Artículo de método

Prueba de permeabilidad epitelial en enteroides derivados de tejido fetal

DOI:

10.3791/64108

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16 de junio de 2022

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1Morsani College of Medicine, University of South Florida, 2Department of Pediatrics, Morsani College of Medicine, University of South Florida, 3Department of Molecular Pharmacology and Physiology, Morsani College of Medicine, University of South Florida

En este artículo

Resumen

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Este protocolo detalla el establecimiento de enteroides, un modelo intestinal tridimensional, a partir del tejido intestinal fetal. Se utilizaron imágenes inmunofluorescentes de biomarcadores epiteliales para la caracterización del modelo. La exposición apical de lipopolisacáridos, una endotoxina bacteriana, mediante la técnica de microinyección indujo la permeabilidad epitelial de una manera dependiente de la dosis medida por la fuga de dextrano fluorescente.

Resumen

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Los enteroides derivados del tejido fetal humano están emergiendo como un modelo in vitro prometedor para estudiar las lesiones intestinales en bebés prematuros. Los enteroides exhiben polaridad, que consiste en un lumen con un borde apical, uniones estrechas y una capa externa basolateral expuesta a medios de crecimiento. Las consecuencias de las lesiones intestinales incluyen inflamación de la mucosa y aumento de la permeabilidad. La prueba de permeabilidad intestinal en sujetos humanos prematuros vulnerables a menudo no es factible. Por lo tanto, se necesita un modelo intestinal in vitro derivado del tejido fetal para estudiar las lesiones intestinales en lactantes prematuros. Los enteroides se pueden usar para probar cambios en la permeabilidad epitelial regulada por proteínas de unión estrecha. En los enteroides, las células madre intestinales se diferencian en todos los tipos de células epiteliales y forman una estructura tridimensional en una matriz de membrana basal secretada por células de sarcoma de ratón. En este artículo, describimos los métodos utilizados para establecer enteroides a partir del tejido intestinal fetal, caracterizar las proteínas enteroides de unión estrecha con imágenes inmunofluorescentes y probar la permeabilidad epitelial. Como la disbiosis bacteriana gramnegativa dominante es un factor de riesgo conocido para la lesión intestinal, utilizamos lipopolisacárido (LPS), una endotoxina producida por bacterias gramnegativas, para inducir la permeabilidad en los enteroides. El dextrano marcado con fluoresceína se microinyectó en la luz enteroide, y las concentraciones seriadas de dextrano filtradas en los medios de cultivo se midieron para cuantificar los cambios en la permeabilidad paracelular. El experimento mostró que la exposición apical al LPS induce la permeabilidad epitelial de una manera dependiente de la concentración. Estos hallazgos apoyan la hipótesis de que la disbiosis gramnegativa dominante contribuye al mecanismo de lesión intestinal en los recién nacidos prematuros.

Introducción

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Los bebés prematuros están expuestos a una inflamación frecuente y prolongada que los pone en mayor riesgo de lesión intestinal que resulta en discapacidad a largo plazo o muerte1. La investigación en esta área se ve desafiada por la capacidad limitada para realizar experimentos en bebés prematuros vulnerables. Además, la falta de modelos adecuados ha dificultado el estudio exhaustivo del ambiente intestinal prematuro2. Los modelos in vitro e in vivo existentes no han logrado representar de manera integral el entorno intestinal humano prematuro. Específicamente, las líneas celulares fetales epiteliales individuales pueden no formar uniones estrechas, y los modelos animales exhiben diferentes respuestas inflamatorias e inmunológicas que los bebés prematuros humanos. Con el descubrimiento de la señalización Wnt como vía primaria en la proliferación y diferenciación de las células madre de cripta intestinal y las nuevas células madre tisulares Lgr5+, se establecieron organoides derivados de tejidos intestinales como enteroides y colonoides como modelos in vitro 3,4,5. Utilizando esta tecnología, es posible crear y utilizar modelos enteroides tridimensionales (3D) que se desarrollan a partir de tejido completo o biopsia de un intestino para estudiar las respuestas epiteliales al ambiente intestinal 6,7.

En contraste con las líneas celulares intestinales típicas cultivadas en cultivo, los enteroides exhiben polaridad con un lumen conectado por proteínas de unión estrecha8. Esto permite la exposición al borde basolateral en los medios de crecimiento, así como la microinyección luminal para evaluar el borde apical. Además, los enteroides muestran características genéticas, fisiológicas e inmunológicas similares a las del epitelio humano 9,10. Los enteroides derivados del tejido fetal permiten examinar el papel de la prematuridad en la función epitelial. Las características únicas de los enteroides pueden parecerse más estrechamente al ambiente intestinal prematuro9. Los enteroides derivados de tejidos se pueden usar para probar la integridad de la unión estrecha como una forma monocapa o como estructuras 3D incrustadas en una mezcla de proteínas de membrana basal solidificada. Se requiere una técnica de microinyección para esta última forma si se desea una exposición apical. La medición de las respuestas epiteliales en modelos enteroides incluye la expresión génica mediante secuenciación de ARN, biomarcadores mediante inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA) o técnicas avanzadas de imagen. La técnica presentada aquí proporciona otra opción factible para medir la permeabilidad bruta con fluorometría.

