Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Kardiyomiyositler Üzerindeki Mikroelektrot Dizisi ve Yama Kelepçesi Kayıtlarının Teknik Uygulamaları

Published: August 4, 2022 doi: 10.3791/64265
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2,3
1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Division of Cardiovascular Medicine, Department of Medicine, Stanford University School of Medicine, 3Department of Radiology, Stanford University School of Medicine

Summary

İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM'ler), ilaca bağlı kardiyotoksisite taraması ve hastalık modellemesi için umut verici bir in vitro model olarak ortaya çıkmıştır. Burada, hiPSC-CM'lerin kontraktilitesini ve elektrofizyolojisini ölçmek için bir protokol detaylandırıyoruz.

Abstract

İlaca bağlı kardiyotoksisite, ilaç yıpranmasının ve piyasadan çekilmesinin önde gelen nedenidir. Bu nedenle, uygun preklinik kardiyak güvenlik değerlendirme modellerinin kullanılması, ilaç geliştirme sırasında kritik bir adımdır. Şu anda, kardiyak güvenlik değerlendirmesi hala hayvan çalışmalarına büyük ölçüde bağımlıdır. Bununla birlikte, hayvan modelleri, özellikle kardiyak elektrofizyolojik özellikler açısından, türe özgü farklılıklar nedeniyle, insanlara zayıf translasyonel özgüllükten muzdariptir. Bu nedenle, klinik öncesi kardiyak güvenlik değerlendirmesi için güvenilir, verimli ve insan temelli bir model geliştirmeye acil bir ihtiyaç vardır. İnsan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM'ler), ilaca bağlı kardiyotoksisite taraması ve hastalık modellemesi için paha biçilmez bir in vitro model olarak ortaya çıkmıştır. hiPSC-CM'ler, farklı genetik geçmişlere ve çeşitli hastalıklı koşullara sahip bireylerden elde edilebilir, bu da onları ilaca bağlı kardiyotoksisiteyi ayrı ayrı değerlendirmek için ideal bir vekil haline getirir. Bu nedenle, hiPSC-CM'lerin fonksiyonel özelliklerini kapsamlı bir şekilde araştırmak için metodolojiler oluşturulmalıdır. Bu protokolde, kontraktilite, alan potansiyeli, aksiyon potansiyeli ve kalsiyum işleme ölçümü de dahil olmak üzere hiPSC-CM'ler üzerinde değerlendirilebilecek çeşitli fonksiyonel testleri detaylandırıyoruz. Genel olarak, hiPSC-CM'lerin klinik öncesi kardiyak güvenlik değerlendirmesine dahil edilmesi, ilaç geliştirmede devrim yaratma potansiyeline sahiptir.

Introduction

İlaç geliştirme uzun ve pahalı bir süreçtir. 2009 ve 2018 yılları arasında ABD Gıda ve İlaç İdaresi (FDA) tarafından onaylanan yeni terapötik ilaçların bir çalışması, kapitalize edilmiş araştırma ve klinik çalışmaların tahmini medyan maliyetinin ürün başına 985 milyon dolar olduğunu bildirmiştir1. İlaca bağlı kardiyotoksisite, ilaç yıpranmasının ve piyasadan çekilmesinin önde gelen nedenidir2. Özellikle, kardiyotoksisite birden fazla terapötik ilaç sınıfı arasında bildirilmiştir3. Bu nedenle, kardiyak güvenlik değerlendirmesi, ilaç geliştirme sürecinde çok önemli bir bileşendir. Kardiyak güvenlik değerlendirmesi için mevcut paradigma hala hayvan modellerine büyük ölçüde bağımlıdır. Bununla birlikte, hayvan modellerinin kullanımından kaynaklanan tür farklılıkları, insan hastalarında ilaca bağlı kardiyotoksisite için yanlış tahminlerin birincil nedeni olarak giderek daha fazla kabul edilmektedir4. Örneğin, kardiyak aksiyon potansiyelinin morfolojisi, farklı repolarize akımların katkıları nedeniyle insanlar ve fareler arasında önemli ölçüde farklılık gösterir5. Ek olarak, kardiyak miyozin ve dairesel RNA'ların kardiyak fizyolojiyi etkileyebilecek diferansiyel izoformları,türler arasında iyi belgelenmiştir 6,7. Bu boşlukları kapatmak için, klinik öncesi kardiyak güvenlik değerlendirmesi için güvenilir, verimli ve insan temelli bir model oluşturmak zorunludur.

