Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.

Artículo de método

Ediciones precisas mediadas por CRISPR-Cas9 en corazones de pez cebra

3.7K visualizaciones

⸱

DOI:

10.3791/64209

⸱

13 de septiembre de 2022

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biomedical Physiology and Kinesiology, Simon Fraser University

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe un enfoque para facilitar ediciones precisas en embriones de pez cebra utilizando la tecnología CRISPR-Cas9. Se presenta una tubería de fenotipado para demostrar la aplicabilidad de estas técnicas para modelar una variante genética asociada al síndrome de QT largo.

Resumen

Las repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR) en modelos animales permiten una manipulación genética precisa para el estudio de fenómenos fisiológicos. El pez cebra se ha utilizado como un modelo genético eficaz para estudiar numerosas cuestiones relacionadas con la enfermedad hereditaria, el desarrollo y la toxicología a nivel de todo el órgano y el organismo. Debido al genoma del pez cebra bien anotado y mapeado, se han desarrollado numerosas herramientas para la edición de genes. Sin embargo, la eficacia de generar y la facilidad de detectar ediciones precisas utilizando CRISPR es un factor limitante. Aquí se describe un enfoque knock-in basado en CRISPR-Cas9 con la detección simple de ediciones precisas en un gen responsable de la repolarización cardíaca y asociado con el trastorno eléctrico, el síndrome de QT largo (LQTS). Este enfoque de ARN de dos guías únicas (sgRNA) elimina y reemplaza la secuencia objetivo y vincula un gen informador codificado genéticamente. La utilidad de este enfoque se demuestra mediante la descripción de mediciones fenotípicas no invasivas de la función eléctrica cardíaca en larvas de pez cebra de tipo salvaje y editadas genéticamente. Este enfoque permite el estudio eficiente de las variantes asociadas a la enfermedad en un organismo completo. Además, esta estrategia ofrece posibilidades para la inserción de secuencias exógenas de elección, como genes reporteros, ortólogos o editores de genes.

Introducción

Las estrategias de edición de genes basadas en CRISPR en modelos animales permiten el estudio de enfermedades genéticamente hereditarias, el desarrollo y la toxicología a nivel de todo el organismo 1,2,3. El pez cebra proporciona un modelo poderoso que está más cerca en numerosos aspectos fisiológicos de los humanos que los modelos celulares murinos o derivados de humanos4. Se ha utilizado una amplia gama de herramientas y estrategias genéticas en el pez cebra tanto para el cribado genético hacia adelante5 como para el inverso6. El mapeo genético integral y la anotación en el pez cebra han facilitado los enfoques de edición de genes como una técnica primaria para diseñar knockouts de genes dirigidos (KO) y knock-ins precisos (KI)7.

A pesar de esto, la generación de ediciones precisas de KI en el pez cebra está limitada por las bajas eficiencias y la dificultad de una detección precisa. Aunque las nucleasas efectoras similares a factores de transcripción (TALEN) se han utilizado y optimizado con éxito para KI8, CRISPR proporciona una estrategia mejorada de edición de genes con una orientación más simple de sgRNA. Numerosos estudios han utilizado CRISPR para generar KI precisos en peces cebra 9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19,20, aunque estas ediciones generadas a través de la reparación dirigida por homología mediada por CRISPR (HDR) tienden a ser ineficientes con bajo éxito intrínseco tasas que requieren genotipado como cribado primario 9,10,14,21. Esto demuestra la necesidad de un sistema KI CRISPR eficiente en el pez cebra, así como un sistema confiable de alto rendimiento para detectar ediciones precisas.

El objetivo de este estudio fue describir una plataforma para generar un gen cardíaco preciso KI en corazones de pez cebra con detección simple y de alto rendimiento de ediciones exitosas. Se describe un enfoque de reemplazo de exón de dos sgRNA basado en CRISPR-Cas9, que se basa en un enfoque TALEN8. Este enfoque implica la escisión de la secuencia diana utilizando guías de dos sgRNA y el reemplazo con una secuencia plantilla exógena que contiene el KI de interés, así como un gen informador intrónico codificado genéticamente (Figura 1). La integración de un reportero fluorescente codificado genéticamente dentro de la secuencia intrónica del gen objetivo permite la detección eficiente de ediciones positivas. Luego se describe una plataforma de fenotipado para evaluar la función eléctrica cardíaca en larvas de pez cebra para la caracterización no invasiva de las variantes genéticas asociadas con LQTS hereditario, un trastorno eléctrico cardíaco que predispone a los individuos a la muerte súbita cardíaca.