La lesión intestinal en los recién nacidos prematuros tiene una patogénesis multifactorial que incluye el desequilibrio de la comunidad microbiana intestinal. Los enteroides pueden proporcionar excelentes modelos para estudiar ciertos aspectos de las enfermedades intestinales prematuras, como la enterocolitis necrosante, que involucran funciones epiteliales11. Los enteroides muestran características similares al intestino fetal humano10. La exposición de enteroides al lipopolisacárido (LPS), una endotoxina producida por bacterias gramnegativas, en los medios de cultivo como exposición basolateral induce la expresión génica que puede conducir a un aumento de la inflamación y la permeabilidad intestinal7. Este estudio tiene como objetivo evaluar los cambios en la permeabilidad epitelial macroscópica después de la exposición apical a productos bacterianos como LPS. Los resultados pueden proporcionar información sobre las interacciones microbio-epiteliales involucradas en la patogénesis de la lesión intestinal. El método diseñado para probar la permeabilidad bruta requiere configuración y habilidad de microinyección.

Protocolo

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La recolección de tejido humano fue aprobada por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Washington (ID del estudio: STUDY380 y CR ID: CR3603) y realizada por el Laboratorio de Investigación de Defectos Congénitos. El Laboratorio de Investigación de Defectos Congénitos fue apoyado por el premio número 5R24HD000836 de los NIH del Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano Eunice Kennedy Shriver. Los especímenes fueron recolectados de participantes que consintieron y enviados como anónimos y sin ninguna información de salud. Las muestras del intestino delgado se almacenaron en solución salina tamponada con fosfato (DPBS) helada de Dulbecco y se enviaron por correo durante la noche al laboratorio receptor.

1. Preparación del reactivo

NOTA: Consulte la Tabla de materiales para obtener una lista de reactivos y números de catálogo; Los volúmenes recomendados son para una placa de 6 pocillos a menos que se mencione lo contrario.

  1. Prepare albúmina sérica bovina (BSA) al 0,1% disolviendo 50 mg de polvo de BSA en 50 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) con 100 μg / ml de un antibiótico primocina de amplio espectro para cubrir todos los artículos de plástico y puntas que entran en contacto con tejidos o enteroides.
    1. Para recubrir con BSA, coloque las puntas de pipeta no filtradas en un tubo cónico de 50 ml con suficiente BSA para cubrir las puntas, agregue 1-2 ml de BSA para cubrir la superficie de la placa de Petri o llene tubos cónicos de 15 ml con BSA durante al menos 20-30 minutos a temperatura ambiente antes de su uso.
  2. Prepare los medios DPBS mezclando 50 ml de DPBS con 100 μg/ml de primocina y 50 μg/ml de gentamicina. Prepare este medio con y sin anfotericina a 2,5 μg/ml.
  3. Prepare los medios de crecimiento enteroides mezclando 2 ml de medio de crecimiento organoide, 100 μg/ml de primocina, 10 μM Y27632 y 2,5 μM CHIR99021. Preparar medios frescos diariamente y calentarlos en una incubadora de cultivo celular a 37 °C.
    NOTA: El factor de dilución para Y27632 es 1:250. Para CHIR99021, diluir la solución madre CHIR a 1:100 en medios calientes y luego a 1:40 en medios de crecimiento enteroides para lograr una dilución 1:4000.
  4. Prepare la mezcla de matriz de membrana basal agregando a la matriz de membrana basal 10 μM Y27632 y 2.5 μM CHIR99021. Hacer un total de 285 μL de la mezcla final de la matriz de la membrana basal a una concentración de proteína de 8 mg/ml para un pocillo de una placa de 6 pocillos.
    NOTA: La matriz de la membrana basal debe estar helada para permanecer en forma líquida y se solidificará a temperaturas más cálidas. La concentración de proteína de la matriz de la membrana basal madre determina el volumen requerido para alcanzar una concentración final de proteína de 8 mg/ml utilizando la ecuación:
    Volumen 1 × Concentración 1 = Volumen 2 × Concentración 2
  5. Prepare paraformaldehído (PFA) al 4% diluyendo el PFA al 32% en PBS en 1:8, y guárdelo a temperatura ambiente. Hacer 0.5 mL por cada pocillo enteroide a reparar.
  6. Prepare el tampón de bloqueo agregando 5% de suero de cabra y 0.5% de Triton X-100 en PBS. Prepare 1 ml para el primer anticuerpo por pocillo y 0.5 ml para el anticuerpo adicional por pocillo.
    NOTA: Utilice suero de la misma especie que el huésped de los anticuerpos secundarios
  7. Preparar anticuerpos primarios y secundarios, diluidos en tampón de bloqueo a la concentración recomendada por el fabricante para cada anticuerpo.
  8. Preparar 5 μg/ml de dmidino-2-fenilindol (DAPI) diluyendo a 1:200 de 1 mg/ml de solución madre en PBS. Hacer 0.5 mL por pocillo de enteroides teñidos.
  9. Prepare glicerol al 70% en PBS y haga 0.5 ml para montar los enteroides en portaobjetos de microscopio.
  10. Prepare 5 mg/ml de dextrano-FITC (fluoresceína-isotiocianato) diluyendo la solución madre de 25 mg/ml en PBS en una proporción de 1:5. Hacer 20 μL para microinyección.
  11. Preparar lipopolisacáridos (LPS) y dextrano-FITC reconstituyendo el polvo de LPS en PBS a una solución madre de 5 mg/ml. Soluciones madre diluidas de LPS y dextrano en PBS a 0,1 mg/ml y 0,5 mg/ml de LPS y 5 mg/ml de dextrano-FITC. Hacer 20 μL para microinyección.
  12. Preparar el ácido etilenglicol-bis(β-aminoetil éter)-N,N,N',N'-tetraacético (EGTA) haciendo una solución madre de 0,2 M disolviendo el polvo de EGTA en agua destilada y ajustando el pH a aproximadamente 8 usando ácido clorhídrico (HCl). Preparar una concentración de ensayo de 2 mM en medios de cultivo realizando una dilución 1:100.