İndüklenmiş pluripotent kök hücre (iPSC) teknolojisinin çığır açan icadı, benzeri görülmemiş ilaç tarama ve hastalık modelleme platformları oluşturmuştur. Son on yılda, insan kaynaklı pluripotent kök hücre kaynaklı kardiyomiyositler (hiPSC-CM'ler) üretme yöntemleri iyi kurulmuş 8,9 haline gelmiştir. hiPSC-CM'ler, hastalık modelleme, ilaca bağlı kardiyotoksisite taraması ve hassas tıptaki potansiyel uygulamalarına büyük ilgi duymuştur. Örneğin, uzun QT sendromu 10, hipertrofik kardiyomiyopati 11,12 ve dilate kardiyomiyopati 13,14,15 gibi genetik kalıtımın neden olduğu kalp hastalıklarının patolojik fenotiplerini modellemek için hiPSC-CM'ler kullanılmıştır. Sonuç olarak, kalp hastalıklarının patogenezinde rol oynayan ve etkili tedavi için potansiyel terapötik stratejilere ışık tutabilecek anahtar sinyal yolları tanımlanmıştır. Ayrıca, hiPSC-CM'ler, doksorubisin, trastuzumab ve tirozin kinaz inhibitörleri16,17,18 dahil olmak üzere antikanser ajanlarla ilişkili ilaca bağlı kardiyotoksisiteyi taramak için kullanılmıştır; Ortaya çıkan kardiyotoksisiteyi hafifletmek için stratejiler araştırılmaktadır. Son olarak, hiPSC-CM'lerde tutulan genetik bilgi, ilaca bağlı kardiyotoksisitenin hem bireysel hem de popülasyon seviyelerindetaranmasına ve tahmin edilmesine izin verir 19,20. Toplu olarak, hiPSC-CM'lerin kişiselleştirilmiş kardiyak güvenlik tahmini için paha biçilmez bir araç olduğu kanıtlanmıştır.

Bu protokolün genel amacı, hiPSC-CM'lerin hastalık modellemesine, ilaca bağlı kardiyotoksisite taramasına ve hassas tıbba uygulanmasında büyük önem taşıyan hiPSC-CM'lerin fonksiyonel özelliklerini kapsamlı ve verimli bir şekilde araştırmak için metodolojiler oluşturmaktır. Burada, hiPSC-CM'lerin fonksiyonel özelliklerini değerlendirmek için, kontraktilite, alan potansiyeli, aksiyon potansiyeli ve kalsiyum (Ca2+) kullanımının ölçümü de dahil olmak üzere bir dizi fonksiyonel tahlili detaylandırıyoruz (Şekil 1).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Medya ve çözeltilerin hazırlanması

