Summary
면역자기 비드와 형광 활성화 세포 분류를 결합하여 말초 혈액 단핵 세포(단핵구, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, B 세포 및 자연 살해 세포)의 정의된 면역 세포 하위 집단을 분리하고 분석하는 방법을 설명합니다. 이 방법을 사용하여 자기 및 형광 표지 된 세포를 정제하고 분석 할 수 있습니다.
Abstract
전염성 단핵구증(IM)은 주로 원발성 엡스타인-바 바이러스(EBV) 감염과 관련된 급성 증후군입니다. 주요 임상 증상으로는 불규칙한 발열, 림프절 병증 및 말초 혈액의 림프구 증가가 있습니다. IM의 병원성 메커니즘은 아직 명확하지 않습니다. 효과적인 치료 방법은 없으며 주로 증상 치료법을 사용할 수 있습니다. EBV 면역생물학의 주요 질문은 왜 감염된 개인의 소수만이 심각한 임상 증상을 보이고 심지어 EBV 관련 악성 종양이 발생하는 반면, 대부분의 개인은 바이러스에 감염된 평생 동안 무증상입니다.
B 세포는 EBV 수용체가 표면에 제시되기 때문에 IM에 먼저 관여합니다. 자연 살해(NK) 세포는 EBV 감염 세포를 죽이는 데 중요한 세포독성 선천 림프구입니다. 급성 EBV 감염 동안 CD4+ T 세포의 비율은 감소하는 반면 CD8+ T 세포의 비율은 극적으로 확장되며, CD8+ T 세포의 지속성은 IM의 평생 제어에 중요합니다. 이러한 면역 세포는 IM에서 중요한 역할을 하며 그 기능은 별도로 식별해야 합니다. 이러한 목적을 위해, 단핵구는 먼저 CD14 마이크로비드, 컬럼 및 자기 분리기를 사용하여 IM 개체의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)로부터 분리된다.
나머지 PBMC는 페리디닌-클로로필 단백질 (PerCP)/시아닌 5.5 항-CD3, 알로피코시아닌 (APC)/시아닌 7 항-CD4, 피코에리트린 (PE) 항-CD8, 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC) 항-CD19, APC 항-CD56 및 APC 항-CD16 항체로 염색되어 유동 세포계를 사용하여 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, B 세포 및 NK 세포를 분류합니다. 또한, 5 개의 하위 집단의 전사체 시퀀싱을 수행하여 IM에서 기능과 병원성 메커니즘을 탐색했습니다.
Introduction
인간 헤르페스 바이러스 4형으로도 알려진 γ 헤르페스 바이러스인 엡스타인-바 바이러스(EBV)는 인간 인구에서 어디에나 있으며성인 인구의 90% 이상에서 평생 잠복 감염을 확립합니다1. 대부분의 EBV 1차 감염은 소아기 및 청소년기에 발생하며, 일부 환자는 감염성 단핵구증(IM)2을 나타내며, 혈액 내 CD8+ T 세포에 의한 면역 반응 활성화 및 구인두에서 EBV에 감염된 B 세포의 일시적인 증식을 포함한 특징적인 면역병리를보입니다3. IM의 과정은 2-6 주 동안 지속될 수 있으며 대부분의 환자는 잘 회복됩니다4. 그러나 일부 개인은 이환율과 사망률이 높은 지속적이거나 재발적인 IM 유사 증상을 나타내며, 이는 만성 활동성 EBV 감염(CAEBV)으로 분류됩니다5. 또한 EBV는 중요한 발암 바이러스로, 비인두암, 버킷 림프종, 호지킨 림프종(HL) 및 T/NK 세포 림프종6과 같은 상피 및 림프성 악성 종양을 포함한 다양한 악성 종양과 밀접한 관련이 있습니다. EBV는 50년 넘게 연구되어 왔지만 그 발병 기전과 림프구의 증식을 유도하는 메커니즘은 완전히 밝혀지지 않았습니다.