Estos enfoques mejorarán el acceso y el uso de las ediciones del gen KI del pez cebra para modelar enfermedades hereditarias y abordar cuestiones biológicas y fisiológicas, como el mapeo de patrones de expresión génica y la regulación del desarrollo. Dado que los corazones de pez cebra son mejores características electrofisiológicas cardíacas humanas paralelas que los modelos murinos, pueden ser particularmente atractivos como un sistema genéticamente tratable para el modelado de enfermedades cardíacas 7,22,23.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Protocolo

Los estudios con pez cebra se realizaron de acuerdo con las políticas y procedimientos del Comité de Cuidado de Animales de la Universidad Simon Fraser y el Consejo Canadiense de Cuidado de Animales y se completaron bajo el protocolo # 1264K-18.

1. Diseño de componentes CRISPR para ediciones precisas

  1. Para diseñar las dos guías de ARNg que se utilizarán para extirpar la secuencia que contiene el sitio objetivo de KI, primero identifique el ortólogo del pez cebra para el gen de interés.
    NOTA: La figura 2 proporciona una descripción general resumida de los pasos para diseñar ediciones precisas utilizando el enfoque CRISPR-Cas9 de dos sgRNA.
  2. A continuación, utilice una herramienta de software de diseño, como CRISPOR24, que incluye la selección de Danio rerio como especie y de la enzima Cas que se utilizará.
    NOTA: El gen de interés para este estudio fue zkcnh6a (Ensembl Transcript ID: ENSDART00000090809.6; UniProt Protein ID: B3DJX4), y la mutación objetivo fue el aminoácido, R56Q.
    1. Para el enfoque de dos sgRNA, elija una ubicación de sgRNA que preceda al exón objetivo y una segunda sgRNA que se encuentre dentro del intrón inmediatamente posterior.
    2. Asegúrese de que los sgRNAs seleccionados tengan una alta especificidad y una baja unión prevista fuera del objetivo. Utilice las clasificaciones de CRISPOR para identificar guías con un enlace mínimo fuera del objetivo. No considere guías sin desajustes en la secuencia semilla de posibles objetivos fuera de lugar.
    3. Identifique los sitios potenciales fuera del objetivo más probables (según las puntuaciones CRISPOR, seleccione los tres sitios potenciales de exón principales fuera del objetivo) para el genotipado de secuenciación de Sanger basado en PCR en el paso 6.1.3.
    4. Una vez seleccionados los dos sgRNAs, obtener el complemento inverso para cada uno, de modo que haya cuatro oligonucleótidos a utilizar: dos oligos complementarios que preceden a la mutación y dos oligos complementarios que están aguas abajo.
    5. En cada uno de los cuatro oligos, agregue sitios de restricción compatibles para su incorporación en un plásmido guía de elección; para la integración en el plásmido DR274, utilice un sitio de restricción BsaI de 5' para crear un voladizo. Asegúrese de que el sitio de reconocimiento Bsa1 esté diseñado en el extremo 5' de la guía seleccionada de CRISPOR y que el sitio de reconocimiento Bsa1 esté diseñado en el extremo 5' de las hebras complementarias para garantizar la orientación correcta de las guías en el plásmido DR274 (consulte la figura 3).
  3. Para diseñar la plantilla exógena utilizada para HDR en pez cebra (Figura 1), elija dos fragmentos de secuencia que flanquearán el gen reportero YFP mVenus alojado en el plásmido pKHR5.
    NOTA: La modificación/edición prevista se puede incluir en el fragmento ascendente o descendente.
    1. Usando Ensembl, localice el sitio objetivo dentro de la secuencia de genes de interés, incluyendo aproximadamente la secuencia flanqueante de 2 kb (brazo de homología), que se utilizará para hacer la plantilla.
      NOTA: Los brazos de homología pueden ser simétricos o asimétricos25,26 y aproximadamente 1 kb cada uno, aguas arriba y aguas abajo del sitio objetivo.
    2. Divida la plantilla en dos segmentos que se insertarán a cada lado del gen reportero mVenus YFP (véase la figura 4). Asegúrese de que el sitio dividido está en un intrón para que la secuencia de codificación no se interrumpa.
      NOTA: Si el gen está bien caracterizado, verifique las funciones funcionales en el intrón, como los sitios de empalme o las regiones reguladoras. Las regiones cercanas a los extremos 5' o 3' están más a menudo involucradas en el empalme de ARNm.
    3. Incorporar modificaciones en la secuencia de plantillas que incluyan i) mutaciones silenciosas en el motivo adyacente del protoespaciador guía (PAM) o la secuencia de semillas (tenga en cuenta los sitios PAM alternativos a los que la enzima Cas podría apuntar) para evitar el recorte de la enzima Cas; ii) la modificación de intereses; iii) la creación de sitios de restricción endonucleasa para facilitar la clonación en el plásmido pKHR5, que contiene el gen informador YFP mVenus (ver Figura 3).
      NOTA: En este estudio, el primer segmento de plantilla contenía XhoI aguas arriba del sitio de mutación R56Q y SalI aguas abajo, mientras que el segundo segmento de plantilla tenía EcoRI aguas arriba de la secuencia objetivo guía y BamHI aguas abajo. Si alguno de los sitios de restricción seleccionados está presente dentro de la secuencia de plantilla, se requerirán mutaciones para silenciarlos, o se pueden usar enfoques alternativos como Gibson Assembly.