  1. 10 mL'lik bir şişe 50x B27 takviyesi ve 500 mL RPMI 1640 ortamını karıştırarak hiPSC-CM bakım ortamını hazırlayın. Ortamı 4 ° C'de saklayın ve bir ay içinde kullanın. Kullanmadan önce ortamdan oda sıcaklığına (RT) dengeleyin.
  2. 20 mL serum replasmanı ve 180 mL hiPSC-CM bakım ortamı (%10 seyreltme, v/v) karıştırarak hiPSC-CM tohumlama ortamı hazırlayın. Taze hazırlanmış tohumlama ortamı tercih edilirken, 4 ° C'de en fazla 2 hafta saklanabilir. Kullanmadan önce ortamı RT'ye dengeleyin.
  3. Bir şişe (10 mL) bazal membran matrisini gece boyunca 4 °C'de çözerek ve steril 1,5 mL tüplerde 500 μL bazal membran matrisini alıntılayarak hücre dışı matris kaplama çözeltisi hazırlayın. Daha fazla kullanım için -20 ° C'de saklayın. Bodrum membranı matris kaplama çözeltisi yapmak için 500 μL bazal membran matrisi ve 100 mL buz gibi soğuk DMEM / F12 ortamını (1:200 seyreltme, v / v) karıştırın.
  4. 135 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 1.8 mM CaCl2, 5 mM glikoz ve 10 mM HEPES içeren 50 mL Tyrode çözeltisi hazırlayın. NaOH ile pH'ı 7,4'e ayarlayın. Deney gününde taze Tyrode çözeltisini hazırlayın.
  5. 120 mM KCl, 1 mM MgCl 2, 10 mM EGTA ve 10 mM HEPES içeren 50 mL hücre içi pipet çözeltisi hazırlayın. KOH ile pH'ı 7,2'ye ayarlayın. Hücre içi pipet çözeltisini steril 5 mL tüplerde alıkoyun ve -20 °C'de saklayın. Deney gününde, 3 mM'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için çözeltiye taze olarak MgATP ekleyin.
  6. 2 μM Fura-2 ve% 0.1 Pluronik F-127 içeren 1 mL Fura-2 yükleme çözeltisi hazırlayın. Deney gününde taze yükleme çözeltisi hazırlayın ve ışıktan koruyun.

2. HiPSC-CM büzülme hareketinin ölçülmesi

  1. 96 delikli plakaların her bir kuyucuğuna 100 μL hücre dışı matris kaplama çözeltisi ekleyerek bazal membran matris kaplı plakalar hazırlayın. 96 kuyucuklu plakaları nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de, gece boyunca% 5 CO2'de inkübe edin.
  2. HiPSC-CM'lerin enzimatik ayrışması
    1. Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank'tan (http://med.stanford.edu/scvibiobank.html) hiPSC talep edin. Önceki yayınlara göre hiPSC-CM'ler oluşturun 8,9. Altı kuyucuklu plakalarda kültürlenmiş hiPSC-CM'leri mikroskop altında 10x büyütmede gözlemleyin.
      NOT: Hücreleri hala proliferatif olduklarında ayırmayın. Aksi takdirde, hücreler yeniden kaplandıktan sonra kuyucuklarda aşırı büyüyecek ve fonksiyonel testlerin yanlış sonuçlarına yol açacaktır. Genellikle, hiPSC-CM'ler 18-23. günlerde proliferasyonu durdurur.