2. Recolección de muestras

  1. Una vez recibidas las muestras, realice el aislamiento y recubrimiento de células epiteliales dentro de las 24 h posteriores a la recolección de muestras.

3. Recubrimiento celular epitelial intestinal en la matriz de la membrana basal a partir de muestras enteras

NOTA: Este procedimiento sigue los protocolos modificados del Laboratorio de Modelado de Tejidos Traslacionales de la Universidad de Michigan12,13,14. El uso de medios de crecimiento con un alto factor Wnt produce resultados consistentes para el establecimiento enteroide. Una vez que se establecen los enteroides, use el mismo medio con un alto factor Wnt para conducir los enteroides a formas esféricas para microinyección.

  1. Transfiera los segmentos intestinales a una placa de Petri de 60 mm x 15 mm con DPBS helado con anfotericina y remoje durante 20 minutos en hielo. Mientras el tejido se empapa, identifique las regiones (duodeno, yeyuno o íleon) del intestino delgado y retire el tejido conectivo y los vasos sanguíneos con fórceps y tijeras. Lave el contenido de luz según sea necesario con una aguja pequeña de 23-25 G y una jeringa de 3 ml sin interrumpir el epitelio.
  2. Corte los segmentos intestinales en trozos de 3-5 mm con un bisturí y coloque 1-2 trozos (para chapar en un pocillo de una placa de 6 pocillos) en una placa de Petri de 35 mm x 15 mm que contenga 0.5-1 ml de medio de crecimiento organoide en hielo.
  3. Usando microtijeras y fórceps de disección, corte el tubo intestinal longitudinalmente. Use la punta del fórceps para raspar las células epiteliales de la fascia bajo un microscopio estereoscópico 10x. Retire la fascia y agite el plato para romper los grupos de células.
  4. Utilice una punta cortada de pipeta de 20 μL para transferir las células y los medios en el incremento de 5-10 μL a la mezcla de la matriz de la membrana basal para obtener una solución de 285 μL a una concentración de proteína de la matriz de 8 mg / ml. Pipetea hacia arriba y hacia abajo lentamente 20 veces para mezclar células en la matriz de la membrana basal sobre hielo usando una punta cortada de 200 μL.
  5. Coloque cinco tiras de 50 μL de la mezcla de la matriz de la membrana basal celular en un pocillo de una placa de 6 pocillos precalentada mantenida en un ladrillo de espuma caliente. Incubar la placa en la incubadora de cultivo celular a 37 °C y 5% deCO2 durante 10 min para permitir que la matriz de la membrana basal polimerice y se endurezca.
  6. Agregue 2 ml de los medios de crecimiento enteroides en el pocillo de las tiras de matriz de membrana basal solidificadas y vuelva a colocarlas dentro de la incubadora de cultivo celular. Cambie los medios diariamente para impulsar el crecimiento enteroide. Verifique la diferenciación de células madre intestinales bajo un microscopio invertido 10x diariamente.
  7. Después de 10-14 días, pase los enteroides a un pocillo de una placa de 12 pocillos o 6 pocillos, dependiendo de la densidad enteroide. Comience a cambiar los medios cada dos días y pase en una proporción de 1: 2 cada 5-7 días a medida que los enteroides comienzan a prosperar.
    1. Retire las células que no se diferencian en enteroides con la capa de matriz de la membrana basal durante los pasajes. Cree un stock congelado de enteroides con un paso bajo congelándolos en 80% de medios de crecimiento, 10% de suero bovino fetal (FBS) y 10% de dimetilsulfóxido (DMSO), si es necesario.

4. Tinción inmunofluorescente de enteroides

NOTA: El proceso de fijación y tinción tarda 3 días. En este protocolo, fijamos y teñimos núcleos (DAPI), marcadores epiteliales (villina, CDX2), lisozima, mucina y proteínas de unión estrecha (claudina 2, claudina 3, ocludina, zonula occluden-1) utilizando un protocolo modificado15. Las imágenes fluorescentes fueron tomadas por un microscopio confocal.

