Summary
本协议描述了冷冻电镜实验中倾斜单颗粒数据收集的通用且易于实施的方案。对于由于粘附空气-水界面而遭受优先方向偏差的样品,该程序对于获得高质量的EM图特别有用。
Abstract
通过冷冻电子显微镜(cryo-EM)进行的单颗粒分析(SPA)现在是高分辨率结构生物学的主流技术。SPA的结构测定依赖于获得在薄冰层内玻璃化的大分子物体的多个不同视图。理想情况下,均匀分布的随机投影方向的集合将相当于物体的所有可能视图,从而产生以各向同性方向分辨率为特征的重建。然而,在现实中,许多样品都受到粘附在空气-水界面上的优先取向颗粒的影响。这导致数据集中的角度取向分布不均匀,重建中出现不均匀的傅里叶空间采样,从而转化为以各向异性分辨率为特征的地图。倾斜试样载物台提供了一种可推广的解决方案,通过提高取向分布的均匀性,从而改善傅里叶空间采样的各向同性,克服分辨率各向异性。该协议描述了使用Leginon(一种用于自动图像采集的软件)的倾斜阶段自动数据收集策略。该程序易于实施,不需要任何额外的设备或软件,并且与用于生物大分子成像的大多数标准透射电子显微镜(TEM)兼容。
Introduction
在过去十年中,直接电子探测器1,2,3的出现刺激了使用单粒子冷冻电镜4,5,6解决的大分子和大分子组件的高分辨率结构的数量呈指数级增长。几乎所有纯化的大分子物质都有望使用冷冻电镜进行结构测定,除了最小的蛋白质~10 kDa大小或小于7。网格制备和结构测定所需的起始材料量至少比其他结构测定技术(如核磁共振波谱和X射线晶体学4,5,6)少一个数量级。
然而,通过冷冻电镜测定结构的主要挑战涉及合适的成像网格准备。一项使用不同玻璃化策略和网格评估不同样品的广泛研究表明,在冷冻电镜网格上玻璃化样品的大多数方法都会导致大分子优先粘附在空气-水界面上8。这种依从性可能导致四个次优结果:(1)大分子样品完全变性,在这种情况下,不可能成功的数据收集和处理;(2)样品部分变性,在这种情况下,有可能从未受损的大分子区域获得结构见解;(3)样品保留了天然结构,但图像中仅表示一组相对于电子束方向的粒子取向;(4)样品保留了天然结构,并且图像中表示了相对于电子束方向的一些但不是全部可能的粒子取向。对于情况(3)和(4),倾斜数据收集将有助于最大限度地减少影响重建冷冻电镜图的方向分辨率各向异性,并为各种样品提供可推广的解决方案9。从技术上讲,倾斜也可以使情况(2)受益,因为变性可能发生在空气 - 水界面处,并且同样限制了数据中表示的不同方向的数量。数据集中方向偏差的程度可以通过试验溶液添加剂来改变,但缺乏广泛的适用性阻碍了这些试错法。通过改变成像实验9 的几何形状,以单个优化的倾斜角度倾斜样品台足以改善方向分布(图1)。由于优先取向样品相对于电子束的几何配置,对于每个优先取向的簇,倾斜网格会生成相对于团簇质心的照明角度锥。因此,这分散了视图,从而改善了傅里叶空间采样和方向分辨率的各向同性。
在实践中,倾斜舞台有一些危害。倾斜标本载物台会在视场上引入焦点梯度,这可能会影响对比度传递函数 (CTF) 估计的准确性。倾斜的数据收集还可能导致光束诱导的粒子运动增加,这是由于对倾斜标本进行成像时电荷效应增加引起的。网格倾斜也会导致表观冰厚度增加,这反过来又导致显微照片嘈杂,并可能最终影响重建的分辨率5,9,10。通过应用协议和讨论部分中简要描述的高级计算数据处理方案,可以克服这些问题。最后,倾斜会导致粒子重叠增加,从而阻碍后续的图像处理管道。虽然这可以通过优化网格颗粒浓度在一定程度上缓解,但它仍然是一个重要的考虑因素。这里描述了一种易于实现的协议,用于使用Leginon软件套件(一种自动图像采集软件)进行倾斜数据收集,该套件可开放访问并与各种显微镜11,12,13,14兼容。该方法至少需要版本 3.0 或更高版本,版本 3.3 及更高版本包含专门的改进,以实现倾斜数据收集。此协议不需要额外的软件或设备。有关计算基础结构和安装指南的大量说明在别处提供15.
