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Artículo de método

Modelado de metástasis cerebrales mediante inyección de células cancerosas en la arteria carótida interna

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DOI:

10.3791/64216

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2 de agosto de 2022

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1UQ Centre for Clinical Research, The University of Queensland, 2Centre for Advanced Imaging, Australian Institute for Bioengineering and Nanotechnology and ARC Training Centre for Innovation in Biomedical Imaging Technology, The University of Queensland, 3School of Biomedical Sciences, The University of Queensland, 4Mater Research and Mater Research Institute, The University of Queensland, 5Pathology Queensland, Royal Brisbane Women's Hospital

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

La metástasis cerebral es una causa de morbilidad y mortalidad graves en pacientes con cáncer. La mayoría de los modelos de ratón con metástasis cerebral se complican con metástasis sistémicas que confunden el análisis de la mortalidad y los resultados de la intervención terapéutica. Aquí se presenta un protocolo para la inyección carótida interna de células cancerosas que produce tumores intracraneales consistentes con tumores sistémicos mínimos.

Resumen

La metástasis cerebral es una causa de morbilidad y mortalidad graves en pacientes con cáncer. Los aspectos críticos de las enfermedades metastásicas, como el microambiente neural complejo y la interacción de las células del estroma, no pueden replicarse completamente con ensayos in vitro ; Por lo tanto, los modelos animales son críticos para investigar y comprender los efectos de la intervención terapéutica. Sin embargo, la mayoría de los métodos de xenoinjerto de tumores cerebrales no producen metástasis cerebrales consistentes en términos del marco de tiempo y la carga tumoral. Los modelos de metástasis cerebral generados por la inyección intracardíaca de células cancerosas pueden dar lugar a una carga tumoral extracraneal no intencional y dar lugar a morbilidad y mortalidad metastásicas no cerebrales. Aunque la inyección intracraneal de células cancerosas puede limitar la formación de tumores extracraneales, tiene varias advertencias, como que las células inyectadas con frecuencia forman una masa tumoral singular en el sitio de inyección, alta afectación leptomeníngea y daño a la vasculatura cerebral durante la penetración de la aguja. Este protocolo describe un modelo de ratón de metástasis cerebral generada por inyección de arteria carótida interna. Este método produce tumores intracraneales de forma consistente sin la participación de otros órganos, lo que permite la evaluación de agentes terapéuticos para la metástasis cerebral.

Introducción

La metástasis cerebral es una neoplasia maligna prevalente asociada a un pronóstico muy precario 1,2. El estándar de atención para los pacientes con metástasis cerebral es multimodal, consistiendo en neurocirugía, radioterapia cerebral completa y/o radiocirugía estereotáctica dependiendo del estado general de salud de los pacientes, la carga de enfermedad extracraneal y el número y localización de tumores en el cerebro 3,4. Los pacientes con hasta tres lesiones intracraneales son elegibles para resección quirúrgica o radiocirugía estereotáctica, mientras que la radioterapia de todo el cerebro se recomienda para pacientes con lesiones múltiples para evitar el riesgo de infección relacionada con la cirugía y edema5. Sin embargo, la radioterapia cerebral completa puede infligir daño a las estructuras cerebrales radiosensibles, contribuyendo a una mala calidad de vida6.

La terapia sistémica es una alternativa no invasiva y un abordaje lógico para tratar a los pacientes con lesiones múltiples7. Sin embargo, es menos considerado debido a la noción de larga data de que las terapias sistémicas tienen poca eficacia, ya que la administración pasiva de fármacos citotóxicos a través del torrente sanguíneo no puede alcanzar niveles terapéuticos en el cerebro sin el riesgo de toxicidad insegura8. Este paradigma está empezando a cambiar con la terapia sistémica recientemente aprobada por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) (tucatinib con trastuzumab y capecitabina indicada para la metástasis cerebral metastásica del cáncer de mama HER2+)9,10,11,12 y la actualización en las guías de tratamiento para incluir la consideración de opciones de terapia sistémica para pacientes con metástasis cerebral13,14.