  1. Fijación
    NOTA: Este proceso generalmente se realiza al mismo tiempo que el paso enteroide o el procedimiento de congelación.
    1. Coloque la placa enteroide sobre hielo. Retire los medios de cultivo y lave suavemente 2 veces con DPBS frío.
    2. Identificar los enteroides a fijar y teñir. Transfiéralos a una placa de 12 pocillos pipeteándolos cuidadosamente con una punta cortada de 200 μL o usando un bucle de inoculación de 1 μL. Coloque los enteroides en pocillos separados si se va a realizar la tinción con diferentes anticuerpos.
    3. Retire la mayor cantidad de líquido posible con una punta de 200 μL sin interrumpir los enteroides. Añadir 0,5 ml de PFA al 4% e incubar durante 30 min a temperatura ambiente. Agite la placa ocasionalmente para facilitar el desprendimiento de los enteroides de la matriz de la membrana basal.
    4. Examinar groseramente para determinar el desprendimiento de los enteroides de la matriz de la membrana basal. Aspire cuidadosamente y deseche el PFA líquido sin interrumpir los enteroides. Lavar con PBS 3x para eliminar PFA y cualquier matriz de membrana basal residual
      NOTA: Aspirar el líquido bajo un microscopio estereoscópico puede ser útil para evitar los enteroides. Los enteroides fijos se pueden almacenar en PBS a 4 °C hasta por 1 mes.
  2. Bloqueante
    1. Retire cuidadosamente el PBS residual con una pipeta de 200 μL, sin interrumpir los enteroides. Añadir 0,5 ml de tampón de bloqueo e incubar durante 2 h a temperatura ambiente.
    2. Retire y deseche el tampón de bloqueo con una pipeta de 200 μL, teniendo cuidado de evitar interrumpir los enteroides.
  3. Tinción de anticuerpos
    1. Agregue 500 μL de anticuerpo primario en el tampón de bloqueo a cada pocillo con enteroides. Para los anticuerpos primarios y para la lisozima, el factor de dilución es 1:100, para CDX2 el factor de dilución es 1:100, y para villin el factor de dilución es 1:50. Incubar a 4 °C durante la noche.
    2. Al día siguiente, retire la solución de anticuerpos y lave 3 veces con PBS. Permita 10-15 minutos de tiempo de incubación para cada lavado.
    3. Repita los pasos 4.3.1.-4.3.2. para el anticuerpo secundario con un factor de dilución de 1:400.
    4. Añadir 500 μL de DAPI a 5 μg/ml en PBS e incubar a temperatura ambiente durante 15 min. Después de la incubación, lavar 3 veces con PBS y permitir 10-15 minutos de tiempo de incubación para cada lavado
  4. Montura
    1. Elimine la mayor cantidad de PBS posible. Lave los enteroides teñidos con 70% de glicerol 1x.
    2. Levante los enteroides de la placa usando un bucle de inoculación de 1 μL o una punta cortada de 200 μL y monte con glicerol al 70% en un portaobjetos de microscopio de vidrio.
    3. Para preservar la estructura 3D de los enteroides, asegúrese de un espacio de 0,5-1 mm entre la corredera de vidrio inferior y el cubreobjetos. Use recortes de lámina delgada de caucho de silicona o cubreobjetos de vidrio para crear un espacio entre la corredera de vidrio y el cubreobjetos. Los enteroides ahora se pueden visualizar con un microscopio confocal.

5. Preparación para la microinyección de enteroides

NOTA: El protocolo de microinyección es un protocolo modificado de Hill et al.16 para adaptarse a los recursos y la configuración. Algunos de los pasos de preparación deben completarse con unos días de anticipación.