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Protocol
1. 样品制备
- 使用包含金箔和金网格支撑的网格16 (见 材料表),因为倾斜的数据收集会突出光束引起的运动17。
注意:对于本研究,在加湿(大于80%)的冷藏室(~4°C)中使用手动浸入和印迹技术18 对网格上的样品进行玻璃化。 - 除非绝对必要,否则避免使用包含铜支架和碳箔的网格或连续的非晶碳层,因为这些网格可能导致当样品台倾斜时更大的光束诱导运动16 。
注意:与非晶碳19,20相比,替代支撑层(例如石墨烯/氧化石墨烯)似乎减少了光束引起的运动。 - 预先筛选网格并确定以可接受的冰厚度和颗粒分布为特征的区域。包含太紧密堆积颗粒的网格将导致倾斜数据收集过程中颗粒重叠,这可能会影响下游数据处理步骤。
注意:这些步骤是主观的,因为通过目视检查颗粒对比度清晰的区域的散焦图像来识别良好的冰区域。这可能不适用于所有样品,因为某些样品无法在薄冰区域有效分布,导致数据收集过程中出现挑战(在讨论部分描述)。 - 玻璃化含有蛋白质样品的网格。在这里,出于演示目的,我们使用饥饿期间的DNA保护(DPS)蛋白(见 材料表),范围为0.1-0.5mg / mL,金箔和金支撑网格。
注意:如前所述纯化蛋白质,除了没有进行TEV蛋白酶切割21。目标样品的蛋白质浓度范围必须单独优化,因为很难衡量普遍适用的理想范围,并且几乎肯定会因不同样品而异。
2. 设置倾斜数据收集
- 对准显微镜以确保标本的平行照明并最大限度地减少彗差22.
注意:显微镜必须对准良好,以便进行标准SPA数据收集,不得倾斜载物台。倾斜数据收集不需要特殊的对齐,但良好的对齐将确保定位和成像顺利进行。 图 2 提供了比较倾斜和未倾斜数据收集的一般方案。 - 记录没有载物台倾斜的网格图集,以识别适合数据收集的正方形,或在方形 采集节点中使用的放大倍率下手动检查正方形。寻找箔片完好无损、看起来不脱水且具有理想冰厚度的正方形。
注意: 方形采集 节点是用于 Leginon 中多尺度成像的低放大倍率节点。- 对于典型的不倾斜自动数据收集,请记录网格图集,该图集提供了整体网格质量的概述,并初步指示了适合数据收集的区域。
- 随后,通过图集选择合适的方块并将它们提交队列。然后,通过手动选择孔或通过自动EM孔查找器,排队并提交孔目标。
- 最后,使用自动电磁孔查找器提交高放大倍率曝光目标。
注意:对于倾斜数据收集,可能需要手动排队以获得一致的结果,特别是如果最佳倾斜角度尚未预先确定,并且可能会在数据收集期间进行调整。如果先前已确定用于数据收集的倾斜角度,也可以使用预定义的载物台倾斜来记录网格图集。
- 将样品载物台移动到感兴趣的正方形。
- 使用α摆动器在15°载物台倾斜±确定载物台位置的共心高度。使用显微镜的键盘面板调整Z高度,使载物台达到共心高度。确保在α摆动例程期间图像偏移最小。
注意:如果未正确识别共心高度,则在以方形放大倍率倾斜载物台时将观察到较大的图像偏移。如果栅格上存在局部变形,例如,如果栅格在成像区域附近断裂或严重弯曲,也会发生这种情况。虽然最好避免使用此类区域进行数据收集,但如果这些区域是少数有希望的数据收集区域之一,则必须准确估计真心高度。 图 3 显示了未正确识别真心高度的定位如何导致方形放大倍率中的大图像偏移。 - 找到更精确的 Z 高度,使用 对焦器节点,然后按下 模拟。
- 通常,在方形采集节点中使用的放大倍率下估计聚焦器节点中的 Z 高度。
注意: 聚焦器 节点对焦序列还可以包括在数据收集期间孔 采集节点 (Leginon软件中的工具)放大倍率处的精细Z焦点估计。 - 调整焦点 器节点 的设置,并在正方形初始排队期间启用/禁用精细 Z 焦点选项。
注意:确保在自动数据收集开始时准确识别以心为中心的高度非常重要,这可能需要重新启用精细 Z 焦点(步骤 2.10)。
- 通常,在方形采集节点中使用的放大倍率下估计聚焦器节点中的 Z 高度。
- 将样品载物台倾斜到所需的倾斜角度,以便在真正的真心高度收集数据,并在必要时将载物台重新居中。本研究使用0°、30°和60°倾斜角。按“方形采集”节点中的“模拟”开始排队孔采集节点曝光的目标。