En este contexto, los desarrollos en el campo de la terapia molecular dirigida, la inmunoterapia y los sistemas alternativos de administración de fármacos, como un portador de nanofármacos dirigido, pueden superar potencialmente los desafíos del tratamiento de metástasis cerebral15,16,17,18. Además, también se están investigando enfoques químicos y mecánicos para mejorar la administración de fármacos a través de la permeabilización de la barrera cerebro-tumor19,20. Para estudiar y optimizar tales enfoques para que sean adecuados para su propósito, es crucial utilizar modelos preclínicos que no solo reflejen la compleja fisiología de la metástasis cerebral, sino que también permitan un análisis objetivo de la respuesta intracraneal al fármaco.

En términos generales, los enfoques actuales para modelar la metástasis cerebral in vivo implican la inyección intracardíaca (ventrículo izquierdo), intravenosa (generalmente vena de la cola), intracraneal o intracarotídea (arteria carótida común) de células cancerosas en ratones 21,22,23,24,25,26,27 . Además de las estrategias de injerto tumoral, los modelos de ratón genéticamente modificados donde la formación de tumores se desencadena por la eliminación de genes supresores de tumores o la activación de oncogenes son útiles para el modelado tumoral. Sin embargo, solo unos pocos modelos de ratones genéticamente modificados producen tumores secundarios y aún menos que producen metástasis cerebrales de manera confiable28,29,30.

Los métodos de injerto como la inyección intracardíaca (ventrículo izquierdo) e intravenosa (generalmente vena de la cola) imitan la diseminación sistémica del cáncer. Estos modelos típicamente producen lesiones en múltiples órganos (por ejemplo, cerebro, pulmones, hígado, riñones, bazo) dependiendo del lecho capilar que atrapa la mayoría de las células tumorales durante su "primer paso" circulatorio31. Sin embargo, las tasas inconsistentes de injerto cerebral requerirán más animales para lograr el tamaño de muestra para el poder estadístico deseado. El número de células tumorales que eventualmente se establecen en el cerebro a través de estos métodos de inyección intracardíaca e intravenosa es variable. Por lo tanto, la carga tumoral de metástasis cerebral puede variar entre animales y la diferencia en la progresión puede hacer que la estandarización de la línea de tiempo experimental y la interpretación de los resultados sea un desafío. La carga tumoral extracraneal puede conducir a una mortalidad por metástasis no cerebral, lo que hace que estos modelos no sean adecuados para evaluar la eficacia intracraneal. Las líneas celulares cerebro-trópico se han establecido utilizando procesos de selección clonal artificial para reducir el establecimiento extracraneal, pero las tasas de toma han sido inconsistentes, y el proceso de selección clonal puede reducir la heterogeneidad que normalmente se encuentra en los tumores humanos32.

Los métodos de injerto específicos del cerebro, como la inyección intracraneal e intracarotídea, permiten un modelado de metástasis cerebrales más consistente y eficiente. En el método intracraneal33, las células cancerosas se inyectan típicamente en la corteza cerebral frontal, lo que genera un crecimiento tumoral rápido y reproducible con baja afectación sistémica. Si bien el procedimiento es bien tolerado con baja mortalidad33, las advertencias son que es un enfoque relativamente crudo que introduce rápidamente un bolo (localizado) de células en el cerebro y no modela la patogénesis temprana de la metástasis cerebral. La aguja daña la vasculatura del tejido cerebral, lo que luego causa inflamación localizada 5,34. Por experiencia, hay una tendencia a que la inyección de células tumorales fluya durante la extracción de la aguja, lo que lleva a la afectación leptomeníngea. Alternativamente, el método intracarotídeo entrega células en la arteria carótida común con microvasculatura cerebral como el primer lecho capilar que se encontró, modelando la supervivencia en circulación, extravasación y colonización24. De acuerdo con otros25, nuestra experiencia con este método encontró que puede resultar en tumores faciales debido a la entrega no intencional de células cancerosas a través de la arteria carótida externa a los lechos capilares en estos tejidos (datos no publicados). Es posible prevenir los tumores faciales ligando primero la arteria carótida externa antes de la inyección de la arteria carótida común (Figura 1). En el resto del artículo, este método se conoce como la "inyección de la arteria carótida interna". Por experiencia, el método de inyección de la arteria carótida interna genera consistentemente metástasis cerebrales con muy pocos eventos sistémicos y ha tenido éxito en la generación de modelos de metástasis cerebral de diferentes cánceres primarios (por ejemplo, melanoma, cáncer de mama y de pulmón) (Figura 1). Las desventajas son que es técnicamente desafiante, requiere mucho tiempo, es invasivo y requiere una optimización cuidadosa del número de células y una línea de tiempo de monitoreo. En resumen, los métodos de inyección intracraneal y de la arteria carótida interna producen modelos de ratón adecuados para evaluar el impacto terapéutico en el beneficio de supervivencia relacionado con el tumor cerebral.

