Summary
El presente protocolo describe la optimización de los parámetros experimentales cuando se utiliza la estimulación auricular transesofágica para evaluar la susceptibilidad a la fibrilación auricular en ratones.
Abstract
Los modelos de ratón de factores de riesgo genéticos y adquiridos para la fibrilación auricular (FA) han demostrado ser valiosos en la investigación de los determinantes moleculares de la FA. La estimulación eléctrica programada se puede realizar utilizando la estimulación auricular transesofágica como procedimiento de supervivencia, lo que permite realizar pruebas seriadas en el mismo animal. Sin embargo, existen numerosos protocolos de marcapasos, lo que complica la reproducibilidad. El presente protocolo tiene como objetivo proporcionar una estrategia estandarizada para desarrollar parámetros experimentales específicos del modelo para mejorar la reproducibilidad entre estudios. Se realizan estudios preliminares para optimizar los métodos experimentales para el modelo específico bajo investigación, incluida la edad en el momento del estudio, el sexo y los parámetros del protocolo de estimulación (por ejemplo, modo de estimulación y definición de susceptibilidad a la FA). Es importante destacar que se tiene cuidado para evitar altas energías de estímulo, ya que esto puede causar la estimulación de los plexos ganglionares con activación parasimpática inadvertida, manifestada por un bloqueo auriculoventricular (AV) exagerado durante la estimulación y, a menudo, asociado con la inducción de FA artificial. Los animales que demuestren esta complicación deberán excluirse del análisis.
Introduction
La fibrilación auricular (FA) representa una vía común final para múltiples factores de riesgo adquiridos y genéticos. Para los estudios que investigan los mecanismos fisiopatológicos del sustrato de FA, los modelos de ratón son ventajosos dada la facilidad de manipulación genética y el hecho de que, en general, reproducen la susceptibilidad a la FA observada en humanos para diferentes fenotipos clínicos 1,2,3. Sin embargo, los ratones rara vez desarrollan AF4 espontánea, lo que requiere el uso de estudios provocativos de estimulación auricular.
La estimulación eléctrica programada (PES) se puede realizar para evaluar la electrofisiología auricular murina y la susceptibilidad a la FA utilizando estimulación intracardíaca5 o transesofágica6. Si bien el abordaje transesofágico es particularmente ventajoso como procedimiento de supervivencia, su uso se complica por los numerosos protocolos experimentales publicados 7,8 y las fuentes de variabilidad que pueden dificultar la reproducibilidad9. Además, las comparaciones limitadas de protocolos informados dificultan la selección de un protocolo de estimulación apropiado.
El protocolo actual tiene como objetivo utilizar una estrategia sistemática para desarrollar métodos de PES transesofágicos específicos del modelo para evaluar la susceptibilidad murina a la FA con el fin de aumentar la reproducibilidad. Es importante destacar que los estudios piloto iniciales se realizan para optimizar el protocolo de estimulación teniendo en cuenta la edad, el sexo y la variabilidad del modo de estimulación, con una estimulación diseñada para minimizar la estimulación parasimpática inadvertida que puede confundir los resultados9.
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Protocol
Este procedimiento fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de Vanderbilt y es consistente con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. El protocolo se desarrolló utilizando modelos genéticos9 yadquiridos de 10 (por ejemplo, hipertensión) de susceptibilidad a la FA. El operador estaba cegado al fenotipo del ratón en estudio.
1. Selección de animales
- Para los modelos genéticos, someter a los ratones a una estimulación auricular quincenal (es decir, cada dos semanas) como se describe a continuación (ver paso 6.) para determinar el período óptimo de susceptibilidad a la FA.
- Comience el ritmo quincenal a las 8 semanas de edad. Use compañeros de camada de tipo salvaje como controles para reducir la variabilidad. Estudiar ambos sexos, ya que uno puede no desarrollar un fenotipo FA9.
- Para los modelos adquiridos, realice el ritmo después de que los ratones alcancen la madurez física (~ 12 semanas de edad)10. Como se mencionó anteriormente, estudie ambos sexos.
- Durante estos estudios preliminares, realice tanto la estimulación en ráfaga8 (utilizando una duración de ciclo de estimulación fija [CL]) como la estimulación decremental7 (con una estimulación CL progresivamente más corta) para determinar el modo de estimulación óptimo. Separe cada procedimiento por un mínimo de 24 h.