  1. Configuración de la configuración de microinyección
    1. Coloque el aparato de microinyección dentro de un armario de bioseguridad o en un mostrador limpio, según el objetivo de los experimentos, de la siguiente manera: un microscopio estereoscópico para la visualización, un micromanipulador con perillas de control de los ejes X, Y y Z montadas en un soporte pesado junto al microscopio, un soporte de micropipeta montado en el brazo del micromanipulador, un tubo de microinyección que conecta el soporte de micropipeta y una jeringa con una llave de paso de tres vías, luego a una bomba neumática y una fuente de aire de pared conectada a la bomba (Figura 1).
    2. Desinfecte el aparato de microinyección con etanol al 70% antes del uso experimental y después. Pruebe el posicionamiento del microscopio y el micromanipulador para que se ajusten a las especificaciones físicas deseadas, incluido el movimiento de las perillas del eje para garantizar que la micropipeta pueda alcanzar la muestra objetivo.
  2. Preparación de la micropipeta
    NOTA: Realice estos pasos con antelación.
    1. Utilice un extractor de micropipetas para tirar de los tubos capilares de vidrio en las micropipetas.
    2. Debajo del microscopio estéreo, coloque la micropipeta en un soporte de micropipeta horizontal (Figura 2), concéntrese en las puntas y corte las puntas con un par de microtijeras mientras mira a través de los oculares del microscopio. Prepare alrededor de 10-15 micropipetas con un tamaño de punta similar para cada experimento.
    3. Pruebe el tamaño de la punta extrayendo 0.5-1 μL de líquido y cuente cuántas bombas se necesitan para vaciar el volumen. Pruebe varios tamaños de punta para encontrar el tamaño apropiado para el experimento. Un tamaño de punta apropiado expulsa aproximadamente 10-30 nL de volumen por bomba.
    4. Guarde las micropipetas de vidrio cortado en una caja o tubo limpio sin dañar las puntas.
      NOTA: Las micropipetas precortadas están disponibles comercialmente.
  3. Preparación enteroide
    1. Coloque una placa de enteroides en su mayoría grandes y esféricos sobre hielo. Reemplace el antiguo medio de crecimiento con un medio fresco.
    2. Disocie suavemente los puntos de la matriz de la membrana basal de la placa con un elevador celular. Agite los puntos de gel de lado a lado sobre hielo para romper la matriz de la membrana basal sin perturbar los enteroides.
    3. Seleccione alrededor de 10-15 enteroides esféricos con una punta de pipeta cortada de 20 μL bajo un microscopio estereoscópico y agréguelos a la matriz de la membrana basal para obtener 285 μL de mezcla de concentración de proteína de 8 mg / ml.
    4. Pipeta hacia arriba y hacia abajo suavemente con una punta cortada de 200 μL para mezclar los enteroides sin romperlos. Coloque cinco puntos de gel de 50 μL en el centro de una placa de Petri redonda de cultivo celular de 35 mm x 10 mm o una con dimensiones similares.
    5. Incubar los puntos de gel enteroides a 37 °C durante 10 minutos para que se solidifiquen. Luego, agregue 1 ml de medio de crecimiento fresco al plato. Incubar los enteroides durante al menos 2-3 días para la estabilización y hasta que los enteroides alcancen un tamaño apropiado de 0,5-1 μL.
      NOTA: Es importante tener un plato con una pared baja para facilitar el acceso a los enteroides y un diámetro pequeño para un menor volumen de medio de crecimiento.
  4. Microinyección de dextrano-FITC y material probado
    1. Gire la llave de paso de tres vías hacia la bomba neumática. Llene la micropipeta con el material inyectado, en este caso dextrano-FITC con o sin LPS.
    2. Prepara una placa de Petri cubierta con una tira de película transparente. Coloque de dos a cuatro puntos de 1 μL de material inyectado en la película.
    3. Utilice el micromanipulador para conducir la punta de la micropipeta justo dentro del líquido, pero por encima de la película bajo la visualización de un microscopio estéreo. Tire suavemente de la jeringa para extraer el material inyectado en la micropipeta.
    4. Llene la micropipeta con 2-4 μL de material inyectado y empuje la jeringa para eliminar el aire en la punta de la micropipeta. Inspeccione la columna de material inyectado en la micropipeta para asegurarse de que no haya bolsas de aire. Registre el volumen de material inyectado que se retiró dentro de la micropipeta.
      NOTA: El líquido es visible en un color verdoso debido al dextrano-FITC.
    5. Encienda la fuente de aire conectada a la bomba neumática, que proporciona una presión de aire de aproximadamente 60 psi. Encienda la bomba y ajuste la duración de la bomba a 10-15 ms. Gire la llave de paso de la jeringa para abrir la línea desde la bomba hasta la micropipeta.
      NOTA: La mayor duración de la bomba permite liberar más material por bomba. Se recomienda utilizar la misma duración de la bomba y micropipetas con tamaños de punta similares para todo el experimento para estimar el volumen inyectado.
    6. Retire los enteroides de la incubadora de cultivo celular y coloque los platos encima de un ladrillo de espuma caliente en un recipiente cubierto para limitar la exposición a la luz después de la microinyección.
    7. Coloque la placa de Petri con enteroides bajo el microscopio estereoscópico y mueva las perillas del micromanipulador para colocar la punta de la micropipeta en un ángulo de aproximadamente 35°-45° con respecto a la superficie horizontal (Figura 3). Esto requiere algo de práctica por adelantado.
    8. Visualice y mapee los enteroides en cada placa de Petri bajo el microscopio para hacer un plan para inyectar alrededor de 3-5 enteroides esféricos por plato.
    9. Una vez que la punta de la micropipeta esté cerca de la superficie del líquido, mire dentro de los oculares del microscopio para avanzar la punta hacia el enteroide objetivo.
    10. Perfore el enteroide con la punta de la micropipeta haciendo avanzar la perilla del eje Z con un movimiento lento y preciso. La pared enteroide se deprimirá y retrocederá una vez que la punta atraviese la superficie enteroide, momento en el que el avance debe detenerse.
    11. Golpee el pedal de la bomba con un pie y llene el enteroide con la solución dextran-FITC verdosa hasta que se expanda ligeramente. Registre el número de bombas para calcular el volumen bombeado y la concentración de dextrano.
    12. Retire la punta de la micropipeta después de terminar la microinyección y pase al siguiente enteroide. Con la práctica, el proceso puede transcurrir sin problemas.
      1. Si la punta se rompe, sustitúyala por otra micropipeta con un tamaño de punta similar. Extraiga suficiente volumen de material inyectado para todos los enteroides del mismo grupo de exposición y cambie la micropipeta entre los materiales inyectados para evitar la contaminación cruzada.
    13. Coloque la placa enteroide inyectada bajo cubierta para evitar la exposición a la luz.
  5. Recolección y medición de Dextran-FITC
    1. Después del procedimiento de microinyección, retire inmediatamente los medios de cultivo. Lavar con un medio de cultivo fresco 2x para eliminar cualquier residuo de dextrano-FITC. Agregue nuevos medios y registre el tiempo como tiempo 0 después de la microinyección.
      NOTA: Es posible que necesite una segunda persona para llevar a cabo este paso sin interrumpir el proceso de microinyección.
    2. Recoja 200 μL de medios de cultivo en un tubo de microfuga opaco de 0,5 ml y luego reemplace los medios de cultivo retirados con el mismo volumen de medios de cultivo frescos a las 1 h, 2 h, 4 h, 6 h, 8 h, 10 h y 12 h después de las microinyecciones.
      NOTA: El intervalo de tiempo puede variar dependiendo del experimento. Con una exposición basolateral, el medio de reemplazo debe contener la exposición a la misma concentración.
    3. Almacenar los medios de cultivo recolectados a 4 °C y medir la concentración de dextrano en un plazo de 24 h. Almacene los medios sobrantes a -80 °C para otros análisis. Al final de la recolección de medios de cultivo, recoja los enteroides para la extracción de ARN o la obtención de imágenes, si es necesario.
    4. Mida las concentraciones de dextrano-FITC con un lector de microplacas de fluorescencia. Construya una curva estándar para cada placa utilizando diluciones seriadas y ajustando una línea de regresión lineal como se muestra en la Figura 4.
    5. Corrija la absorbancia para el volumen eliminado de medios de cultivo que contienen dextrano que se reemplazó con medios de crecimiento frescos sin dextrano de la siguiente manera: la eliminación de 200 μL de 2 ml de medios de cultivo es del 10% en volumen.
      Absorbancia corregida a las 2 h = (absorbancia a 1 h x 10%) + absorbancia medida a las 2 h
      La absorbancia del primer medio corregido no necesita corrección. Luego, calcule la concentración de dextrano a partir del valor de absorbancia corregido utilizando la ecuación de curva estándar.
    6. Para la normalización, divida la concentración de dextrano por el número total de bombas para cada placa de Petri y luego multiplíquela por el mayor número total de bombas por placa.
      NOTA: Todas las exposiciones se realizan por triplicado (tres placas de Petri por exposición con 3-5 enteroides microinyectados por placa). Los valores medios de los triplicados se comparan entre exposiciones utilizando una prueba t de Student.