Este protocolo describe el método de inyección de la arteria carótida interna para producir un modelo de ratón de metástasis cerebral casi sin afectación sistémica y, por lo tanto, adecuado para la evaluación preclínica de la distribución del fármaco y la eficacia de la terapéutica experimental.

Diagrama del modelo de metástasis del cáncer cerebral de ratón con configuración de inyección en la arteria carótida; resultados histológicos.
Figura 1: Representación esquemática del protocolo de inyección de la arteria carótida interna para metástasis cerebral. La inyección de la arteria carótida interna con ligadura de la arteria carótida externa puede producir de manera confiable un modelo de metástasis cerebral de varios cánceres primarios. En este protocolo, se colocan tres ligaduras en la arteria carótida (anotadas como L1-L3 en la figura). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Protocolo

Todos los estudios se realizaron dentro de las directrices del Comité de Ética Animal de la Universidad de Queensland (UQCCR/186/19) y el Código Australiano para el Cuidado y Uso de Animales con Fines Científicos.

1. Preparación de células cancerosas para inyección

NOTA: En este estudio, se utilizó la línea celular de cáncer de mama humano, BT-474 (BT474). BT474 se cultivó en medio de crecimiento completo que comprende RPMI 1640 medio suplementado con 10% de suero bovino fetal y 1% de insulina. Las células se mantuvieron en una incubadora a 37 °C con 5% de dióxido de carbono en atmósfera de aire. Autenticar la línea celular mediante pruebas de repeticiones en tándem satélite35, confirmar la expresión de la proteína reportera (por ejemplo, luciferasa) si la hay, y verificar si hay infección por micoplasma.

  1. Sembrar células cancerosas BT474 con una densidad de siembra de 2,0 x 106 células en un matraz T75 utilizando 10 ml de medios de crecimiento completos y cultivo (a 37 °C con 5% deCO2) a 70%-80% de confluencia antes de la inyección.
  2. El día de la inyección, deseche los medios de crecimiento y lave la monocapa celular con solución salina tamponada con fosfato (PBS) dos veces.
  3. Añadir 5 ml de reactivo de disociación de cultivo celular precalentado (ver Tabla de materiales) e incubar a 37 °C durante 5 min o hasta que las células se hayan desprendido. Después de 5 minutos, golpee suavemente el matraz para ayudar al desprendimiento de células.
  4. Agregue 5 ml de medios de crecimiento completos que contengan 10% de suero bovino fetal para calmar la actividad del reactivo de disociación.
  5. Resuspenda suavemente las células mediante pipeteo para reducir los grupos celulares.
  6. Transfiera la suspensión celular a un tubo de 50 ml y centrifugar a 180 x g durante 3 minutos a temperatura ambiente.
  7. Decantar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en 10 ml de la solución salina equilibrada de Hank (HBSS) sin calcio y magnesio para minimizar la aglutinación celular.
  8. Centrifugar la suspensión celular a 180 x g durante 3 min a temperatura ambiente.
  9. Decantar el sobrenadante para eliminar el suero residual/reactivo de disociación y resuspender el pellet celular en 3 mL de HBSS.
  10. Coloque un filtro de células de 100 μm en un tubo cónico fresco de 50 ml y pase la suspensión celular para eliminar los grupos de células.
    NOTA: Una suspensión de una sola célula es esencial para minimizar la oclusión de los vasos sanguíneos y el riesgo de accidente cerebrovascular en la inyección.
  11. Calcular el número de células viables utilizando la exclusión de azul de tripano y un hemocitómetro con métodos estándar.
  12. Diluir la suspensión celular con HBSS a una concentración celular de 2,5 x 106 células/ml.
  13. Mantenga el tubo horizontal sobre hielo y balancee suavemente el tubo periódicamente para minimizar la formación de grumos. La suspensión celular se puede almacenar en hielo durante un máximo de 6 h.
    NOTA: El balanceo se realizó manualmente, pero esto también se puede hacer usando un agitador a bajas rpm.