注意:如步骤2.2.1所示,网格图集可以使用预定义的载物台倾斜来记录,这样就无需在此步骤中再次倾斜载物台。如果预定义了用于数据收集的倾斜角度,则此方法效果很好,并且可以加快该过程。当前的协议是在考虑新标本的情况下编写的,其中用户可能希望测试不同的倾斜角度以进行数据收集。 - 选择 Z焦点 目标和具有适合高放大倍率曝光的孔的区域。
- 按 提交目标以排队 等待映像。在完成所有方块的排队之前,不要按提交排队的目标。
- 将试样载物台恢复到未倾斜状态。移动到下一个正方形并重复步骤2.3-2.8,直到足够数量的孔暴露排队。
- 转到 孔瞄准节点 ,并在所有方块排队后按 提交排队目标 。
注意:如果之前禁用了精细 Z 焦点以节省时间(步骤 2.5),则需要在提交队列之前重新启用它。 - 手动检查高倍率 曝光采集节点 选择的目标,以测试当标本载物台倾斜时,自动EM孔查找器是否可以准确识别合适的图像采集区域。
- 在此过程中,在 曝光采集节点 设置中选择“允许用户验证所选目标”。用户对定位准确性感到满意后,请取消选择此选项以自动收集数据。
注意:高倍率曝光采集节点中的目标通常使用光束倾斜图像偏移策略进行成像,该策略同样适用于倾斜和未倾斜数据收集23,24,25,26。为了在下游数据处理步骤中准确估计CTF,必须对光束倾斜图像偏移数据收集策略进行透镜-彗差校准。
- 在此过程中,在 曝光采集节点 设置中选择“允许用户验证所选目标”。用户对定位准确性感到满意后,请取消选择此选项以自动收集数据。
3. 数据处理
- 通过对录制的电影进行运动校正、CTF 估计、粒子选择以及在数据收集期间生成初始重建,启动动态数据处理10、27、28、29。
注意:在本研究中,cryoSPARC Live10 (见 材料表)已用于预处理。动态数据处理提供初始冷冻电镜重建和角度分布的近似值,这可以告知用户分辨率各向异性的程度。反过来,这些可以用来指导用户用于数据收集的倾斜角度是否足够高。 - 可视化重建的地图并绘制欧拉角分布,以测量首选粒子方向的范围。
注意:欧拉角分布可以直接转换为傅里叶空间采样分布,以确定分辨率各向异性的潜在程度。已经开发了一个图形用户界面(GUI),以帮助用户评估欧拉角分布的质量并确定最佳倾斜角30,31。该工具可以从 Github 存储库获得,https://github.com/LyumkisLab/SamplingGui。 - 如有必要,调整收集数据的载物台倾斜角度,以克服优先方向的影响。如果优先方向仍然是一个问题,则可以增加角度,如 3.2 中的地图和欧拉分布所示。或者,用户可能希望将数据收集分成几组,并使用几种不同的倾斜角度(例如 20°、30° 和 40°)进行记录。
注意:尽管大多数TEM必须能够将载物台倾斜至70°,但常见的样品载物台倾斜(我们使用的)范围为20°-40°。
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Representative Results
使用0.3 mg/mL的DPS来演示0°、30°和60°倾斜时的成像。来自不同倾斜角度的数据收集在同一网格上不同网格区域。适合较高角度倾斜的CTF分辨率往往较差,就像在本研究中比较三个数据集时一样。 图4 显示了比较代表性图像和2D分类平均值。尽管在不同的倾斜角度下蛋白质浓度保持不变,但较高的倾斜角度使成像区域在颗粒浓度方面显得更加拥挤。这对于数据处理来说可能是个问题,因为粒子重叠会使 3D 重建和角度细化复杂化。迭代 2D 分类通常使用 0° 和 30° 倾斜数据集生成干净的粒子堆栈,而 60° 数据集需要仔细清理粒子堆栈,以确保类平均值显示相邻粒子的最小重叠。红色框中图 4C 中的类平均值表示粒子重叠的示例。虽然在分类过程中重新对中会导致来自相邻粒子的信号得到平均,但大量的粒子重叠会损害粒子对齐参数的准确性,从而产生以较低分辨率为特征的重建。避免颗粒重叠的最佳解决方案是预先筛选具有最佳冰厚度和颗粒分布的网格。评估倾斜数据收集改进的指标的全面定量概述在别处描述32.