    2. HiPSC-CM'lerin güçlü bir şekilde attığından ve% 95'in üzerinde bir saflığa sahip olduğundan emin olun. Kardiyomiyositlerin spesifik bir belirteci olan kardiyak troponin T'ye karşı immün boyama yaparak saflığı değerlendirin 8,9.
    3. Bakım ortamını aspire edin ve hücreleri iki kez 1x DPBS ile yıkayın. Altı kuyucuklu plakaların her bir kuyucuğuna 1 mL hücre ayırma çözeltisi ekleyin ve 37 ° C'de 10 dakika boyunca inkübe edin.
      NOT: Kuluçka süresi düzenli olarak izlenmelidir. Hücre canlılığını azaltacağı için hücreleri aşırı sindirmediğinizden emin olun.
    4. Tek hücreli bir süspansiyon oluşturmak için 5 mL'lik bir pipet kullanarak hiPSC-CM'leri birkaç kez yukarı ve aşağı nazikçe pipetleyin. Hücre ayrılma çözeltisini nötralize etmek için eşit miktarda hiPSC-CMs tohumlama ortamı ekleyin.
    5. RT'de 3 dakika boyunca 300 x g'de hiPSC-CM'leri santrifüj yapın. süpernatantı aspire edin ve hücre peletini 1-2 mL hiPSC-CM tohumlama ortamında yeniden askıya alın.
    6. Bir tripan mavisi dışlama yöntemi kullanarak hücre yoğunluğunu ve canlılığını ölçün. Kısaca, 10 μL hücre süspansiyonunu eşit miktarda tripan mavisi ile karıştırın, bir hücre sayma slaytına aktarın ve daha önce açıklandığı gibi bir hücre sayacı kullanarak sayın21.
  3. Tohumlama hiPSC-CM'ler
    1. Hücre dışı matris kaplama solüsyonunu 96 delikli plakalardan çıkarın.
    2. 100 μL hiPSC-CM tohumlama ortamında kuyucuk başına 50.000 hücre tohumlayın ve 96 kuyucuklu plakaları nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatörüne 37 ° C'de, gece boyunca% 5 CO2'ye yerleştirin.
    3. Kaplamadan 1 gün sonra hiPSC-CM tohumlama ortamını 100 μL hiPSC-CM bakım ortamı ile değiştirin. Kayda kadar hiPSC-CM bakım ortamını her 2 günde bir değiştirin.
  4. Veri toplama
    1. HiPSC-CM kasılma hareketini kaplamadan en az 10 gün sonra ölçün (önerilir).
    2. Sıcaklık kontrol cihazını açın ve tercih edilen sıcaklık olarak 37 °C ayarlayın. Mikroskop, kamera ve CO2 beslemesini açın.
    3. Plaka tutucunun su ceketini uygun miktarda steril deiyonize su ile doldurun (Şekil 2A). 96 delikli plakayı plaka tutucuya yerleştirin ve hücrelerin en az 5 dakika boyunca alışmasına izin verin.
    4. Görüntüleme yazılımını açın, kamera kare hızını saniyede 75 kare (fps) ve video/görüntü çözünürlüğünü 1024 × 1024 piksel olarak ayarlayın. Otomatik odaklama ve otomatik parlaklık işlevlerini uygulayın. HiPSC-CM'lerin videolarını ve görüntülerini kaydedin.
      NOT: Kayıt sırasında mikroskop tablosunun titreşiminden kaçının.
    5. Otomatik analiz için analizör yazılımını açın.