2. Preparación de componentes CRISPR para microinyección de embriones

  1. Prepare el Cas9 para microinyección 1 semana antes de las microinyecciones. Utilice la proteína Cas9 o prepare el ARNm de Cas9 mediante transcripción in vitro .
    NOTA: En este estudio, se utilizó ARNm Cas9, ya que las eficiencias tendían a ser mayores.
    1. Amplificar los cultivos bacterianos de la puñalada de agar bacteriano XL1 Blue disponible comercialmente (que contiene plásmido Cas9) utilizando un antibiótico apropiado como la ampicilina. Utilice 675 μL de cultivo líquido (con 325 μL de glicerol) para crear un stock de glicerol de respaldo para el almacenamiento a largo plazo a -80 °C.
    2. Utilice el resto del cultivo líquido para una purificación de miniprep, de acuerdo con el protocolo provisto con el kit de miniprep. Resuspender el ADN purificado final en 50 μL del tampón de elución proporcionado. Cuantifique el producto a través de un espectrofotómetro para examinar el rendimiento y la pureza.
    3. Linealizar 2 μg del ADN purificado mediante digestión de restricción utilizando una enzima de restricción apropiada y utilizando el tampón y el tiempo de incubación apropiados indicados para la enzima de interés.
    4. Purificar el plásmido linealizado utilizando un kit de purificación por PCR, resuspendiéndolo en 30 μL del tampón de elución proporcionado.
    5. Después de cuantificar el producto, utilícelo como plantilla para la transcripción in vitro utilizando el kit de transcripción apropiado para el promotor de interés. Siga el protocolo proporcionado y purifique a través de la precipitación de cloruro de litio27. Resuspender el ARN purificado en 10 μL deH2Olibre de nucleasa y cuantificarlo antes de almacenarlo a -20 °C para su uso en la mezcla de microinyección.
  2. Prepare las dos guías de sgRNA.
    1. Prepare el plásmido sgRNA con un andamio amplificando cultivos bacterianos de la puñalada de agar bacteriano XL1 Blue disponible comercialmente (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles) de la misma manera que MLM3613 anterior (paso 2.1.1), excepto que use kanamicina en lugar de ampicilina.
    2. Analice los dos pares de oligonucleótidos monocatenarios complementarios (ssODN) para las guías de sgRNA diseñadas anteriormente resuspendiendo primero las ssODN en 1x tampón de recocido a una concentración de 100 μM.
    3. En reacciones separadas para cada uno de los dos sgRNAs, analice el par de ssODNs complementarios usando un termociclador. Mezclar 2 μg de cada par de ssODN complementario con 50 μL de tampón de recocido e incubar a 95 °C durante 2 min, luego enfriar a 25 °C durante 45 min.
    4. Digiera un plásmido disponible comercialmente que contiene un andamio de ARNg. Digerir 2 μg del plásmido DR274 utilizando 1 μL de BsaI, 2 μL de tampón apropiado y ddH2O a 20 μL a 37 °C durante 1 h. Confirme la linealización (opcional: purificar con un kit de purificación de PCR) mediante electroforesis en gel28.
    5. En dos reacciones de ligadura separadas (una para cada sgRNA), ligar los ssODN recocidos con el plásmido DR274 linealizado. Utilice una relación inserto:vector molar de 3:1, calculando la masa apropiada a través de una calculadora de ligadura en línea. Mezclar la masa requerida del inserto y el vector con 1 μL de ADN ligasa T4, 2 μL de tampón de ligadura y ddH2O a 12 μL e incubar a temperatura ambiente durante 12 h.
    6. Transforme 2 μL del producto ligado en células competentes apropiadas (como células 10β) utilizando enfoques estándar, y luego amplíe y purifique el producto utilizando un kit Miniprep disponible comercialmente. Opcional: crear un stock de glicerol de este producto.
    7. Transcribir los dos sgRNAs linealizando 2 μg de cada guía utilizando un sitio de restricción aguas abajo de 3' que esté lo más cerca posible del final de la secuencia espacial. Para el plásmido DR274, linealizar con HindIII y luego purificar la plantilla de ARN utilizando un kit de purificación de PCR, resuspendiendo en 30 μL del tampón de elución.
