFP), vu119Tg. http://zfin.org/ZDB-ALT-061107-2  Cita: Cooper MS, Szeto DP, Sommers-Herivel G, Topczewski J, Solnica-Krezel L, Kang HC, Johnson I y Kimelman D. Visualización de la morfogénesis en embriones de pez cebra transgénicos utilizando el colorante de éster metílico BODIPY TR como contratinción vital para GFP. Dev Dyn. febrero de 2005; 232(2):359-68. doi: 10.1002/dvdy.20252.
Software ZENZeiss--
Vacío Microscopio de barrido profesional

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