2. Preparación del ratón para el procedimiento

NOTA: En este estudio, se utilizaron ratones hembra NOD de 4-5 semanas de edad. Introduzca alimentos de recuperación de dieta blanda (por ejemplo, gel dietético, hidrogel, puré de ratón) a los ratones 3 días antes del procedimiento para estimular la alimentación después del procedimiento.

  1. Herramientas quirúrgicas de autoclave. Rocíe y limpie el área quirúrgica y el equipo con desinfectante de superficies, seguido de etanol al 70%.
  2. Coloque una estera de calor animal debajo de la tabla quirúrgica para evitar la hipotermia. Encienda esto 30 minutos antes de la cirugía. Rocíe y limpie la placa quirúrgica con desinfectante de superficies seguido de etanol al 70%.
  3. Prepare una jaula de alojamiento de animales limpia y una almohadilla térmica caliente para la recuperación.
  4. Póngase equipo de protección personal limpio (bata, máscara, redecilla y guantes). Mantenga la esterilidad durante todo el procedimiento mediante el uso de guantes de examen limpios y una técnica de "solo puntas de instrumentos".
  5. Anestesiar al ratón con una cámara anestésica utilizando isoflurano al 5% con un flujo de oxígeno de 2 L/min hasta que el ratón pierda el reflejo pedal.
  6. Saque al animal de la cámara y colóquelo en un cono nasal que suministre isoflurano al 2% a un flujo de oxígeno de 2 L/min para el procedimiento quirúrgico restante.
  7. Ratón perforador de orejas para identificación y use cortapelos eléctricos para afeitar el pelaje de la región del cuello. Limpie el exceso de vello de la piel expuesta con cinta adhesiva.
  8. Pesar el ratón para calcular las dosis de fármacos anestésicos y analgésicos necesarios. Administrar buprenorfina y meloxicam a 50 μg/kg y 1 mg/kg, respectivamente, mediante inyección subcutánea.
  9. Transfiera el ratón a una tabla quirúrgica caliente y asegure el cono de la nariz con cinta adhesiva.
  10. Aplique lubricante ocular en los ojos para evitar que se sequen.
  11. Asegure el ratón suavemente enganchando primero los dientes incisivos superiores con hilo pegado a la placa quirúrgica, seguido de cinta adhesiva en las patas delanteras y traseras. Este paso extiende el cuerpo y mantiene el cuello recto durante el procedimiento.
  12. Realice la preparación preoperatoria de la piel como se describe a continuación.
    1. Limpie el cuello con antiséptico tópico (povidona yodada) para reducir la carga de microflora de la piel y eliminar el vello suelto. Limpie desde el centro de la piel, trabajando hacia afuera para evitar la recontaminación del sitio de la incisión. Repita el proceso utilizando etanol al 70%. Realice tres rondas alternas de yodo y etanol para la desinfección.
    2. Coloque una cortina quirúrgica sobre el animal. Esto se corta y se forma a partir de un trozo de toalla de papel estéril o una bolsa de autoclave.
  13. Coloque toallas de papel estériles o bolsas de autoclave para herramientas quirúrgicas.
  14. Verifique el reflejo a través de la "prueba de pellizco" para garantizar una anestesia suficiente antes de continuar con el procedimiento.

3. Inyección interna de la carótida

NOTA: En este experimento, se utilizó una cánula de infusión de 31 G y una configuración de jeringa-controlador activada por el pie para facilitar el procedimiento de inyección (Figura complementaria 1). Esta configuración es opcional y el usuario puede usar una jeringa de insulina de 31 G y omitir los pasos 3.11 y 3.12. Para preparar la cánula de infusión, tire y separe la parte de la aguja de la porción de ajuste de jeringa de una aguja de 31 G utilizando dos pares de pinzas de sutura. A continuación, coloque la porción de la aguja en un extremo de un tubo de infusión fino de aproximadamente 10 cm de longitud.