    8. Transcribir las dos guías utilizando un kit de transcripción de ARN. Siga el protocolo del fabricante y purifique a través de la precipitación de cloruro de litio27. Resuspender las dos guías de sgRNA purificadas en 10 μL deH2Olibre de nucleasa, cuantificar y almacenar a -20 °C para su uso en la mezcla de microinyección.
      NOTA: El kit de transcripción de ARN no puede incorporar una tapa de 5' o una cola poli-A.
  3. Prepare la plantilla de reportero HDR exógena y de doble cadena.
    NOTA: La plantilla se sintetiza en dos partes, una aguas arriba y otra aguas abajo del gen reportero mVenus YFP. Estos dos segmentos son construcciones sintéticas ordenadas a través de un proveedor comercial y luego ligadas en el plásmido pKHR5 (que contiene mVenus YFP) secuencialmente.
    1. Prepare el plásmido pKHR5 amplificando cultivos bacterianos de la cepa bacteriana DH5α disponible comercialmente (consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles) de la misma manera que MLM3613 anterior (paso 2.1.1).
      NOTA: El plásmido pKHR5 contiene la secuencia del gen reportero mVenus YFP.
    2. Resuspenda los dos segmentos de plantilla diseñados anteriormente a 100 μM en tampón TE y luego transfórmelos en celdas 10β.
    3. Digerir el primer segmento plantilla (el que está aguas arriba del gen reportero YFP de mVenus) y el plásmido pKHR5 utilizando las enzimas de restricción seleccionadas en el paso 1.3.3.
      NOTA: El resumen secuencial de pKHR5 es necesario debido a la proximidad de los sitios de restricción seleccionados en el MCS.
    4. Para preparar el plásmido pKHR5 para el segmento de plantilla aguas arriba, digiera 4 μg de pKHR5 (según el paso 2.2.4) con SalI y luego purifique usando un kit de purificación por PCR. Resuspender en 30 μL deddH2Oy utilizarlo como plantilla para la segunda reacción de digestión con XhoI. Purificar el producto utilizando el kit de purificación por PCR.
    5. Preparar el primer segmento de plantilla digiriendo 2 μg del segmento de plantilla (paso 2.3.2), 1 μL de XhoI, 1 μL de SalI, 2 μL de tampón apropiado y ddH2O a 20 μL durante 1 h a 37 °C y purificar el producto en gel.
    6. Ligue el segmento de plantilla aguas arriba del paso 2.3.5 en el pKHR5 preparado utilizando las condiciones de reacción descritas en el paso 2.2.5. Transforme el producto ligado en células 10β competentes, amplifique y purifique usando un miniprep (opcional: cree un stock de glicerol de este producto).
    7. Utilice el producto ligado del paso 2.3.6 (que contiene el primer segmento de plantilla ligado en el plásmido pKHR5 aguas arriba del gen reportero YFP de mVenus) y digiera para prepararse para el segundo segmento de plantilla (aguas abajo del reportero mVenus). Digerir 4 μg del producto ligado (del paso 2.3.6, como en el paso 2.2.4) con BamHI, y luego purificar utilizando un kit de purificación por PCR. Resuspender en 30 μL deddH2Oy utilizarlo como plantilla para la segunda reacción de digestión con EcoRI. Purificar el producto utilizando el kit de purificación por PCR.
    8. Preparar el segundo segmento de plantilla digiriendo 2 μg del segmento de plantilla (paso 2.3.2), 1 μL de BamHI, 1 μL de EcoRI, 2 μL de tampón apropiado y ddH2O a 20 μL durante 1 h a 37 °C y purificar el producto en gel.
    9. Ligue el segmento de la plantilla aguas abajo en el pKHR5 preparado (a partir del paso 2.3.7) utilizando las condiciones de reacción descritas en el paso 2.2.5. Transforme el producto ligado en células competentes, amplifique y purifique usando un kit de miniprep. Crear un stock de glicerol de este producto final, que contiene ambos segmentos plantilla ligados a ambos lados del gen reportero mVenus YFP dentro de pKHR5.
  4. Prepare la mezcla de microinyección utilizando el ARNm Cas9, dos sgRNAs y la plantilla de reportero HDR exógeno.
    1. Mezcle 200 ng/μL de ARNm Cas9, 100 ng/μL de cada sgRNA y 200 ng/μL de plantilla de reportero HDR exógeno en 1x tampón de inyección hasta un volumen final de 20 μL.
    2. Conservar la mezcla de microinyección a -20 °C y desechar la mezcla no utilizada después de tres ciclos de congelación-descongelación.
      NOTA: Utilice 4 nL de esta mezcla de microinyección para microinyección en el saco vitelino de cada embrión.