图 1:倾斜数据收集的优势和挑战概述。 顶部面板显示网格孔的特写视图。网格条为金色,玻璃状冰蓝色,大分子颗粒为红色。箭头表示电子束的方向。底板表示具有与顶板上相同的配色方案的孔的集合。黑星代表在高放大倍率下采集曝光图像之前的精细对焦目标。倾斜角度表示为“α”。 请点击此处查看此图的大图。
图 2:比较不倾斜和倾斜数据收集策略的工作流程图。未倾斜和倾斜数据收集的逐步比较显示了手动估计真心高度并重新对每个倾斜正方形重新居中的额外步骤(倾斜数据收集为 2 和 3)。工作流的其余部分在两种策略之间是相似的。这些包括选择合适的正方形进行成像(1用于倾斜和未倾斜的数据收集),通过选择用于成像的正方形来启动排队方案(称为模拟;2和4分别用于未倾斜和倾斜的数据收集),提供共心高度焦点目标和队列孔放大采集目标(3和5用于不倾斜和倾斜数据收集, 分别)。最后提交选定的高放大倍率曝光目标队列(分别为4和6用于未倾斜和倾斜数据收集)。请点击此处查看此图的大图。
图 3:具有不同倾斜角度的方形放大倍率下的网格代表性图像。 在靠近和远离真心 Z 高度收集的图像分别显示在顶部和底部面板上。光束的光轴由红色同心环的中心指示。绿色箭头表示感兴趣的平方。在感兴趣的正方形旁边有一个断开的格网要素以供参考。移除物镜光圈以方便查看。比例尺 = 20 μM。 请点击此处查看此图的大图。
图 4:在不同倾斜角度下收集的代表性孔暴露和 2D 等级平均值。 图(A)、(B)和(C)是指在标本载物台不倾斜0°或倾斜至30°和60°的情况下进行的成像。受过度拥挤影响的 2D 类平均值显示在 (C) 中的红色框中。比例尺 = 100 nm。 请点击此处查看此图的大图。
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Discussion
由样品粘附在空气-水界面上引起的首选颗粒取向是使用冷冻电镜SPA4,5,6进行常规高分辨率结构测定的最后一个主要瓶颈之一。这里介绍的数据收集方案提供了一种易于实现的策略,用于改善数据集中粒子的方向分布。我们注意到,该协议不需要额外的设备或软件,也不会影响数据收集速度。在倾斜样品的数据采集过程中,以下注意事项很重要。
首先,成像的正方形必须处于以真心为中心的高度,以实现最佳定位。通过以小载物台倾斜角度(通常为0.5°-2°)记录倾斜对图像并根据图像偏移和散焦之间的预定义关系识别焦点来调整真心高度。如果目标正方形需要对真心高度进行较大的调整,这将导致正方形图像的显着图像偏移,使得当载物台再次倾斜时,视野可能会被物镜孔径阻挡。
其次,通常圆形的孔在中等放大倍率下变得越来越长方形,倾斜度更高(孔采集节点 放大)。在没有准确的图像偏移校准的情况下,对于给定的曝光放大倍率,箔片的一部分可能会与嵌入玻璃体冰中的颗粒一起成像。因此,理想情况下,图像偏移校准必须准确。另一种方法是增加放大倍率,使成像区域相对于孔尺寸减小。在更高的放大倍率下,光束倾斜引起的图像偏移误差对用户导航到玻璃体冰区域的能力的影响较小。然而,这是以减少所得显微照片中的颗粒数量为代价的,与放大倍率的增加成正比。
第三,由于光束引起的运动增加和试样厚度的增加,自动对焦在倾斜数据收集中失败的可能性更大。因此,实现准确的聚焦偶尔会给倾斜数据收集带来一些挑战,特别是如果焦点目标是四个孔中心的金箔,这是不倾斜数据收集的标准做法。在频繁的焦点估计失败的情况下,另一种方法是将孔的边缘设置为焦点目标。这必须为光束倾斜引起的图像对之间的精确相位相关以及随后的焦点调整提供足够的信号。根据我们的经验,对孔边缘进行对焦很少会导致自动对焦失败。
最后,当选择远离网格中心的高放大倍率图像时,倾斜轴相对两侧的目标图像之间的焦点差异可能很大。这种差异的大小取决于倾斜角度和与焦点的距离。例如,在 30° 的倾斜角度下,网格表面上相距 6 μm 且完全垂直于倾斜轴选择的两个目标之间的离焦差异为 3 μm(关系为:增量散焦 = sin(倾斜角度)*(与倾斜轴的距离))。沿倾斜轴选择的目标将具有相同的散焦,而其他目标将介于两者之间。如果在校准期间在Leginon中定义了倾斜轴,软件会自动补偿散焦的变化。然而,用户必须意识到,在高倍率成像过程中仍有可能出现更大的焦距梯度。大焦点渐变对最终重建的影响最小 33,但在数据处理过程中可能需要使用较大的框尺寸以防止混叠效应。在这种情况下,可能需要在数据采集过程中使用较窄的离焦范围,散焦的随机化自然来自倾斜载物台。数据处理期间每个粒子的散焦调整可以提高最终重建的分辨率。然而,由于CTF拟合的准确建模对于高载物台倾斜角度可能具有挑战性,因此必须注意监测数据的质量,并在曝光管理期间进行CTF拟合。通常,次优冰厚会导致 CTF 估计拟合建模的准确性较差。因此,必须注意在冰薄的区域成像,假设这些区域的颗粒分布足够好。