여러 연구에서 전사체 시퀀싱에 의한 EBV 감염의 면역병리학에 대한 분자 서명을 조사했습니다. Zhong 등은 IM 또는 CAEBV가 있는 중국 어린이의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 전체 전사체 프로파일링을 분석하여 CD8+ T 세포 확장이 IM 그룹7에서 주로 발견되어 CD8+ T 세포가 IM에서 중요한 역할을 할 수 있음을 시사합니다. 유사하게, 또 다른 연구에서는 EBV 재활성화 및기타 약제 모두에 의해 유발된 IM 환자보다 1차 EBV 감염으로 인한 IM 환자에서 EBV 특이적 세포독성 T 및 CD19+ B 세포의 비율이 낮고 CD8+ T 세포의 비율이 더 높다는 것을 발견했습니다8. B 세포는 EBV 수용체가 표면에 제시되기 때문에 IM에 먼저 관여합니다. Al Tabaa 등은 IM9 동안 B 세포가 다클론으로 활성화되고 분화된 원형질모세포(CD19+, CD27+ 및 CD20- 및 CD138- 세포) 및 형질 세포(CD19+, CD27+ 및 CD20- 및 CD138+)를 발견했습니다. 또한, Zhong et al. 단핵구 마커 CD14 및 CD64가 CAEBV에서 상향 조절된다는 것을 발견했으며, 이는 단핵구가 항체 의존성 세포 세포 독성 (ADCC) 및 과민성 식균 작용을 통해 CAEBV의 세포 면역 반응에 중요한 역할을 할 수 있음을 시사합니다7. ALKA 등은 IM 또는 HL 환자 4 명으로부터 분류 된 MACS CD56희미한 CD16 + NK 세포의 전사체를 특성화하고 IM 및 HL의 NK 세포가 선천성 면역 및 케모카인 신호 전달 유전자를 하향 조절하여 NK 세포의 저 반응성을 담당 할 수 있음을 발견했습니다10. 또한, 그리노 등은 IM을 가진 개인의 10개의 PBMC로부터 분류된 CD8+ T 세포의 유전자 발현을 분석하였다. 그들은 IM에서 CD8+ T 세포의 상당 부분이 바이러스 특이적이고, 활성화되고, 분열하고, 이펙터 활성을 발휘할 준비가 되어 있다고 보고했습니다11. T 세포 매개 EBV 특이적 반응과 NK 세포 매개 비특이적 반응은 모두 1차 EBV 감염 동안 필수적인 역할을 합니다. 그러나 이러한 연구는 다양한 면역 세포 혼합물 또는 림프구의 특정 하위 집단의 전사체 결과만을 조사했으며, 이는 동일한 질병 상태의 IM 소아에서 다른 면역 세포 하위 집단의 분자 특성 및 기능을 포괄적으로 비교하기에 충분하지 않습니다.
이 논문은 면역자기 비드와 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 결합하여 PBMC(단핵구, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, B 세포 및 NK 세포)의 정의된 면역 세포 하위 집단을 분리하고 분석하는 방법을 설명합니다. 이 방법을 사용하여, 자기 및 형광 표지된 세포를 자기 분리기 및 FACS를 사용하여 정제하거나 유세포분석에 의해 분석할 수 있다. RNA는 전사체 시퀀싱을 위해 정제된 세포로부터 추출될 수 있다. 이 방법은 IM 환자의 동일한 질병 상태에서 서로 다른 면역 세포의 특성화 및 유전자 발현을 가능하게 하여 EBV 감염의 면역병리학에 대한 이해를 넓힐 것입니다.
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Protocol
혈액 샘플은 IM 환자(n=3), 건강한 EBV 보균자(n=3) 및 EBV에 감염되지 않은 어린이(n=3)로부터 얻었다. 베이징 어린이 병원, 수도 의과 대학에서 자원 봉사자를 모집했으며 모든 연구는 윤리적으로 승인되었습니다. 수도의과대학 베이징 아동병원 윤리위원회에서 윤리적 승인을 받았습니다(승인 번호: [2021]-E-056-Y). 이 연구는 임상 테스트를 위해 나머지 샘플 만 사용했기 때문에 환자의 정보에 입각 한 동의가 면제되었습니다. 모든 데이터는 환자의 개인 정보를 보호하기 위해 완전히 익명화되고 익명화되었습니다.
1. 말초 혈액에서 PBMC의 분리
- 표준 정맥 천자로 IM 환자의 신선한 말초 혈액 (2mL)을 K3EDTA 튜브로 수집합니다.
참고: 세포 생존력을 유지하려면 프로세스가 빨라야 합니다. - 인산염 완충 식염수(PBS)로 말초 혈액을 2배 부피로 희석하고 15mL 원심분리 튜브에서 인간 림프구 분리 배지(밀도: 1.077 ± 0.001g/mL) 위에 놓습니다.
참고: 혈액, PBS 및 분리 배지의 부피비는 1:1:1이었습니다. 혈액을 분리 매체에 천천히 추가하고 혈액이 분리 매체에 침전되지 않도록 즉시 원심 분리하십시오. - 실온에서 20 분 동안 800 ×g에서 원심 분리합니다. 중간 층(농축 PBMC)을 다른 15mL 원심분리 튜브로 옮깁니다.