3. Cría de pez cebra y microinyección de embriones

NOTA: Los protocolos para la cría del pez cebra y la microinyección de embriones unicelulares se han descrito previamente 29,30,31.

  1. Para la cría, use pez cebra de la cepa AB y que tenga entre 6 y 12 meses de edad. Inyecte los embriones en la etapa de una célula aproximadamente 40 minutos después de la fertilización (ver Figura 5).
    NOTA: Se desconocía el sexo biológico de los embriones inyectados; El dimorfismo sexual no es evidente hasta aproximadamente los 3 meses de edad32.

4. Cribado genético reportero de larvas de pez cebra editadas por CRISPR-Cas9

  1. Visualice la integración de YFP en larvas de pez cebra después de la microinyección de componentes CRISPR-Cas9 para detectar ediciones HDR exitosas.
    1. En una placa de Petri de 25 mm, anestesiar 24 larvas de pez cebra a los 3 días después de la fertilización (dpf) en sulfonato de metano tricaína al 0,3% (MS-222, tamponado a pH 7.0-7.4 con HEPES e hidróxido de sodio) hasta que pierdan su reflejo de autoenderezamiento (típicamente 1-2 min). Una vez anestesiada, transfiera cada larva a un pocillo individual de una placa de 24 pocillos.
    2. Usando un microscopio capaz de detectar GFP / YFP, detectar la fluorescencia del gen reportero en los ojos de cada larva individual.
    3. Capture imágenes de cada larva y documente la presencia o ausencia de expresión génica reportera.

5. Fenotipado de larvas de pez cebra editadas con CRISPR-Cas9

  1. Después de la detección de genes reporteros, realice fenotipado cardíaco (frecuencia cardíaca, dimensiones pericárdicas, ECG) en cada larva. Fenotipo Un número igual de larvas reporteras positivas y negativas para genes.
    1. Use una cámara CCD (por ejemplo, blackfly USB3) y un software de grabación de video e imágenes (por ejemplo, Micromanager para ImageJ) para medir la frecuencia cardíaca y las dimensiones pericárdicas mientras las larvas están anestesiadas.
    2. Para medir la frecuencia cardíaca, utilizando Micromanager, cree una región de interés (ROI) para capturar el corazón y excluir otras estructuras.
      1. Importe el vídeo a ImageJ como una secuencia de imágenes y asegúrese de que se introduce el número correcto de fotogramas en Número de imágenes.
      2. Una vez abierto el archivo, utilice la herramienta de selección de rectángulos para dibujar un ROI dentro del corazón pero excluyendo otros elementos móviles, y guarde el ROI en el administrador de ROI (analice | herramientas | Gestor de ROI).
      3. Haga clic en plugins | instalar, y seleccione el algoritmo de frecuencia cardíaca para instalar el código en la carpeta predeterminada, luego seleccione el plugin en la parte inferior de la pestaña de plugins . Graba las pulsaciones por minuto (bpm) desde la ventana emergente.
        NOTA: Los algoritmos de detección de imágenes se escribieron a medida para detectar la frecuencia cardíaca midiendo los cambios individuales en la densidad de píxeles asociados con la contracción sistólica ventricular. El código se puede encontrar en https://github.com/dpoburko/zFish_HR.
    3. Mida las dimensiones pericárdicas utilizando una herramienta gratuita como ImageJ para dibujar libremente ROI alrededor del saco pericárdico y uno de los ojos. Abra la imagen en ImageJ y utilice la herramienta de selección de polígonos para dibujar un ROI primero alrededor del saco pericárdico, guardándolo en el gestor de ROI como en el paso 5.1.2, y repita para el ojo. Seleccione estos dos ROI en la gestión de ROIr y, a continuación, haga clic en medir. Registre el área para cada uno para luego calcular el área del saco pericárdico normalizada al área de los ojos en cada larva.
    4. Después de las mediciones de frecuencia cardíaca y pericárdicas, registre el ECG de larvas individuales.
      NOTA: Los protocolos para registrar el ECG del pez cebra se han descrito previamente33,34,35,36.