改进和更均匀的方向分布导致重建的冷冻电镜图的方向分辨率的相应改进。此外,更均匀的方向分布改善了抽样补偿系数,这与全球分辨率30,31直接相关。因此,共同改善取向分布应该提高原子建模和细化的准确性9,30,31。原则上,这将为例行实施倾斜数据收集提供强有力的理由。但是,用户必须注意几个注意事项。首先,焦点梯度和冰厚度的增加会影响整体整体分辨率,这可能是由于背景噪声增加和光束诱导运动增加,以及由此产生的其他间接问题17。预计在冰本身较厚的情况下,这种影响会更加明显。然而,由于大多数样品具有一定程度的优选取向,这反过来可能导致采样不均匀,因此只要将有害影响最小化或减轻,倾斜数据收集通常可能是有益的。其次,对于某些具有严重优先方向特征的样品,可能需要将载物台倾斜至60°。来自我们的工作和同事报告中未发表的轶事证据表明,即使是~40°的倾斜也不足以克服某些标本的分辨率各向异性。基于Baldwin等人31中提出的想法,正在努力确定一组分布的最佳倾斜角度。最后,应该注意的是,原则上,即使以60°倾斜角收集数据,以完全病理单一优选方向为特征的样本重建仍然会缺少30°锥体。在模拟实验中,30°缺失的锥体不太可能对实验解释产生很大影响。60°的倾斜对于即使是病理上最优先取向的标本来说可能也足够了。然而,在载物台可能必须倾斜多达60°的情况下,需要仔细优化视野中粒子的浓度,因为粒子重叠会使数据处理复杂化。由于样品台设计的限制,在标准TEM上不可能倾斜到超过60°(或在某些显微镜载物台上倾斜到70°)。在这种情况下,可能需要对添加剂和样品生化进行额外的优化。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们感谢Bill Anderson,Charles Bowman和Jean-Christophe Ducom(TSRI)在显微镜,Leginon安装和数据传输基础设施方面的帮助。我们还要感谢Gordon Louie(Salk Institute)和Yong Zi Tan(新加坡国立大学)对手稿的批判性阅读。我们感谢Chris Russo(剑桥MRC分子生物学实验室)为我们提供表达DPS的质粒。这项工作得到了美国国立卫生研究院(U54AI150472,U54 AI170855和R01AI136680到DL),国家科学基金会(NSF MCB-2048095到DL),赫斯特基金会(到DL)和Arthur和Julie Woodrow主席(对J.P.N.)的资助。
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cryosparc Live v3.1.0+210216 | Structura Biotechnology | ||
DPS protein | Purification adapted from protocol described in K.Naydenova et al IUCrJ. 2019 Nov 1; 6(Pt 6): 1086–1098. | ||
K2 Summit Direct Electron Detector | Gatan | ||
Leginon software suite | C Suloway et al Journal of Structural Biology 151 (1): pp. 41-60. | ||
Manual plunging device | Homemade guillotine-like device for vitrification of EM grids | ||
Talos Arctica | FEI/Thermo Fisher | ||
UltrAufoil R1.2/1.3 300 mesh grids | Quantifoil | N1-A14nAu30-01 |
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