참고: 원심분리 후에, 관의 바닥에 적혈구가 있고, 중간 층은 분리 매체이고, 최상층은 혈장이고, 플라스마 층과 별거 액체 층 사이에는 PBMC (림프구 및 단핵구 포함)가 있었습니다. - PBMC를 10mL의 PBS로 세척하고 실온에서 20분 동안 800× g 에서 원심분리합니다. 상청액을 조심스럽게 폐기하십시오.
- 세척 및 원심분리(단계 1.4)를 2 x 반복한다. 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 1mL의 PBS로 PBMC를 재현탁하고 트리판 블루 기반의 자동 카운터로 세포를 계수합니다.
2. CD14 마이크로비드를 사용하여 PBMC로부터 CD14+ 단핵 구의 분리
- PBS (pH 7.2) 중 0.5% 소 태아 혈청 (FBS) 및 2 mM EDTA를 함유하는 완충 용액을 준비한다. 버퍼를 차갑게 유지하십시오 (2-8 ° C).
알림: 기포가 컬럼을 막을 수 있으므로 사용하기 전에 버퍼를 탈기하십시오. 세포 표면의 항체 캡핑 및 비특이적 세포 표지를 방지하기 위해 세포를 차갑게 유지하십시오. - PBMC를 실온에서 10 분 동안 300×g으로 원심분리합니다. 상청액을 조심스럽게 폐기하십시오. 세포를 80 μL의 완충액으로 재현탁시킨다. 20μL의 CD14 마이크로비드를 세포 현탁액에 추가합니다.
참고: ≤107 PBMC가 있는 경우 위에 표시된 볼륨을 사용하십시오. >107 PBMC 가 있는 경우 모든 시약 부피와 총 부피를 비례적으로 늘립니다. - CD14 마이크로비드와 세포를 1.5mL 마이크로원심분리 튜브에서 웰 혼합하고 4°C 냉장고에서 15분 동안 배양합니다. PBMC를 1mL의 완충액으로 세척하고 실온에서 10분 동안 300× g 에서 원심분리합니다. 상청액을 완전히 폐기하십시오. 500 μL의 완충액으로 세포를 재현탁시킨다.
참고: ≤108 PBMC가 있는 경우 위에 표시된 볼륨을 사용하십시오. >108 PBMC 가 있는 경우 비례적으로 버퍼 볼륨을 늘립니다. - 기둥이있는 자기 분리 :
- 컬럼을 마그네틱 비드 분리기 위에 놓고 3mL의 완충액으로 컬럼을 세척합니다. 세포 현탁액(2.3단계에서)을 컬럼에 추가합니다.
- 컬럼을 통과하는 라벨링되지 않은 세포를 15mL 원심분리 튜브에 수집하고 3mL의 완충액으로 컬럼을 세척합니다. 3 x 3 mL의 완충액으로 컬럼을 세척합니다. 15mL 원심분리 튜브에 총 유출물을 수집합니다.
- 컬럼을 새 15mL 원심분리 튜브에 넣습니다. 컬럼에 완충액 5mL를 추가합니다. 플런저를 컬럼에 단단히 밀어 넣어 자기적으로 표지된 셀을 15mL 원심분리 튜브로 즉시 플러시합니다.
- 자기적으로 표지된 세포를 300 × g 에서 5분 동안 원심분리하고 상청액을 제거한다. 후속 전사체 시퀀싱에 사용하기 위해 1.5mL 미세 원심분리 튜브에 500μL의 PBS에 세포를 재현탁합니다.
3. 형광 표지된 항체 염색 및 FACS에 의한 PBMC로부터 림프구 집단의 분리
- 표지되지 않은 세포를 300 × g 에서 5분 동안 원심분리하고(단계 2.4.2) 상청액을 제거한다. 세포를 1.5mL 미세 원심분리 튜브에 100μL의 PBS에 재현탁시킵니다.
- 100μL의 세포 현탁액에 2μL의 각 표지된 항체(CD3, CD4, CD8, CD16, CD19, CD56)를 추가하고(항체의 부피 및 접합된 형광단 정보는 표 1에 표시됨), 30분 동안 얼음에서 배양하고 빛으로부터 보호합니다.
- PBS 1mL를 첨가하고 실온에서 5분 동안 300× g 에서 원심분리하여 세포를 2배 세척합니다. 세포를 1.5mL 마이크로원심분리 튜브에 500μL의 PBS에 재현탁시킨다. 유동 세포 분류기 세포분석기에서 데이터를 수집하기 전에 세포 현탁액을 부드럽게 소용돌이합니다.