6. Genotipado de larvas de pez cebra editadas con CRISPR-Cas9

  1. Después de los análisis fenotípicos, realice genotipado dentro y fuera del objetivo para confirmar la edición precisa y precisa del gen HDR.
    1. Anestesiar cada larva de 3 dpf en MS-222 al 0,3% y clip de cola para aislar el ADNg utilizando el método HOTShot37. Incubar cada pinza caudal extirpada en 15 μL de NaOH a 25 mM a 95 °C durante 20 min. Luego, neutralizar con 1,5 μL de Tris-HCl y centrifugar a 13.800 x g durante 30 s. Retenga el sobrenadante, que contiene ADNg extraído.
    2. Recuperar las larvas en medios E3 y devolverlas al sistema de alojamiento si se pretende un mayor desarrollo o estudio.
    3. Usando el ADNg extraído como plantilla, realice la secuenciación de Sanger basada en PCR de sitios en el objetivo y potencialmente fuera del objetivo.
      NOTA: Opcional: un enfoque de PCR anidado puede ser beneficioso para algunas regiones genéticas.
    4. Asegúrese de que el diseño del cebador en el objetivo capture el sitio de mutación y el sitio de unión de sgRNA más cercano. Diseñar un cebador de secuenciación separado para detectar la transición del brazo de homología insertado y el gen objetivo para confirmar la integración en el gen de interés. Diseñar cebadores para secuenciar los tres principales sitios potenciales fuera del objetivo identificados en el paso 1.2.3.
      NOTA: Los programas de software de diseño de guías a menudo sugieren cartillas para usar, pero la personalización puede ser necesaria para lograr resultados óptimos.
    5. Compile genotipado dentro y fuera del objetivo, frecuencia cardíaca, dimensiones pericárdicas, fenotipado de ECG y datos de genes reporteros identificables para cada pez cebra.

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Resultados

El uso exitoso de este enfoque CRISPR de reemplazo de exón de dos sgRNA se destaca por la introducción y detección simple de una edición precisa para diseñar la variante asociada a LQTS, R56Q, en el gen zkcnh6a en pez cebra. La Figura 6 muestra una larva representativa de 3 dpf inyectadas en la etapa embrionaria de una célula con componentes CRISPR como se describió anteriormente. La Figura 6A muestra la presencia de la expresión génica reportera YFP mV...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Discusión

La ingeniería de ediciones genéticas precisas utilizando CRISPR-Cas9 se ve desafiada por la baja eficiencia de los mecanismos HDR y su detección eficiente. Aquí, se describe un enfoque de reemplazo de exones de dos sgRNA basado en CRISPR-Cas9 que produce ediciones precisas en peces cebra con detección visual directa de ediciones positivas. La eficacia de este enfoque se demuestra mediante la generación de ediciones precisas en el gen zkcnh6a . Este documento muestra cómo la función cardíaca en larvas de pez cebr...

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Esta investigación fue apoyada por una subvención del Proyecto de Investigación de los Institutos Canadienses de Salud (T.W.C.) y las subvenciones de Descubrimiento del Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá (T.W.C.).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
fuerte
CRISPORTEFOR Infraestructura
ENSEMBLInstituto
Bioinformática ImageJInstitutos Nacionales de Salud (NIH)
Micro-ManagerCódigo Abierto (Github)
NEBiocalculatorNueva Inglaterra Biolabs (NEB)
EQUIPO
Placa de 24 pocillosVWR
25 mm Placa de PetriVWR
Blackfly Cámara USB3Teledyne FLIR
C1000 TermocicladorBio-Rad
5415CEppendorf
Kit de extracción de gel EZNAKit de transcripción Omega Biotek
MAXIscript T7 IncubadoraInvitrogen
MaxQ 5000Barnstead Lab Line
Miniprep KitQiagen
mMessage mMachine T7 Ultra Kit de transcripciónInvitrogen
ND1000Kit
Qiagen
PLI 100A PicoinyectorAparato
Harvard PowerPac Fuente de alimentación básicaBio-Rad
Stemi 305 EsteroscopioZeiss
Wide Mini Sub Cell GT Sistema de electroforesisBio-Rad
ZebTec Carcasa de pez cebra SistemaTecniplast
SERVICES
Gene SynthesisGenewiz
Sanger SequencingGenewiz
REAGENTS
10β Células competentesNEB
10X Tampón PCRQiagen
100 mM Mezcla de nucleótidosABM
AmpicilinaSigma
BamHI Endonucleasa con tampónNEB
BsaI Endonucleasa con tampónNEB
DR274 Plásmido (XL1 apuñalado de agar bacteriano azul)Addgene
EcoRI Endonucleasa con tampónNEB
Glicerol
HEPESSigma
HindIII Endonucleasa con tampónNEB
KanamicinaSigma
Azul de metilenoSigma
MLM3613 plásmido (XL1 Azul apuñalado de agar bacteriano)Addgene
MS-222 (Tricaína)Plásmido Sigma
pKHR5 (DH5 y alfa; apuñalamiento de agar bacteriano)Addgene
PmeI Endonucleasa con tampónNEB
SalI Endonucleasa con tampónNEB
Hidróxido de sodioSigma
T4 Ligasa con tampónSigma
Taq PolimerasaQiagen
TE TampónSigma
Tris Clorhidrato Sigma
XhoI Endonucleasa con tampónNEB
RECIPES
SolutionComponent Supplier
Tampón de recocido (pH 7,5-8,0)10 mM TrisSigma
50 mM NaClSigma
1 mM EDTASigma
E3 Media (pH 7,2)5 mM NaClSigma
0,17 mM KClSigma
0,33 mM CaCl2Sigma
0,33 mM Tampón de inyección MgSO4Sigma
(pH 7,5)20 mM HEPESSigma
150 mM KClSigma
Europeode Centrífuga de purificación de PCR Nanodrop