3. HiPSC-CM alan potansiyelinin ölçülmesi

  1. Bodrum membranı matris kaplı plakaların hazırlanması
    1. 48 delikli mikroelektrot dizisi (MEA) plakalarının her bir kuyucuğunun kayıt elektrot alanı üzerine 8 μL'lik bir hücre dışı matris kaplama çözeltisi damlacığını dikkatlice yerleştirin. Damlacık yerleştirme için uygun elektrot alanı için Şekil 3A'ya bakınız. Bu adım, hiPSC-CM monokatmanının elektrotlar üzerinde yoğunlaşmasını sağlamak için kritik öneme sahiptir. Hiçbir koşulda elektrotlara dokunmaktan kaçının.
    2. Kaplama çözeltisinin buharlaşmasını önlemek için 48 kuyulu MEA plakalarının kuyularını çevreleyen alana 3 mL steril deiyonize su ekleyin (Şekil 3A). 48 kuyucuklu MEA plakalarını nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de, 45-60 dakika boyunca% 5 CO2'de inkübe edin.
      NOT: Bodrum membran matrisinin kurumasını önlemek için çok uzun süre kuluçkaya yatmayın.
  2. Adım 2.2'de açıklandığı gibi hiPSC-CM'lerin enzimatik ayrışmasını gerçekleştirin.
  3. Tohumlama hiPSC-CM'ler
    1. Aynı tek sıra veya sütun içinde 200 μL'lik bir pipet ucu kullanarak elektrotlara dokunmadan hücre dışı matris ortamının çoğunu kuyu yüzeyinden çıkarın.
    2. Aynı sıra veya sütundaki her bir kuyucuğun kayıt elektrodu alanı üzerinde 8 μL'lik bir hiPSC-CM tohumlama ortamı damlacığında kuyucuk başına 50.000 hücre tohumlayın.
    3. Tüm kuyular hücrelerle kaplanana kadar son iki adımı tekrarlayın. Mikroskop altında tüm kuyucukların hiPSC-CM süspansiyonuna sahip olup olmadığını kontrol edin. İstenilen yoğunluk için bkz: Şekil 3B.
      NOT: Bodrum membran matrisi tamamen kuruduğunda hiPSC-CM'lerin bağlantısı tehlikeye girer ve hücre bağlanması optimal değildir.
    4. 48 kuyucuklu MEA plakalarını nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de, 60 dakika boyunca% 5 CO2'de inkübe edin.
    5. 48 delikli MEA plakalarının her bir kuyucuğuna yavaşça ve nazikçe 150 μL hiPSC-CM tohumlama ortamı ekleyin. Daha önce tohumlanmış hiPSC-CM'leri dağıtmadan ortam eklemek için, plakayı 45° açıyla tutun, pipet ucunu her bir kuyucuğun duvarına yaslayın ve ortamı yavaşça serbest bırakın.
      NOT: Ortamın çok hızlı veya yüksek basınçla eklenmesi, yapıştırılan kardiyomiyositleri yerinden çıkaracaktır. Yüksek PSC-CM düşme süspansiyonu ile doğrudan temastan kaçının.
    6. 48 kuyucuklu MEA plakalarını nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de, gece boyunca% 5 CO2'de inkübe edin.
    7. Kaplamadan 1 gün sonra hiPSC-CM tohumlama ortamını 300 μL hiPSC-CM bakım ortamı ile yenileyin. Kayıttan önce her 2 günde bir hiPSC-CM bakım ortamını değiştirin.
  4. Veri toplama
    1. Kaplamadan en az 10 gün sonra MEA ölçümü yapın (önerilir). Kaplama sonrası 10. günde, Şekil 3C'de gösterildiği gibi olması gereken 10x büyütmede mikroskop altında spontan dayak hiPSC-CM tek katmanının yoğunluğunu kontrol edin.
    2. 48 delikli MEA plakasını kayıt cihazına yerleştirin. Dokunmatik ekran, sıcaklık (37 ° C) ve CO2 (% 5) durumunu gözlemlemenizi sağlar.
    3. Gezgin yazılımını açın. Deney kurulum penceresinde, Kardiyak Gerçek Zamanlı Yapılandırma ve Alan Potansiyel Kayıtları'nı seçin. Spontane veya tempolu vuruş yapılandırmaları uygulayın.
    4. Vuruş algılama parametrelerinde, algılama eşiğini 300 μV'ye, minimum vuruş süresini 250 ms'ye ve maksimum vuruş süresini 5 sn'ye ayarlayın. Alan potansiyel süresi (FPD) hesaplaması için Polinom Regresyonu'nu seçin.
    5. Temel elektriksel aktivite sinyalinin olgun ve kararlı olup olmadığını kontrol edin.
      NOT: Çok kuyulu MEA plakasından her elektrot tarafından kaydedilen olgun dalga formları, Şekil 3D-F'de gösterildiği gibi, kardiyak depolarizasyon artışı ve repolarizasyon fazı ile çakışan kolayca tanımlanabilen özelliklere sahip kardiyak alan potansiyelini yansıtmalıdır.
    6. 1-3 dakika boyunca temel kardiyak aktiviteleri edinin. İlaç tedavisine ihtiyaç duyulursa, temel kayıttan sonra kuyucuklara bileşikler ekleyin. Bir sonraki kayıttan önce plakayı en az 30 dakika boyunca bir inkübatöre yerleştirin.