  1. Coloque el microscopio de disección sobre el ratón.
  2. Usando tijeras, haga una incisión vertical de 15 mm a lo largo de la línea media en la región del cuello comenzando desde 5 mm por debajo de la mandíbula hasta la entrada torácica.
  3. Usando dos pares de pinzas en ángulo, separe la piel y las glándulas salivales subyacentes, y aplique retractores para mantener la tráquea expuesta. El siguiente paso expondrá la vaina carotídea que se encuentra paralela a la tráquea.
  4. Usando dos pares de pinzas en ángulo fino, disecciona sin rodeos el músculo y el tejido graso adyacente a la tráquea para exponer la vaina carotídea derecha. La vaina carotídea es la capa fibrosa que cubre la arteria carótida común, la vena y el nervio vago, y este haz puede ser visualizado por la arteria carótida común de color rojo brillante. En este estudio, la inyección se realizó en la arteria carótida derecha.
  5. Despejar un segmento de la arteria carótida común caudal a la bifurcación carotídea de la fascia circundante y separarla del nervio vago y las venas.
  6. Aislar y eliminar la bifurcación carotídea (la unión que une las arterias carótidas externas e internas) de los nervios y la fascia circundantes. Coloque fórceps finos debajo de la arteria carótida externa y pase una sutura de seda (grosor 5-0) debajo de la arteria. Anude y apriete la sutura y corte el exceso de línea.
    NOTA: Esta ligadura (L1) evitará que la inyección transite a través de la arteria carótida externa.
  7. Coloque pinzas finas debajo de la arteria carótida común y pase una sutura de seda (grosor 5-0) debajo de la arteria. Ate un nudo y apriete la sutura en una posición proximal al sitio de inyección propuesto. Cortar el exceso de sutura dejando unos 10 mm de línea.
    NOTA: Esta segunda ligadura (L2) restringirá el flujo sanguíneo y el sangrado después de la inyección. También se utiliza para posicionar y sostener la arteria carótida durante la inyección.
  8. Corte y humedezca una tira de limpiaparabrisas desechables de pelusa baja (en autoclave) (consulte la Tabla de materiales) de aproximadamente 10 mm x 5 mm. Doble la tira en 4 mm x 5 mm, 2-3 mm de grosor, y colóquela debajo de la arteria carótida en el sitio de inyección propuesto. Esto apoyará el vaso durante la inyección.
  9. En la arteria carótida común rostral hasta el sitio de inyección propuesto, coloque una tercera ligadura (L3) con un nudo suelto. Esto se aprieta sólo después de la inyección (en el paso 3.16).
  10. Agite suavemente la suspensión celular y extraiga 200 μL de suspensión celular en una jeringa de insulina (con aguja de 31 G).
  11. Cargue la jeringa en el controlador de la jeringa que está conectado a un pedal de activación.
  12. Coloque una cánula fina con una aguja de 31 G en la jeringa y prepare la línea.
  13. Compruebe si la arteria carótida está bien posicionada y presurizada.
  14. Usando dos pinzas en ángulo fino, una tensando suavemente el extremo de la primera ligadura y la otra sosteniendo la aguja 31 G, inserte lentamente la aguja con bisel hacia arriba en la luz del vaso sanguíneo teniendo cuidado de no perforarla.
  15. Inyecte lentamente 100 μL de suspensión celular (desde el paso 1.13) en la arteria carótida común a 10 μL/s. Esto entregará 2.5 x 105 células en el vaso sanguíneo. La inyección exitosa se visualiza a través de la limpieza de la sangre del vaso sanguíneo carotídeo.
  16. Levante y apriete suavemente la ligadura suelta (L3) (a partir del paso 3.9) inmediatamente después de retirar la aguja para evitar el reflujo y el sangrado. Recorte el exceso de sutura.
    NOTA: Es normal observar una pequeña cantidad de sangre brotando después de la retirada de la aguja. Sin embargo, no debe haber ningún sangrado activo después de apretar la tercera ligadura.
  17. Retire el pedazo de limpiaparabrisas desechables humedecidos de baja pelusa.
  18. Con una pipeta P200, enjuague la cavidad quirúrgica dos veces con 150-200 μL de agua estéril o solución salina.
  19. Verifique nuevamente si hay sangrado y luego retire los retractores.
  20. Reposicione el tejido blando, las glándulas salivales y la piel sobre la arteria carótida y la tráquea.
  21. Cierre la capa cutánea de la incisión con un soporte de aguja de sutura, fórceps y una sutura de monofilamento 6/0 absorbible o no absorbible en un patrón continuo.
  22. Deseche la jeringa de la aguja de la cánula y prepare una nueva configuración para el siguiente ratón. El uso de una jeringa nueva asegurará que el número de células inyectadas en cada ratón sea consistente.
    NOTA: Las instantáneas representativas del procedimiento se encuentran en la Figura complementaria 2. Si el vaso se perfora o se rompe con la aguja, indicado por la fuga de inyección o sangrado, el procedimiento se considera infructuoso. Después de esto, la aguja debe retirarse y la tercera ligadura debe apretarse inmediatamente para evitar un mayor sangrado. Si el sangrado es persistente después del endurecimiento de la sutura, el animal debe ser sacrificado con pentobarbital.