Referencias

  1. Zarei, A., Razban, V., Hosseini, S. E., Tabei, S. M. B. Creating cell and animal models of human disease by genome editing using CRISPR/Cas9. The Journal of Gene Medicine. 21 (4), 3082(2019).
  2. Lee, H., Yoon, D. E., Kim, K. Genome editing methods in animal models. Animal Cells and Systems. 24 (1), 8-16 (2020).
  3. Li, Q., et al. Applications of genome editing technology in animal disease modeling and gene therapy. Computational and Structural Biotechnology Journal. 17, 689-698 (2019).
  4. Gut, P., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R., Arnaout, R. Little fish, big data: Zebrafish as a model for cardiovascular and metabolic disease. Physiological Reviews. 97 (3), 889-938 (2017).
  5. Kegel, L., et al. Forward genetic screen using zebrafish to identify new genes involved in myelination. Oligodendrocytes: Methods and Protocols. 1936, 185-209 (2019).
  6. Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish. Nature Methods. 12 (6), 535-540 (2015).
  7. González-Rosa, J. M. Zebrafish models of cardiac disease: From fortuitous mutants to precision medicine. Circulation Research. 130 (12), 1803-1826 (2022).
  8. Hoshijima, K., Jurynec, M. J., Grunwald, D. J. Precise editing of the Zebrafish genome made simple and efficient. Developmental Cell. 36 (6), 654-667 (2016).
  9. Albadri, S., Del Bene, F., Revenu, C. Genome editing using CRISPR/Cas9-based knock-in approaches in zebrafish. Methods. 121-122, 77-85 (2017).
  10. Armstrong, G. A. B., et al. Homology directed knockin of point mutations in the zebrafish tardbp and fus genes in ALS using the CRISPR/Cas9 system. PLoS One. 11 (3), 0150188(2016).
  11. Bai, H., et al. CRISPR/Cas9-mediated precise genome modification by a long ssDNA template in zebrafish. BMC Genomics. 21 (1), 67(2020).
  12. de Vrieze, E., et al. Efficient generation of knock-in zebrafish models for inherited disorders using CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9429(2021).
  13. Eschstruth, A., Schneider-Maunoury, S., Giudicelli, F. Creation of zebrafish knock-in reporter lines in the nefma gene by Cas9-mediated homologous recombination. Genesis. 58 (1), 23340(2020).
  14. Irion, U., Krauss, J., Nüsslein-Volhard, C. Precise and efficient genome editing in zebrafish using the CRISPR/Cas9 system. Development. 141 (24), 4827-4830 (2014).
  15. Kimura, Y., Hisano, Y., Kawahara, A., Higashijima, S. Efficient generation of knock-in transgenic zebrafish carrying reporter/driver genes by CRISPR/Cas9-mediated genome engineering. Scientific Reports. 4 (1), 6545(2014).
  16. Levic, D. S., Yamaguchi, N., Wang, S., Knaut, H., Bagnat, M. Knock-in tagging in zebrafish facilitated by insertion into non-coding regions. Development. 148 (19), (2021).
  17. Prykhozhij, S. V., et al. Optimized knock-in of point mutations in zebrafish using CRISPR/Cas9. Nucleic Acids Research. 46 (17), 102(2018).
  18. Wierson, W. A., et al. Efficient targeted integration directed by short homology in zebrafish and mammalian cells. eLife. 9, 53968(2020).
  19. Boel, A., et al. CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair by ssODNs in zebrafish induces complex mutational patterns resulting from genomic integration of repair-template fragments. Disease Models & Mechanisms. 11 (10), (2018).
  20. Tessadori, F., et al. Effective CRISPR/Cas9-based nucleotide editing in zebrafish to model human genetic cardiovascular disorders. Disease Models & Mechanisms. 11 (10), (2018).
  21. Zhang, Y., Zhang, Z., Ge, W. An efficient platform for generating somatic point mutations with germline transmission in the zebrafish by CRISPR/Cas9-mediated gene editing. The Journal of Biological Chemistry. 293 (17), 6611-6622 (2018).
  22. Vornanen, M., Hassinen, M. Zebrafish heart as a model for human cardiac electrophysiology. Channels. 10 (2), 101-110 (2016).