4. 유세포 분석 파라미터 설정
- 필요에 따라 1.5mL 미세 원심분리 튜브에서 100μL의 세포 현탁액(섹션 1 참조)을 취하고 음성 대조군 샘플, CD3 단일 염색 샘플, CD4 단일 염색 샘플, CD8 단일 염색 샘플, CD19 단일 염색 샘플 및 CD56/CD16 염색 샘플을 설정합니다.
- 세포 현탁액 및 와류의 100 μL 당 상응하는 형광 표지된 항체 2 μL를 첨가한다. 어둠 속에서 30 분 동안 얼음 위에서 배양하십시오. 300 × g 에서 5분 동안 원심분리하고 상청액을 흡인한다. 500μL의 PBS와 와류로 펠릿을 재현탁합니다.
- 분류 스트림을 시운전하고 다음과 같이 형광 비드를 사용하여 액적을 지연시킵니다.
- 셀 분류 시스템을 열고 전원 켜기 프로그램을 실행하고 85μm 노즐을 설치하고 분류 스트림을 엽니다. 정렬 전압을 4,500V로 설정하고 주파수 를 47로 설정합니다.
- 주로 제조업체의 지침에 따라 주 흐름 액적 중단점과 액적 지연을 조정하여 매개변수를 조정합니다12. 브레이크 오프 창에서 첫 번째 드롭릿 중단점 위치(Drop1)를 275로 설정하고 간격을 8로 설정합니다. Sweet Spot 자동 정렬 모드를 켜서 세포분석이 자동으로 액적 진폭 값을 결정하여 스트림을 안정화할 수 있도록 합니다.
- 형광 비드를 로드하여 사이드 스트림 창에서 액적 지연을 30.31로 조정하여 비드가 초기 또는 미세 조정 모드에서 >99%의 측면 흐름 편향을 달성하도록 합니다.
- 그림 1에 표시된 게이팅 전략을 참조하여 다음과 같이 게이팅을 수행합니다.
- 전방 산란 영역(FSC-A)/측면 산란 영역(SSC-A) 점도표를 사용하여 다각형 게이트(P1) 를 그려 온전한 림프구 집단을 식별합니다.
- FSC-A/FSC-높이(FSC-H) 점도표를 사용하여 다각형 게이트(P2)를 그려 단일 셀을 식별하고 이중선을 제외합니다(그림 1A).
- CD19 FITC-A/CD3 PerCP-Cy5.5-A 점도표를 사용하여 직사각형 게이트(P3)를 그려 CD3+ T 세포와 CD19+ B 세포를 선택합니다(그림 1A,B).
- CD4 APC-Cy7-A/CD8 PE-A 점도표를 사용하여 직사각형 게이트를 그려 CD4+ T 세포와 CD8+ T 세포(각각 이러한 마커에 대해 형광이 높은 세포)를 선택합니다.
- CD56/CD16 APC-A/SSC-A 점도표를 사용하여 직사각형 게이트를 그려 CD56+/CD16+ NK 세포를 선택합니다(그림 1C).
- 음성 대조군 샘플을 사용하여 기기 파라미터를 조정합니다.
- 네거티브 컨트롤 튜브를 로딩 포트에 설치하고 획득 대시보드에서 로드(Load)를 클릭합니다. 소프트웨어에서 세포분석기 설정을 선택합니다.
- 인스펙터 창에서 매개 변수 탭을 클릭하고 FSC, SSC 및 다양한 형광 염료의 전압을 조정합니다. FSC : 231, SSC : 512, PE : 549, APC : 615, APC- 시아닌 7 : 824, FITC : 555, PerCP- 시아닌 5.5 : 663.
- 단일 염색 샘플을 사용하여 보정조정 13.
- 단일 염색 튜브를 세포분석에 순차적으로 로드하고 소프트웨어에서 세포분석기 설정을 선택합니다. 보정 탭을 클릭하여 보정을 조정합니다.
참고: 유세포분석의 보상 기준은 표 2에 나와 있습니다.
- 단일 염색 튜브를 세포분석에 순차적으로 로드하고 소프트웨어에서 세포분석기 설정을 선택합니다. 보정 탭을 클릭하여 보정을 조정합니다.
5. 유세포분석을 통한 세포 분류 및 데이터 수집
- 세포 현탁액(섹션 1-3에 따라 분리된 PBMCs)을 잠시 와동시켜 튜브를 세포분석기에 넣기 전에 세포를 재현탁합니다. 나머지 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.
- 4개의 수집 흐름 튜브에 200μL의 FBS를 추가하여 분류된 세포가 튜브 벽에 달라붙지 않도록 하고 세포분석기 수집 챔버에 넣습니다.