NOTA: A medida que se estudia un número creciente de ratones, revise los datos acumulados para determinar la edad, el sexo y el modo de estimulación óptimos que promueven la FA en ratones susceptibles a la FA pero no en los controles.- Analizar los datos utilizando múltiples definiciones de susceptibilidad a la FA (por ejemplo, número de episodios de FA8, duración total de la FA 9, incidencia de FA4 e incidencia sostenida de FA, comúnmente definida como 10 s 11 o 15 s 12, e incluso hasta 5 min13,14) ya que algunos modelos pueden mostrar un fenotipo de FA para una pero no todas las definiciones 9.
NOTA: La definición de episodio de FA y susceptibilidad a la FA difieren entre los estudios publicados 4,7. Los episodios de FA8 se definen comúnmente como actividad auricular rápida con una respuesta ventricular irregularmente irregular que ocurre durante al menos 1s (Figura 1). Además de la FA, la estimulación auricular también puede inducir aleteo auricular con una respuesta ventricular regular o irregular.
- Analizar los datos utilizando múltiples definiciones de susceptibilidad a la FA (por ejemplo, número de episodios de FA8, duración total de la FA 9, incidencia de FA4 e incidencia sostenida de FA, comúnmente definida como 10 s 11 o 15 s 12, e incluso hasta 5 min13,14) ya que algunos modelos pueden mostrar un fenotipo de FA para una pero no todas las definiciones 9.
- Utilice los parámetros optimizados específicos del modelo y la definición de susceptibilidad a la FA para estudios posteriores en ratones adicionales.
2. Preparación animal
- Anestesiar al ratón en una cámara de inducción utilizando isoflurano al 3% (ver Tabla de Materiales) en 1 L/min de oxígeno al 100%.
NOTA: El isoflurano es dañino. Puede irritar la piel o los ojos y puede causar mareos, fatiga y dolor de cabeza, entre otras toxicidades del sistema nervioso central. Úselo en un área bien ventilada con un método de eliminación apropiado (por ejemplo, bote de carbón activado). - Después de la pérdida del reflejo del pedal, coloque el ratón en posición supina sobre una almohadilla térmica diseñada para mantener la temperatura corporal a aproximadamente 37 °C con las extremidades posteriores pegadas a la superficie de la almohadilla.
- Aplique ungüento lubricante para los ojos en los ojos para evitar que se sequen.
- Coloque una máscara anestésica firmemente sobre la nariz del ratón. Iniciar el mantenimiento de la anestesia utilizando isoflurano al 1% en 1 L/min de oxígeno al 100%. Asegúrese de que las fosas nasales estén libres de obstrucciones, ya que los ratones son respiradores nasales obligados.
- Obtenga un electrocardiograma de superficie (ECG, derivación I) mediante la colocación subcutánea de electrodos de aguja de ECG de 27 G (consulte la Tabla de materiales) conectados a un amplificador biológico y hardware de adquisición de datos en las extremidades anteriores. Conecte a tierra la señal colocando un electrodo de aguja en la extremidad posterior izquierda.
3. Colocación del catéter
- Retire brevemente la máscara de isoflurano del ratón.
- Inserte un catéter de electrodo octapolar 2-F (ancho y espaciado del electrodo = 0,5 mm) conectado a un estimulador y aislador de estímulo (consulte la Tabla de materiales) en el esófago (Figura 2).
- Inserte a una profundidad que se aproxime a la distancia desde la boca (con el cuello extendido) hasta justo por encima del cartílago xifoides.
- Vuelva a colocar la máscara de isoflurano sobre las fosas nasales del ratón.
- Comience la adquisición de datos con el registro continuo de la derivación I del ECG utilizando software de análisis (consulte la Tabla de materiales).
- Ajuste el modo aislador de estímulo a bipolar. Use el par de electrodos más distal durante la estimulación.
- Coloque correctamente el catéter dentro del esófago para permitir la captura. Para ello, aplique un estímulo de 1,5 mA con un ancho de pulso de 2 ms a un CL ligeramente más corto que el CL sinusal (p. ej., use un CL de 100 ms si el CL sinusal es de 120 ms). Coloque cuidadosamente el catéter hasta que se obtenga una captura auricular consistente.