  23. Nemtsas, P., Wettwer, E., Christ, T., Weidinger, G., Ravens, U. Adult zebrafish heart as a model for human heart? An electrophysiological study. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 48 (1), 161-171 (2010).
  24. Haeussler, M., et al. Evaluation of off-target and on-target scoring algorithms and integration into the guide RNA selection tool CRISPOR. Genome Biology. 17 (1), 148(2016).
  25. Liang, X., Potter, J., Kumar, S., Ravinder, N., Chesnut, J. D. Enhanced CRISPR/Cas9-mediated precise genome editing by improved design and delivery of gRNA, Cas9 nuclease, and donor DNA. Journal of Biotechnology. 241, 136-146 (2017).
  26. Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology. 34 (3), 339-344 (2016).
  27. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Precipitation of Large RNAs with Lithium Chloride. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Book 3. E.15. , Cold Spring Harbor Laboratory. Long Island, NY. (1989).
  28. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Agarose Gel Electrophoresis. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Book 1. , Cold Spring Harbor Laboratory. Long Island, NY. 3-20 (1989).
  29. Sorlien, E. L., Witucki, M. A., Ogas, J. Efficient production and identification of CRISPR/Cas9-generated gene knockouts in the model system Danio rerio. Journal of Visualized Experiments. (138), e56969(2018).
  30. Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: An introduction. Journal of Visualized Experiments. (69), e4196(2012).
  31. Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. Journal of Visualized Experiments. (25), e1115(2009).
  32. Kossack, M. E., Draper, B. W. Genetic regulation of sex determination and maintenance in zebrafish (Danio rerio). Current Topics in Developmental Biology. 134, 119-149 (2019).
  33. Tanaka, Y., et al. Functional analysis of KCNH2 gene mutations of type 2 long QT syndrome in larval zebrafish using microscopy and electrocardiography. Heart and Vessels. 34 (1), 159-166 (2019).
  34. Dhillon, S. S., et al. Optimisation of embryonic and larval ECG measurement in zebrafish for quantifying the effect of QT prolonging drugs. PLoS One. 8 (4), 60552(2013).
  35. Yu, F., et al. Evolving cardiac conduction phenotypes in developing zebrafish larvae: Implications to drug sensitivity. Zebrafish. 7 (4), 325-331 (2010).
  36. Hurst, R. M. Development and optimization of tools for embryonic electrocardiograph recording for heart dysfunction in zebrafish. , University of Birmingham. PhD thesis (2018).
  37. Meeker, N. D., Hutchinson, S. A., Ho, L., Trede, N. S. Method for isolation of PCR-ready genomic DNA from zebrafish tissues. BioTechniques. 43 (5), 610-614 (2007).
  38. Arnaout, R., et al. Zebrafish model for human long QT syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (27), 11316-11321 (2007).
  39. Milan, D. J., Peterson, T. A., Ruskin, J. N., Peterson, R. T., MacRae, C. A. Drugs that induce repolarization abnormalities cause bradycardia in zebrafish. Circulation. 107 (10), 1355-1358 (2003).
  40. Langheinrich, U., Vacun, G., Wagner, T. Zebrafish embryos express an orthologue of HERG and are sensitive toward a range of QT-prolonging drugs inducing severe arrhythmia. Toxicology and Applied Pharmacology. 193 (3), 370-382 (2003).
  41. MacRae, C. A. Cardiac arrhythmia: In vivo screening in the zebrafish to overcome complexity in drug discovery. Expert Opinion on Drug Discovery. 5 (7), 619-632 (2010).

Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.

Reimpresiones y permisos

Etiquetas

Inserci n CRISPRedici n g nica precisarepolarizaci n card acas ndrome de QT largointegraci n de genes reporterossecuenciaci n Sangerdise o de plantillas HDRfenotipado por ECGmodelado de variantes patog nicas
Ediciones precisas mediadas por CRISPR-Cas9 en corazones de pez cebra
Contáctenos
Recomendar a la biblioteca

Privacidad

Términos de uso

Políticas

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Todos los derechos reservados.