- 4개의 유동 튜브에서 IM 환자의 샘플과 별도로 CD3+CD4+ T 세포, CD3+CD8+ T 세포, CD3-CD19+ B 세포 및 CD3- CD56+/CD16+ NK 세포를 수집합니다(그림 2A).
- 분리된 세포를 300×g에서 5 분 동안 원 심분리하고 상층액을 제거한다. 전사체 시퀀싱을 위해 200μL의 RNA 분리 시약을 세포에 추가합니다.
- 위의 단계에 따라 건강한 EBV 보균자와 EBV에 감염되지 않은 어린이로부터 샘플의 면역 세포 하위 집단을 분리합니다(그림 2B, C).
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Representative Results
게이팅 전략의 참조
4개의 림프구 하위 집단을 분류하는 데 사용되는 게이팅 전략은 그림 1에 나와 있습니다. 간략하게, 림프구는 세분도 (SSC-A) 대 크기 (FSC-A)를 보여주는 점도표에서 선택됩니다 (P1). 그런 다음 크기(FSC-A) 대 전방 산란(FSC-H)을 보여주는 점도표에서 단일 셀(P2)을 선택하고 이중선 셀은 제외합니다. CD3+ T 세포(P3) 및 CD19+ B 세포(그림 1B)는 CD3 PerCP-Cy5.5-A 대 CD19 FITC-A를 보여주는 점도표에서 별도로 선택됩니다. CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포는 P3의 CD8 PE-A 대 CD4 APC-Cy7-A를 보여주는 점도표에서 별도로 선택됩니다. CD16+/CD56+ NK 세포는 P4의 CD56/CD16 APC-A 대 SSC-A를 보여주는 점도표에서 선택됩니다(그림 1C).
IM 환자의 샘플로부터 정렬된 4개의 세포 서브포스를 기재된 방법에 의해 분류한 대표적인 결과를 도 2A에 나타내었다. 또한 이 실험의 타당성을 확인하기 위해 건강한 EBV 보균자와 EBV에 감염되지 않은 어린이의 샘플에 대해 세포 분류를 대조군으로 수행했습니다. 건강한 EBV 보균자의 샘플에서 분리된 세포 소집단의 대표적인 결과는 그림 2B에 나와 있습니다. EBV에 감염되지 않은 어린이의 샘플로부터 분류된 세포 소집단의 대표적인 결과는 도 2C에 나타내었다. 도 2에 도시된 바와 같이, P1은 림프구를 확인하기 위해 게이팅되었고, 이중항 세포는 P2를 통해 배제되었다; P3는 CD3+ T 세포를 선택하기 위해 게이팅되었고, P5는 CD19+ B 세포를 선택하도록 게이팅되었습니다. CD3+ CD8+ T 세포 (P6) 및 CD3+ CD4+ T 세포 (P7)는 P3와 별도로 선택하였다; CD16+/CD56+ NK 세포(P8)는 P4로부터 선택되었다. 이러한 각 하위 집단은 다운스트림 실험을 위해 개별적으로 정렬하고 수집할 수 있습니다. 이 시스템은 RNA 추출 및 전사체 시퀀싱을 통해 유전자 발현을 분석하는 데 사용되었습니다.
표 3에 보고된 바와 같이, 건강한 EBV 보균자와 EBV에 감염되지 않은 소아 모두에 비해 IM 환자에서 CD3+ CD8+ T 세포의 증가가 관찰되었습니다(46.5 ± 4.0 대 27.0 ± 0.1 및 46.5 ± 4.0 대 24.7 ± 2.9, 총 림프구당 % CD3+ CD8+ T 세포). 건강한 EBV 보균자 및 EBV에 감염되지 않은 소아와 비교하여 IM 환자에서 CD3+ CD4+ T 세포 및 CD19+ B 세포의 비율이 감소했습니다(13.4 ± 1.5 대 19.3 ± 1.5 및 13.4 ± 1.5 대 23.6 ± 3.2, 총 림프구당 % CD3+ CD4+ T 세포; 1.4 ± 0.3 대 7.6 ± 0.7 및 1.4 ± 0.3 대 9.0 ±대 1.5, 총 림프구당 % CD19+ B 세포). EBV에 감염되지 않은 소아에 비해 IM 환자에서 CD16+/CD56+ NK 세포의 비율이 감소했습니다(총 림프구당 7.5± 0.5 대 10.7 ± 0.4, % CD16+/CD56+ NK 세포). 이러한 결과는 이 분류 프로토콜의 효과를 검증했으며 IM 및 EBV에 감염되지 않은 어린이 환자에서 림프구 하위 집합의 비율이 다르다는 것을 입증했습니다.