4. Determinación del umbral
- Para determinar el umbral de captura diastólica auricular (TH), inicie la estimulación a 1,5 mA con un ancho de pulso de 2 ms en el CL utilizado para la captura auricular. Disminuir la amplitud del estímulo en incrementos de 0,05 mA hasta la pérdida de captura auricular, con aumento posterior hasta la captura.
NOTA: La amplitud más baja a la que se obtiene la captura auricular consistente es la TH auricular. Debido a la preocupación por la estimulación parasimpática a altas amplitudes de estímulo, que se refleja por el bloqueo AV excesivo durante la estimulación con inducción de FA artifical9, la TH máxima aceptable es de 0,75 mA. Si es necesario, reposicione el catéter para lograr un TH ≤0.75 mA. - Ajuste la amplitud del estímulo al doble de TH.
5. Determinación de las propiedades electrofisiológicas
- Medir los parámetros electrofisiológicos, incluyendo el tiempo de recuperación del nódulo sinusal (SNRT), la duración del ciclo de Wenckebach (WCL) y el período refractario efectivo auriculoventricular (AVERP) antes de la estimulación auricular rápida para la inducción de FA15.
6. Susceptibilidad a la arritmia auricular
- Realizar la estimulación a dos veces TH con un ancho de pulso de 2 ms utilizando la estimulación de ráfaga a diferentes CL o la estimulación decremental según lo determinado a partir de los estudios iniciales (pasos 1.1.-1.4.).
- Para la velocidad de ráfaga, ritmo a un CL inicial de 50 ms durante 15 s con trenes posteriores que ocurren a CL de 40 ms, 30 ms, 25 ms, 20 ms y 15 ms 8,10. Pause el ritmo durante 30 s después de cada tren de ritmo para permitir la recuperación antes de continuar. Si la FA se produce después de un tren de paseo, espere 30 s después de la terminación antes de continuar con la estimulación posterior.
- Para la estimulación decremental, acelerar a un CL de 40 ms y disminuir el CL en 2 ms cada 2 s hasta la terminación a 20 ms7. Realice trenes de ritmo por triplicado16 o quintuplicado17, con una pausa de 30 s para la recuperación después de cada tren. Como se mencionó anteriormente, si se desarrolla AF, espere 30 s después de la terminación antes de continuar.
NOTA: Al optimizar los parámetros del protocolo durante los experimentos preliminares (es decir, los pasos 1.1.-1.5.), realice una estimulación decremental con cinco trenes. Realice un análisis post hoc para determinar si tres o cinco trenes proporcionan la mayor sensibilidad. - Termine el procedimiento a 30 s de ritmo sinusal después del último tren de estimulación o después de un episodio de 10 minutos de FA, lo que ocurra primero.
7. Post-procedimiento
- Detenga la adquisición de datos.
- Retire suavemente el catéter y los electrodos de ECG.
- Detener la anestesia.
- Coloque el ratón anestesiado en una jaula y observe durante 10 minutos para asegurar la recuperación.
- Guarde el archivo de datos. En el caso de las pruebas en serie, espere un mínimo de 24 horas antes de repetir el procedimiento de estimulación.
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Representative Results
Los estudios de estimulación auricular transesofágica evalúan las propiedades electrofisiológicas de los nódulos SA y AV mediante la determinación de la SNRT y AVERP, así como la susceptibilidad a la FA6 (Figura 1). El registro de ECG permite medir la duración de la onda P, el intervalo PR, la duración del QRS y los intervalos QT/QTc. El registro continuo del ECG durante la estimulación auricular rápida puede proporcionar las siguientes medidas de la vulnerabilidad de la FA: el número de episodios inducidos durante el estudio, la duración acumulada y media de los episodios, y el número de episodios de FA sostenida. Los episodios de bloqueo AV excesivo durante la estimulación pueden demostrar períodos de estimulación parasimpática inducida por la estimulación (Figura 3), lo que significa que la FA asociada es un artefacto de este fenómeno en lugar de la fisiopatología del modelo en sí9.