Resultados

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Establecimos una línea celular enteroide a partir de tejido fetal de íleon donado siguiendo protocolos modificados proporcionados por nuestros colaboradores en el Laboratorio de Modelado de Tejidos Traslacionales de la Universidad de Michigan12. La línea celular enteroide dio negativo para la infección por micoplasma . Los enteroides se tiñeron positivos para villana, CDX2, lisozima, mucina, claudina, ocludina y zónula-ocluden 1 (Figura 5), confirmando su origen epitelial del intestino delgado. Los enteroides fueron microinyectados con 4 kDa dextrano-FITC a 5 mg/mL en PBS (Figura 6). Las exposiciones de prueba fueron LPS a diferentes concentraciones, 0,1 mg/ml y 0,5 mg/ml, mezclado con dextrano-FITC para la exposición apical. Como control positivo, utilizamos 2 mM de EGTA y lo añadimos a los medios de cultivo a las 4 h después de la microinyección de dextrano. EGTA es un quelante de calcio que aumenta la permeabilidad de las uniones estrechas. Los controles negativos fueron microinyectados con dextrano-FITC solo en PBS. Para la exposición basolateral, los medios de reemplazo para la recolección de medios de cultivo en serie tuvieron la misma concentración de la exposición (es decir, 2 mM EGTA). Los resultados muestran un claro aumento en la concentración de dextrano en medios de cultivo después de la adición de EGTA en comparación con el control negativo, PBS. La exposición apical de LPS indujo una mayor permeabilidad del dextrano a partir de aproximadamente 8 h después de la exposición de una manera dependiente de la concentración (Figura 7).

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Figura 1: Configuración del microinyector. La configuración incluye un microscopio estéreo, un micromanipulador montado en un soporte magnético sobre una placa base de acero pesado, un soporte de micropipeta conectado a una jeringa con una llave de paso de tres vías y una bomba neumática. El suministro de aire de pared proporciona la presión de aire, que está regulada por la bomba para generar un volumen de bomba constante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Soporte horizontal para micropipetas. Esta plataforma de plástico está diseñada para sostener la micropipeta después de tirar del tubo capilar de vidrio para cortar la punta. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Posicionamiento de micropipetas. Un ángulo de 35°-45° es ideal para inyectar enteroides ubicados en el centro de la placa de Petri. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Curva estándar de dextrano. La curva se construyó con absorbancia fluorescente de 10 diluciones seriadas de dextrano en duplicados. Se ajustó una línea de regresión lineal para generar una ecuación de regresión. Las barras de error son SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 5: Biomarcadores fluorescentes de enteroides. DAPI para la tinción del núcleo es azul. Se muestran los siguientes biomarcadores: (A) villina, (B) CDX2, (C) lisozima, (D) mucina, (E) claudina, (F) oclusión, y (G) zónula-ocluden 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 6: Enteroides en diferentes etapas . (A) Un enteroide a los 7-10 días de edad es pequeño y con una pared gruesa. (B) Un enteroide que está listo para la microinyección con un tamaño grande, un lumen y una pared de pensamiento, y (C) dextrano-FITC fluorescente dentro de un enteroide 2 días después de la microinyección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 7: Permeabilidad del dextrano-FITC después de la microinyección . (A) Los niveles medidos de dextrano en los medios fueron más altos después de la adición de EGTA en comparación con PBS. (B) El LPS microinyectado de 0,5 mg/ml indujo una mayor fuga de dextrano de la luz enteroide al medio que el LPS microinyectado de 0,1 mg/ml a partir de las 8 h después de la inyección. *valor p < 0,05, las barras de error son SEM, n = 3, se utilizó una prueba t de Student para calcular la significación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo detalla el establecimiento de enteroides a partir del tejido intestinal fetal, así como la caracterización del modelo con tinción inmunofluorescente y pruebas de permeabilidad epitelial. La permeabilidad de los enteroides se probó utilizando una técnica de microinyección y mediciones seriadas del curso temporal de la concentración de dextran-FITC filtrada en los medios de cultivo. La novedad de este protocolo es la exposición apical que se asemeja más a la fisiología intestinal humana en comparación con la exposición basolateral en los medios de cultivo7. En estudios previos, Hill et al. utilizaron imágenes seriadas y el cálculo de la intensidad de fluorescencia a lo largo del tiempo16. Ares et al. expusieron la membrana basolateral de un modelo epitelial a LPS y luego compararon el patrón de expresión génica celular7. En comparación, utilizamos la exposición apical de los reactivos probados y luego examinamos las posibles alteraciones en la permeabilidad bruta midiendo las concentraciones seriadas de dextrano filtrado en los medios de cultivo. Nuestro método también permite el análisis comparativo en serie de citoquinas producidas por células epiteliales en medios de cultivo y la expresión génica mediante la recolección de ARNm celular. El LPS ha sido comúnmente utilizado para estudiar la lesión intestinal en animales y modelos in vitro debido a su capacidad para inducir permeabilidad e inflamación 7,17. Cuando se probó LPS en este modelo, la permeabilidad epitelial se diferenció por la concentración de exposición. Este protocolo se puede ampliar para estudiar otras patologías de enfermedades utilizando diferentes materiales microinyectados y mediciones de resultados.