그림 1: PBMC에서 면역 세포 하위 집단을 분류하는 데 사용되는 전체 게이팅 전략. (A) PerCP-Cy5.5 필터를 사용하여 CD3+ T 세포를 분리했습니다. CD8+ T 세포 및 CD4+ T 세포를 P3의 CD8 PE-A 대 CD4 APC-Cy7-A를 보여주는 점도표에서 별도로 선택하였다. (B) FITC 필터를 사용하여 CD19+ B 세포를 식별하였다. (C) APC 필터를 사용하여 CD16+/CD56+ NK 세포를 P4로부터 분리하였다. 약어: PBMC = 말초 혈액 단핵 세포; FSC-A = 전방 산란 영역; SSC-A = 측면 산란 영역; FSC-H = 전방 산란 높이; PerCP = 페리디닌-크로로필-단백질; PE = 피코 에리트 린; APC = 알로피코시아닌; FITC = 플루오레세인 이소티오시아네이트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 설명된 방법에 의해 성공적으로 분리된 4개의 세포 서브집단의 대표 결과. (a) IM 환자의 말초 혈액 샘플로부터의 대표적인 세포 분류 수치. (b) 건강한 EBV 담체의 말초 혈액 샘플로부터의 대표적인 세포 분류 수치. (C) EBV에 감염되지 않은 어린이의 말초 혈액 샘플로부터의 대표적인 세포 분류 수치. P1, 림프구를 확인하기 위한 도트 플롯 게이트; P2, 단일 셀을 선택하는 도트 플롯 게이트; P3, CD3+ T 세포를 선택하기 위한 도트 플롯 게이트; P4, CD3-CD19-림프구를 확인하기 위한 도트 플롯게이트; P5, CD19+ B 세포를 선택하기 위한 도트 플롯 게이트; P6, P3에서 CD3+ CD8+ T 세포를 선택하기 위한 도트 플롯 게이트; P7, P3에서 CD3+ CD4+ T 세포를 선택하기 위한 도트 플롯 게이트; P8, P4에서 CD16+/CD56+ NK 세포를 선택하기 위한 도트 플롯 게이트. 약어 : EBV = 엡스타인-바 바이러스; IM = 전염성 단핵구증; FSC-A = 전방 산란 영역; SSC-A = 측면 산란 영역; FSC-H = 전방 산란 높이; PerCP = 페리디닌-크로로필-단백질; PE = 피코 에리트 린; APC = 알로피코시아닌; FITC = 플루오레세인 이소티오시아네이트. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 항체 표적 | 공액 형광단 | 복용량 | 클론 | 아이소타입 |
| CD3 | 퍼CP/시아닌5.5 | 2 μL | SK7 | 마우스 IgG1, κ |
| CD4 | APC / 시아닌7 | 2 μL | SK3 | 마우스 IgG1, κ |
| CD8 | 체육 | 2 μL | SK1 | 마우스 IgG1, κ |
| CD19 | 증권 시세 표시기 | 2 μL | HIB19 | 마우스 IgG1, κ |
| CD56 | 증권 시세 표시기 | 2 μL | 5.1시간 11분 | 마우스 IgG1, κ |
| CD16 | 증권 시세 표시기 | 2 μL | 3G8 | 마우스 IgG1, κ |
표 1: 유세포분석에 사용되는 항체. 약어 : PerCP = 페리 디닌 - 크로로 필 - 단백질; PE = 피코 에리트 린; APC = 알로피코시아닌; FITC = 플루오레세인 이소티오시아네이트.
| 유세포분석의 보상기준(%) | |||||
| 체육 | 증권 시세 표시기 | APC-Cy7 | 증권 시세 표시기 | 퍼CP-Cy5.5 | |
| 체육 | 100 | 0 | 0 | 0.8 | 4.1 |
| 증권 시세 표시기 | 0 | 100 | 30.1 | 0 | 0.9 |
| APC-Cy7 | 0 | 1.8 | 100 | 0 | 0 |
| 증권 시세 표시기 | 0 | 0 | 0 | 100 | 0 |
| 퍼CP-Cy5.5 | 0 | 1.8 | 10 | 0 | 100 |
표 2: 유세포분석의 보상 기준. 약어 : PerCP = 페리 디닌 - 크로로 필 - 단백질; PE = 피코 에리트 린; APC = 알로피코시아닌; FITC = 플루오레세인 이소티오시아네이트.