Figura 1: Resultados representativos de la estimulación auricular. Registros de ECG de superficie que representan (A) ritmo sinusal y (B) fibrilación auricular después de una estimulación auricular rápida. La velocidad de estimulación excede el CL de Wenckebach, lo que resulta en la pérdida de la conducción nodal AV 1:1 durante la estimulación. El artefacto de referencia está relacionado con la respiración del ratón. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Representación visual del catéter transesofágico y su proximidad al plexo ganglionar . (A) Una fotografía que representa el catéter octapolar 2-F. (B) Representación de la proximidad del catéter al plexo ganglionar auricular izquierdo posterior. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Resultados representativos del bloqueo AV excesivo durante la estimulación auricular rápida. Registros de ECG de superficie que demuestran el ritmo de estimulación auricular con (A) y sin (B) bloqueo AV excesivo que puede ocurrir durante la estimulación auricular, especialmente durante la estimulación con mayor intensidad de estímulo y en CL cortos. Las flechas rojas denotan complejos QRS. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
La estimulación auricular transesofágica no solo permite estudios seriados en el mismo animal, sino que su duración suele ser más corta que los estudios intracardíacos (~20 min), minimizando así el uso de anestésicos y sus efectos sobre los parámetros electrofisiológicos.
Es fundamental optimizar los métodos inicialmente para cada modelo de ratón individual. El envejecimiento aumenta la inducibilidad de FA en ratones normales18,19, y los modelos genéticos individuales pueden demostrar inducibilidad de FA durante un período de tiempo limitado. La realización de estudios piloto cada dos semanas puede determinar una ventana de edad durante la cual el ratón fenotipo AF es inducible pero los ratones de control no lo son. El sexo puede ser un factor determinante, ya que uno o ambos sexos pueden mostrar FA 9 inducible. Además, ratones específicos pueden mostrar susceptibilidad a la FA en respuesta a un solo tipo de modo de estimulación, mientras que otros demuestran susceptibilidad a la FA a un modo diferente o a múltiples modos9.
Durante la estimulación auricular rápida, los ratones pueden experimentar un bloqueo AV excesivo que a menudo coincide con la inducción de FA. Este fenómeno es causado por la estimulación inadvertida de los plexos ganglionares localizados en la aurícula posterior izquierda, resultando en activación parasimpática9. El bloqueo AV significativo se define como bradicardia ventricular que dura ≥10% de un solo tren de estimulación y se encuentra con mayor frecuencia cuando se estimula con altas intensidades de estímulo y con LC de estimulación corta. Este tipo de inducción de arritmias aumenta la incidencia de FA en ratones control y provoca una mayor variabilidad de arritmias dentro de un grupo experimental. Dadas estas características contaminantes, los animales que experimentan FA en estas condiciones deben ser excluidos del análisis.
Si se produce un bloqueo AV profundo durante la estimulación a pesar de TH ≤0.75 mA, es razonable reducir la amplitud de estimulación a 1.5x TH7. Además, si no se observa un fenotipo de FA durante los experimentos preliminares, es concebible volver a intentarlo utilizando 10 ms como el ritmo más bajo CL16. Si no se observa un fenotipo de FA a las 12 semanas de edad para un modelo adquirido, considere estudios preliminares quincenales para explorar los efectos del aumento de la madurez del fenotipo20.
Una limitación de este enfoque es el uso de anestesia con isoflurano. Se sabe que el isoflurano suprime la función autonómica21, y este efecto no puede descartarse a pesar de una exposición relativamente corta. Este protocolo representa el primer informe detallado de una estrategia optimizada para desarrollar métodos transesofágicos de PSA en ratones. Si bien este estudio se centra en la susceptibilidad a la FA, las aplicaciones futuras de este protocolo podrían usarse para evaluar las arritmias ventriculares22,23.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
La figura 2 se creó con BioRender.com. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre de los Institutos Nacionales de Salud (HL096844 y HL133127); la American Heart Association (2160035, 18SFRN34230125 y 903918 [MBM]); y el Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Traslacionales del Instituto Nacional de Salud (UL1 TR000445).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 27 G ECG electrodes | ADInstruments | MLA1204 | |
| 2-F octapolar electrode catheter | NuMED | CIBercath | |
| Activated carbon canister | VetEquip | 931401 | |
| Analysis software | ADInstruments | LabChart v8.1.13 | |
| Biological amplifier | ADInstruments | FE231 | |
| Data acquisition hardware | ADInstruments | PowerLab 26T | |
| Eye ointment | MWI Veterinary | NC1886507 | |
| Heating pad | Braintree Scientific | DPIP | |
| Isoflurane | Piramal | 66794-017-25 | |
| Stimulator | Bloom Associates | DTU-210 | |
| Stimulus Isolator | World Precision Instruments | Model A365 |
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