Recopilación de datos crio-EM de una sola partícula con inclinación de la etapa utilizando Leginon

Sriram Aiyer; Timothy S. Strutzenberg; Marianne E. Bowman; Joseph P. Noel; Dmitry Lyumkis

doi:10.3791/64136

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Artículo de método

Recopilación de datos crio-EM de una sola partícula con inclinación de la etapa utilizando Leginon

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DOI:

10.3791/64136

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1 de julio de 2022

Sriram Aiyer¹ , Timothy S. Strutzenberg¹ , Marianne E. Bowman² , Joseph P. Noel²^,³ , Dmitry Lyumkis¹^,⁴^,⁵

¹Laboratory of Genetics, The Salk Institute for Biological Studies, ²Jack H. Skirball Center for Chemical Biology and Proteomics, The Salk Institute for Biological Studies, ³Department of Chemistry and Biochemistry, University of California San Diego, ⁴Graduate School of Biological Sciences, Section of Molecular Biology, University of California San Diego, ⁵Department of Integrative Structural and Computational Biology, The Scripps Research Institute

En este artículo

Resumen

El presente protocolo describe un esquema generalizado y fácil de implementar para la recopilación de datos inclinados de una sola partícula en experimentos crio-EM. Este procedimiento es especialmente útil para obtener un mapa EM de alta calidad para muestras que sufren un sesgo de orientación preferencial debido a la adherencia a la interfaz aire-agua.

Resumen

El análisis de partículas individuales (SPA) por microscopía crioelectrónica (crio-EM) es ahora una técnica convencional para la biología estructural de alta resolución. La determinación de la estructura por SPA se basa en la obtención de múltiples vistas distintas de un objeto macromolecular vitrificado dentro de una fina capa de hielo. Idealmente, una colección de orientaciones de proyección aleatorias uniformemente distribuidas equivaldría a todas las vistas posibles del objeto, dando lugar a reconstrucciones caracterizadas por una resolución direccional isotrópica. Sin embargo, en realidad, muchas muestras sufren de partículas orientadas preferentemente que se adhieren a la interfaz aire-agua. Esto conduce a distribuciones de orientación angular no uniformes en el conjunto de datos y a un muestreo del espacio de Fourier no homogéneo en la reconstrucción, lo que se traduce en mapas caracterizados por una resolución anisotrópica. La inclinación de la etapa de la muestra proporciona una solución generalizable para superar la anisotropía de resolución en virtud de mejorar la uniformidad de las distribuciones de orientación y, por lo tanto, la isotropía del muestreo del espacio de Fourier. El presente protocolo describe una estrategia de recopilación automatizada de datos de etapa inclinada utilizando Leginon, un software para la adquisición automatizada de imágenes. El procedimiento es simple de implementar, no requiere ningún equipo o software adicional, y es compatible con la mayoría de los microscopios electrónicos de transmisión estándar (TEM) utilizados para obtener imágenes de macromoléculas biológicas.

Introducción

El advenimiento de los detectores directos de electrones en la última década ^1,2,3 ha estimulado un aumento exponencial en el número de estructuras de alta resolución de macromoléculas y ensamblajes macromoleculares resueltos utilizando crio-EM 4,5,6 de una sola partícula. Se espera que casi todas las especies macromoleculares purificadas sean susceptibles de determinación de la estructura mediante crio-EM, excepto las proteínas más pequeñas ~ 10 kDa de tamaño ....