| 전체 분류된 림프구에서 상이한 아집단의 림프구의 비율(%) | |||
| 림프구 하위 집단 | 메신저 | 건강한 EBV 캐리어 | EBV에 감염되지 않은 어린이 |
| CD3+ T 세포 | 80.5 ± 1.8 | 70.2 ± 2.3 | 66.1 ± 2.1 |
| CD3+ CD8+ T 세포 | 4.0± 46.5 | 27.0 ± 0.1 | 2.9± 24.7 |
| CD3+ CD4+ T 세포 | 13.4 ± 1.5 | 19.3 ± 1.5 | 23.6 ± 3.2 |
| CD16+/CD56+ NK 세포 | 7.5 ± 0.5 | 2.2 ± 0.1 | 10.7 ± 0.4 |
| CD3- CD19+ B 세포 | 1.4 ± 0.3 | 7.6 ± 0.7 | 9.0 ± 1.5 |
표 3 : 다른 그룹의 분류 된 림프구의 비율. 약어 : EBV = 엡스타인-바 바이러스; IM = 전염성 단핵구증; NK = 자연 살해자.
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Discussion
이 프로토콜은 말초 혈액 면역 세포 하위 집단을 분류하는 효율적인 방법을 나타냅니다. 이 연구에서는 IM 환자, 건강한 EBV 보균자 및 EBV에 감염되지 않은 어린이의 정맥혈 샘플을 연구 목표로 선택했습니다. IM 환자의 말초 혈액을 사용하는이 작업은 주로 다색 유세포 분석을 통해 다양한 세포 하위 집합의 비율을 분석하고 결정하는 데 중점을 둡니다. 전사체 시퀀싱은 주로 동일한 질병 상태에서 IM을 가진 소아에서 다른 면역 세포 하위 집단의 분자 특성 및 기능의 포괄적이고 구체적인 비교에 불충분 한 림프구의 특정 하위 집단의 검출 및 분석에 사용됩니다. 따라서 말초 혈액에서 여러 유형의 세포를 분류하고 전사체 시퀀싱을 수행하여 이러한 면역 세포의 발현 유전자 및 기능의 차이를 비교하면 IM의 발병 기전 연구에 중요한 데이터를 제공 할 수 있습니다.
FACS 분류는 추가의 시험관내 또는 생체내 실험14를 위해 생, 분획된 세포를 처리할 수 있다는 추가적인 이점을 갖는다. 세포 생존력을 유지하는 것은 후속 실험에 필수적입니다. 우리는 이 프로토콜에서 세포 생존율을 향상시키기 위해 분류 단계를 최적화했으며, 실험 조작은 얼음 또는 4°C 냉장고에서 수행되었습니다. 적절한 원심분리 속도와 시간도 세포 분리에 중요합니다. 분류된 세포의 수율도 이 방법의 주요 제약 조건이며 분류 중에 FBS 코팅 튜브를 사용하면 튜브에 부착되는 세포의 손실을 크게 줄일 수 있습니다. FACS 분류기에 적절한 설정을 제공하면 수집 튜브의 세포 막힘 또는 교차 오염을 방지하여 선별의 전반적인 효율성을 향상시킬 수 있습니다. 실험 단계 및 설정의 최적화를 통해 이 프로토콜은 자기 또는 형광 라벨을 대체하여 다른 면역 세포의 분류로 외삽될 수 있습니다. 그러나 어린이 검체의 특이성(낮은 채혈량)으로 인해 유동 분류 채널의 제한으로 인해 하위 집단을 분류하지 않고 면역세포의 주요 집단(단핵구, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, B 세포 및 NK 세포)만 조사했습니다. 이 연구는 면역 적격 어린이의 말초 혈액 샘플과 IM 샘플이 이 5개 그룹의 면역 세포를 성공적으로 분류할 수 있음을 보여주었습니다. 그러나, 혈액학적 악성 종양(예를 들어, 백혈병, 림프종), 림프증식성 장애(예를 들어, 이식 후 림프증식성 장애, CAEBV) 또는 원발성 면역결핍/후천성 면역 결핍 증후군이 있는 환자의 혈액 샘플은 이 프로토콜에 따라 성공적으로 분류되지 않을 수 있다.