4. Recuperación post-inyección

  1. Inyecte buprenorfina (50 μg/kg) y meloxicam (1 mg/kg) mediante inyección subcutánea como alivio del dolor postquirúrgico.
  2. Mueva al animal a una jaula cálida y limpia para recuperarse de la anestesia. Es normal que un animal tenga una actividad moderada (acurrucado e inactivo o moviéndose lentamente) después de despertarse.
  3. Después de 30-45 minutos, transfiera los ratones a una instalación de retención a largo plazo.
  4. Proporcione a los ratones una dieta blanda (gel dietético, hidrogel, puré) durante al menos una semana después de la cirugía y verifique el estado físico diariamente con especial atención para detectar signos de accidente cerebrovascular, infección, sangrado alrededor del sitio de la herida.
  5. Dos días después de la cirugía, es típico que el animal tenga una actividad reducida, un pelaje ligeramente erizado y haya perdido el 15% del peso corporal preoperatorio. Administre analgésico (meloxicam) diariamente durante 2-3 días después de la cirugía para controlar el dolor y ayudar a la recuperación.
  6. A partir del día 3, los animales deben haber recuperado la actividad, aumentado la frecuencia de alimentación y aseo, y recuperado peso. Eutanasia a los animales con déficits persistentes de condición física (dolor, acurrucados, inactivos, pérdida de peso) después de 4 días después de la cirugía inyectando pentobarbital sódico a 200 mg / kg mediante inyección intraperitoneal.
  7. El injerto y la progresión del tumor se pueden monitorear mediante anestesia y la modalidad de imagen de elección, como imágenes bioluminiscentes, resonancia magnética o PET / MRI. El requisito y la capacidad para llevar a cabo tales imágenes dependerán inherentemente de los objetivos individuales del proyecto y de la instalación dentro de la cual se lleve a cabo, y dependiendo del tipo de etiqueta del reportero, las líneas celulares utilizadas, la accesibilidad de las instalaciones pertinentes de radioquímica y de imágenes nucleares36,37
    NOTA: Algunos animales pueden no responder bien y experimentar un derrame cerebral a pesar de un procedimiento exitoso. Después del procedimiento, los animales que presenten algún síntoma de angustia neurológica (girar la cabeza y tirar hacia un lado, comportamiento en círculos, rodar, golpear, pérdida de la función motora) deben ser sacrificados inmediatamente.

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Resultados

Comparación de la inyección de la arteria carótida común con o sin ligadura de la arteria carótida externa
Cuando se inyectaron células cancerosas a través de la arteria carótida común sin ligar primero la arteria carótida externa24, se encontraron tumores faciales en 77,8% de los ratones injertados (n = 7/9 animales). Un ejemplo de tumor facial se ilustra en la Figura Suplementaria 3. El método descrito en este protocolo previene la metástasi...

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Discusión

La metástasis cerebral es un proceso complejo de células cancerosas que se propagan desde su sitio primario hasta el cerebro. Existen diferentes modelos animales que reflejan ciertas etapas de este proceso de múltiples pasos y existen consideraciones fisiológicas y prácticas para diseñar estudios de metástasis preclínicas41,42. La mayoría de los estudios publicados que investigan el uso de la nanomedicina para el tratamiento de la metástasis cerebral han utilizad...