Los pasos críticos en este protocolo incluyen el establecimiento de enteroides a partir de tejidos intestinales fetales, la caracterización enteroide y la técnica de microinyección. La integridad de este estudio depende de un muestreo celular preciso. El uso de puntos de referencia anatómicos y vasos sanguíneos es útil para garantizar la selección de células del intestino delgado. Debido al robusto crecimiento y diferenciación de las células madre intestinales fetales, no es necesario un procedimiento extenso para aislar las células madre de otras células epiteliales. Después de que se han establecido los enteroides, es importante confirmar las características del modelo mediante la tinción de proteínas y marcadores celulares. En este protocolo, los enteroides se tiñeron para enterocitos usando villina y CDX2, células de Paneth usando lisozima, y células caliciformes usando mucina, todas las células que se encuentran dentro del epitelio del intestino delgado18,19,20. A diferencia de las líneas celulares individuales tradicionales que muestran un tipo de célula, los enteroides establecen todos los tipos de células a partir de las células madre progenitoras intestinales8. La parte de tinción de este protocolo se puede modificar para los marcadores celulares específicos de interés. Crucial para la fiabilidad de este protocolo es la técnica de microinyección. La consistencia de las puntas de micropipeta se puede verificar midiendo el volumen por bomba utilizando la solución dextrano-FITC y visualizando el diámetro de las puntas bajo el microscopio. Debido al riesgo de contaminación, la misma micropipeta no puede utilizarse para más de una exposición. Además, la forma y el crecimiento de los enteroides pueden verse influenciados por el contenido de sus medios de crecimiento. Encontramos que los enteroides esféricos en lugar de coliflor proporcionaron mejores modelos para la microinyección. La forma esférica puede ser inducida por un factor Wnt mayor en el medio21.

Este protocolo depende en gran medida de la habilidad del intérprete en microinyección para reducir las variaciones, especialmente en mediciones sensibles al tiempo. Las variaciones se pueden minimizar teniendo el mismo intérprete experimentado con técnicas consistentes, utilizando el mismo origen celular para evitar la variación genética, probando en el mismo pasaje para eliminar el sesgo de madurez y cultivando las células en el mismo tipo de medios para una diferenciación celular similar. Los componentes de los medios de crecimiento pueden inducir una diferenciación variable de las células madre in vitro en lugar de en un entorno in vivo . Por ejemplo, in vivo, la lisozima no se expresa hasta las semanas 22-24 de desarrollo gestacional cuando las células de Paneth se forman y se vuelven funcionales22. Sin embargo, pudimos detectar lisozima en nuestros enteroides establecidos a partir de intestinos fetales de 10 semanas. Este método puede limitar el número de exposiciones probadas a la vez debido a la alta habilidad técnica requerida para la microinyección. La fuga de dextrano del orificio de perforación de microinyección puede afectar la evaluación de la permeabilidad. Para eliminar este efecto, se recomiendan lavados triples inmediatamente después de la microinyección para eliminar el dextrano residual del procedimiento. La concentración de dextrano en el medio debe medirse cada hora durante 4-6 h después de la microinyección. Los experimentos con un aumento significativo de la concentración de dextrano dentro de las 2-4 h posteriores a la inyección deben excluirse del análisis final.

Este método tiene varias ventajas. Requiere un menor costo y menos recursos en comparación con las monocapas derivadas de enteroides en transwell. Además, se puede ampliar a otras exposiciones, como bacterias vivas o virus, para estudiar la interacción inicial entre los microbios intestinales y el epitelio. La luz cerrada del enteroide puede mantener un crecimiento estable de bacterias vivas microinyectadas sin contaminación de los medios de crecimiento13. A diferencia de la monocapa que está expuesta a los medios de crecimiento y al oxígeno de incubación, la luz cerrada es un espacio estrecho y aislado. Un lumen cerrado no permite la comunicación con los medios de crecimiento y un contenido de oxígeno luminal que es menor con el tiempo con el crecimiento bacteriano vivo13.