IM은 자가 제한적인 질병으로 간주되며, γδ T 세포, NKT 세포 및 NK 세포와 같은 면역 세포는 항바이러스 면역 반응에서 중요한 역할을 한다(15). EBV 특이적 CD8+ T 세포는 대체로 이펙터 표현형 10,16으로 분화되며, IM에서 회복기까지 후기 이펙터 기억 및 이펙터 세포가 수축합니다17. 한편, IM의 NK 세포는 세포 활성화 부족10, 활성화 수용체 신호 전달 상실 및 탈과립18을 포함하여 기능적으로 결함이 있는 것으로 보입니다. 일부 연구에 따르면 CD4+ T 세포는 CD8+ T 세포가 EBV에 감염된 B 세포를 죽이고 제거하는 데 도움이 될 뿐만 아니라 사이토카인을 분비하여 B 세포의 증식을 억제하고 EBV 감염 시 직접 사멸 역할을 할 수도 있습니다19,20. 이 연구에서 볼 수 있듯이 건강한 EBV 보균자와 EBV에 감염되지 않은 어린이 모두에 비해 IM 환자에서 CD3+ CD8+ T 세포의 비율이 증가한 것으로 관찰되었습니다. 대조적으로, EBV에 감염되지 않은 소아에 비해 IM 환자에서 CD3+ CD4+ T 세포, CD19+ B 세포 및 CD16+/CD56+ NK 세포의 비율이 감소하는 것으로 관찰되었습니다. 그러나, IM의 동일한 질병 상태에서 면역 세포의 이들 상이한 서브타입의 기능 및 유전자 발현은 불분명하다. IM에서 특정 면역 세포 서브세트의 유전자 발현 프로필을 추가로 분석하면 IM의 병원성 메커니즘에 대한 통찰력을 얻는 데 도움이 될 수 있습니다.
우리는 면역자기 비드 분류와 FACS를 결합하여 PBMC에서 정의된 면역 세포 하위 집단을 분리하고 분석하는 전략을 제공합니다. 단핵구는 먼저 CD14 마이크로비드를 사용하여 분리되고 나머지 PBMC는 상응하는 형광 표지된 항체로 염색되어 FACS를 통해 CD4+ T 세포, CD8+ T 세포, B 세포 및 NK 세포를 분류합니다. 우리는 또한 IM의 면역 병리학에서 다른 면역 세포의 기능과 유전자 발현을 특성화하기 위해 RNA 추출 및 전사체 시퀀싱에 이러한 분류된 세포를 사용했습니다. 분류된 세포의 순도 및 수율은 일반적으로 유전자 발현 연구를 수행하기에 충분하였다 (데이터는 나타내지 않음). 따라서 별도의 면역 세포 하위 집단의 분류 방법을 사용하여 CAEBV와 같은 EBV 관련 림프 증식성 장애, 이식 후 림프 증식성 장애를 추가로 탐색하여 병원성 유전자, 병원성 단백질 및 잠재적 치료 표적을 검출할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (82002130), 베이징 자연 과학 재단 (7222059) 및 의학을위한 CAMS 혁신 기금 (2019-I2M-5-026)의 지원을 받았습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| APC anti-human CD16 | Biolegend | 302012 | Fluorescent antibody |
| APC anti-human CD56 (NCAM) | Biolegend | 362504 | Fluorescent antibody |
| APC/Cyanine7 anti-human CD4 | Biolegend | 344616 | Fluorescent antibody |
| Automated cell counter | BIO RAD | TC20 | Cell count |
| BD FACSAria fluorescence-activated flow cell sorter-cytometer (BD FACSAria II) | Becton, Dickinson and Company | 644832 | Cell sort |
| CD14 MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | microbeads |
| Cell ctng slides | BIO RAD | 1450016 | Cell count |
| Centrifuge tubes | Falcon | 35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| EDTA (≥99%, BioPremium) | Beyotime | ST1303 | EDTA |
| Ethylene diamine tetra acetic acid (EDTA) anticoagulant tubes | Becton, Dickinson and Company | 367862 | EDTA anticoagulant tubes |
| FITC anti-human CD19 | Biolegend | 302206 | Fluorescent antibody |
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | Fetal Bovine Serum |
| High-speed centrifuge | Sigma | 3K15 | Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5424R | Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube |
| Human lymphocyte separation medium | Dakewe | DKW-KLSH-0100 | Ficoll-Paque |
| LS Separation columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | Separation columns |
| Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| MidiMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | Magnetic bead separator |
| PE anti-human CD8 | Biolegend | 344706 | Fluorescent antibody |
| PerCP/Cyanine5.5 anti-human CD3 | Biolegend | 344808 | Fluorescent antibody |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | BI | 02-024-1ACS | PBS |
| Polystyrene round bottom tubes | Falcon | 352235 | 5 mL tube for FACS flow cytometer |
| TRIzol reagent | Ambion | 15596024 | Lyse cells for RNA extraction |
| Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit | Beyotime | C0011 | Trypan Blue Staining |
References
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