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener conflictos de intereses. Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio; en la recopilación, análisis o interpretación de datos; en la redacción del manuscrito, o en la decisión de publicar el artículo.

Agradecimientos

Esta investigación fue financiada por el Consejo Nacional Australiano de Salud e Investigación Médica (NHMRC), número de subvención APP1162560. ML fue financiado por una beca de investigación de posgrado de la UQ. Nos gustaría agradecer a todos los que ayudaron con la cría de animales y las imágenes in vivo de los animales. Agradecemos al Royal Brisbane and Women's Hospital por donar alícuotas de circonio para este estudio.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
100µ filtro de células mCorningCLS431752
30G Aguja MicrolanceBD23748
31G Ultra-Fine II jeringa de insulina BD326103
Pinzas acorazadasProscitechT67A-SSPunta fina, angulada sin dentados, punta de 18 mm, longitud 128 mm
Estera
Antibiótico y antimicóticoThermoFisher Scientific15240062
Bolsas
BT-474 (HTB-20) línea celular de cáncer de mamaATCCHTB-20
Buprenorfina (TEMGESIC)
Contador de células CountessThermoFisher ScientificC10227
Diet-76AClearH2O72-07-5022
Microscopio
disección Perforador
de orejas Cortaorejas Cortaúñas eléctricas Pinzas
punta: 0,4 x 0,3 mm, longitud 9 cm
Tubo fino para cánula, Diámetro exterior del tubo (pulgadas) 1/32, Diámetro interior del tubo (pulgadas) 1/100 pulgadasCole ParmerEW-06419-00
Suero fetal bovinoThermoFisher Scientific26140079
Solución salina equilibrada de Hank sin calcio ni magnesioThermoFisher Scientific14170120
HydrogelClearH2O70-01-5022
isoflurano
Baja pelusaKimberly Clark- KimwipesZ188964
ratón triturado
Meloxicam (METACAM)
Conode nariz Hecho de un tubo de microfuga
Lubricante ocular PAA (Carbómero 2 mg / g)  Bausch and lomb
Solución de povidona yodadaBetadine2505692
EPI (guante, mascarilla, bata, redecilla)
RetractoresKent ScientificSURGI-5001
RPMI 1640 MediaThermoFisher Scientific11875093
Sutura de seda 13mm 5-0, P3, 45cmEthiconJJ-640G
Solución salina normal estérilThermoFisher ScientificTM4469
Cinta
TablaUna tabla de cortar envuelta con una bolsa esterilizable en autoclave.
Tijeras quirúrgicasProscitechT104Dimensiones de la punta (LxD): 38x7mm, Longitud 115mm
Pinza de sutura/ Pinza Brophy curvadaProscitechT113CCurvada, Redondeada punta estrecha de 2 mm, con dentados, longitud 165 mm
Portaagujas de sutura (Portaagujas Olsen Hegar)ProscitechTC1322-180longitud 190 mm, abrazadera de trinquete
Atornillador de jeringas con pedal/ UMP3 Ultra micro bombaMatrazde cultivo de tejidos UMP3-3
T75ThermoFisher Scientific156499
Thread
Trigene II desinfectante de superficiesCeva
Trypan Blue y portaobjetos de cámara de recuento celular
TrypLE ExpressThermoFisher Scientific 12605010
térmica animalde autoclavede de ángulo fino Proscitech DEF11063-07 Angulado 45 grados, Punta lisa, Ancho de la punta: 0,4 mm, Dimensión de la Toallitas desechables Kimwipes de Comida de adhesiva quirúrgica de World Precision Instruments Medio disociador ThermoFisher Scientific C10228

Referencias

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  3. Maher, E. A., Mietz, J., Arteaga, C. L., DePinho, R. A., Mohla, S. Brain metastasis: opportunities in basic and translational research. Cancer Research. 69 (15), 6015-6020 (2009).
  4. Lin, N. U. Breast cancer brain metastases: new directions in systemic therapy. Ecancermedicalscience. 7, (2013).
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