El uso de tejido intestinal fetal representa con mayor precisión el epitelio intestinal de los recién nacidos prematuros en comparación con las células madre intestinales adultas o los modelos animales7. Además, la polaridad de los enteroides permite exposiciones y mediciones tanto apicales como basolaterales23. Los enteroides forman una luz cerrada con menor concentración de oxigenación, que imita más de cerca la concentración de oxigenación de los intestinos24. A diferencia de los protocolos tecnológicamente más avanzados16, el uso de mediciones brutas de medios permite una mayor accesibilidad de esta técnica. El experimento demostró que la fuga epitelial puede ser inducida por la exposición apical al LPS y depende de la concentración. Dado que este método examina los cambios en la concentración filtrada de dextrano, es útil para detectar cambios funcionales macroscópicos en uniones estrechas. La recolección y secuenciación del ARN mensajero de los enteroides expuestos y el análisis de Western blot pueden complementar el análisis de los cambios funcionales macroscópicos. Este modelo estudia la integridad del epitelio intestinal en un sistema que se asemeja mucho al entorno prematuro y, por lo tanto, se puede utilizar para obtener una mejor comprensión de las lesiones intestinales prematuras y otras patologías de enfermedades.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos los autores declaran que no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos al Dr. Ian Glass y al personal del Laboratorio de Investigación de Defectos Congénitos de la Universidad de Washington por compartir los tejidos fetales. También agradecemos al Dr. Michael Dame y al Dr. Jason Spence en el Laboratorio de Modelado de Tejidos Traslacionales de la Universidad de Michigan por su interminable apoyo y orientación durante todo el proceso.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Anfotericina 250 uL/mLGibco15-290-026
Anti-CDX-2 [CDX2-88] 0,5 mL concentrado de ratón, IgG, monoclonalBiogenexMU392A-5UC
Anticuerpo anti-Claudina 2 (AB53032)ABCAMAB53032
Anticuerpo anti-Claudina 3 (AB15102)ABCAMAB15102
Anticuerpo anti-LYZ producido en conejoMillipore SigmaHPA066182-100UL
Anticuerpo Anti-Mucina 2/MUC2 (F-2): sc-515032Santa Cruzsc-515032
Anti-Villin, Clon VIL1/4107R 0.5mL concentrado Conejo, IgG, monoclonalBiogenexNUA42-5UC
Albúmina sérica bovina (BSA)Millipore SigmaA8806
Placas de cultivo celular, CytoOne Placas no tratadas de 12 pocillos USA Scientific Inc50-754-1395
Placas de cultivo celular, placas CytoOne de 6 pocillos no tratadas USA Scientific Inc50-754-1560
Centrífuga con cubos de tubo de 15 mLEppendorf 05-413-110
CHIR 99021Tocris Bioscience4423
Microscopio confocal Olympus FV1200N/AO un microscopio similar
Tubos de centrífuga cónicos, 15 mlFalcon05-527-90
Cubreobjetos para portaobjetos de microscopioFisher Scientific12-544-DP
Bisturíes desechablesMopec22-444-272
Solución de Dmidino-2-fenilindol (DAPI) (1 mg/mL)Fisher Scientific62248
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS, 1X)Fisher ScientificAAJ67802K2
Etilenglicol-bis(β-aminoetílico éter)-N,N,N′,N′-sal tetrasódica del ácido tetraacético (EGTA)Millipore SigmaE8145-10G
Fluoresceína isotiocianato dextrano (Dextran-FITC) 4 kDaMillipore Sigma46944
Lectorde microplacas de fuorescenciaAgilent BioTekSynergy HTX
Gentamicin 50 mg/mLGibco15-750-060
Tubos capilares de vidrio, borosilicato de un solo barril, 1x0,5 mm, 6" (cortado por la mitad antes de tirar)A-M systems626500
Anticuerpo secundario de alta adsorción cruzada IgG (H+L) anti-ratón de cabra, Alexa Fluor Plus 594Fisher ScientificA32742
Anticuerpo secundario anti-conejo IgG (H+L) altamente adsorbido por cabra, Alexa Fluor Plus 488Fisher ScientificA32731
Suero de cabraFisher Scientific16210064
ImageJ softwareNIHN/Ahttps://imagej.nih.gov/ij/download.html
IntestiCult Medio de crecimiento de organoides (humano)Célula madre  Tecnologías  06010
Lipopolisacáridos de  Escherichia coli  O111: B4Millipore SigmaL4391-1MG
Soporte magnéticoWorld Precision Instruments M10
Matrigel Matriz de Membrana Basal, sin LDEV, 10 mL Corning354234  concentración de proteínas > 9 mg/mL preferiblemente
Micro pinzasFisher Scientific13-820-078
Micro tijerasFisher Scientific08-953-1B
MicromanipuladorWorld Precision Instruments M3301
Extractor de micropipetasWorld Precision Instruments SU-P1000O un equipo similar Portaobjetos
de microscopioFisher Scientific22-034486
Anticuerpo policlonal de ocludinaFisher Scientific  71-1500
Paraformaldehído 32% solución acuosaELECTRON  MICROSCOPY SCIENCESRT 15714
Placas de Petri, 35x10 mmFisher Scientific150318
Placas de Petri, 60x15 mmFisher Scientific12-565-94
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)Fisher Scientific10010031
PicoPumpWorld Precision Instruments3260
Puntas de pipeta, sin filtrar, 1000 uLFisher Scientific21-402-47
Puntas de pipeta, sin filtrar, 20uL Fisher Scientific21-402-41
Puntas de pipeta, sin filtrar, 200uL Fisher Scientific21-236-54
Sistema neumático PicoPumpWorld Precision InstrumentsSYS-PV820o un sistema de picobomba similar
Primocin 50 mg/mL, vial de 10x1 mlInvivoGenant-pm-1
Placa base de aceroWorld Precision Instruments5052
Microscopio estereoscópicoZeiss stemi 350O un microscopio similar
ThermoSafe PolarPack Ladrillos de espumaSonoco03-531-53
Triton X-100Millipore SigmaT8787
Suministro de aire de paredN/AN/A
Y-27632 diclorhidratoTocris Bioscience1254
ZO-1 Anticuerpo policlonalFisher Scientific61-7300
interruptor de pie

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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