4. HiPSC-CM aksiyon potansiyelinin ölçülmesi

  1. 35 mm'lik tabakların cam alt kısmına 500 μL hücre dışı matris kaplama çözeltisi yerleştirerek bazal membran matris kaplı tabaklar hazırlayın (Şekil 4A). 35 mm'lik bulaşıkları nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de, gece boyunca% 5 CO2'de inkübe edin.
  2. Adım 2.2'de açıklandığı gibi hiPSC-CM'lerin enzimatik ayrışmasını gerçekleştirin.
  3. Tohumlama hiPSC-CM'ler
    1. Hücre dışı matris kaplama solüsyonunu 35 mm'lik tabaklardan çıkarın. 35 mm'lik tabakların cam alt kısmında 500 μL hiPSC-CM tohumlama ortamında kuyu başına 50.000 hücre tohumlayın.
    2. 35 mm'lik bulaşıkları nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de, gece boyunca% 5 CO2'de inkübe edin. hiPSC-CM tohumlama ortamını çıkarın ve 35 mm'lik tabaklara 2 mL hiPSC-CM bakım ortamı ekleyin.
      NOT: Hücrelere dokunmamak üzere harcanan ortamı çıkarmak için 2 mL aspirasyon pipetinin üzerine 200 μL filtrelenmemiş bir uç yerleştirilmesi önerilir.
    3. Kayıttan önce her 2 günde bir hiPSC-CM kültür ortamını değiştirin.
  4. Veri toplama
    1. Kaplamadan en az 10 gün sonra aksiyon potansiyeli ölçümü yapın (önerilir). Adım 1.4'te açıklandığı gibi taze Tyrode çözeltisini hazırlayın. Bir hücre içi pipet çözeltisinin bir alikotunu çözün ve taze olarak 3 mM'lik son konsantrasyona MgATP ekleyin.
    2. Mikropipetleri bir mikropipet çektirici kullanarak borosilikat cam kılcal damarlardan çekin.
      NOT: Mikropipetlerin 2-5 MΩ direnci tercih edilir.
    3. HiPSC-CM bakım ortamını Tyrode çözeltisi ile değiştirin ve hücrelerin 15 dakika boyunca Tyrode'un çözeltisine alışmasına izin verin (Şekil 4C). Sıcaklık sensörlerini hazneye yerleştirin, 35 mm'lik çanağı Şekil 4C'de gösterildiği gibi hazneye yerleştirin ve sıcaklığı 37 °C'ye ayarlayın (Şekil 4D).
    4. Mikropipetleri hücre içi çözelti ile doldurun ve yama kelepçeli amplifikatör baş kısmına bağlı tutucuya yerleştirin (Şekil 4E). Stimülasyon/alma yazılımını açın, aksiyon potansiyeli kayıt protokolünü yükleyin ve voltaj kelepçesi yapılandırmasını seçin.
    5. Mikropipeti banyo çözeltisine yerleştirin, uygun tek hiPSC-CM'leri seçin ve bir mikromanipülatör kullanarak seçilen hücrenin yanındaki mikropipetin konumunu ayarlayın ve indirin. Pipet ucu banyo çözeltisine yerleştirildiğinde, osiloskop monitöründe gözlemlenebilecek pipet direncini kontrol edin.
    6. Pipetin hücreye yakın bir yere yerleştirilmesi durumunda, akım darbeleri artan sızdırmazlık direncini yansıtacak şekilde hafifçe azalacaktır. Bir gigaseal oluşturacak olan direnci arttırmak için negatif basınçla nazik bir emme uygulayın. Mühür işlevini uygulayın.
    7. Tüm hücre kayıt konfigürasyonunu elde etmek için zarı kırmak için ek emme uygulayın. Pipet alanındaki membran kısmı emme ile yırtıldıktan sonra, iç çözelti hücre sitoplazması ile dengededir. Bu noktada, amplifikatör iletişim kutusunu kullanarak voltaj kelepçesi modundan (V-kelepçesi) akım kelepçesi moduna veya akım enjeksiyonu yapmamaya (C-Kelepçesi) geçin. Eylem potansiyel kayıt dosyalarını oluşturmak ve kaydetmek için Kaydet düğmesine basın.
      NOT: Mod değişikliği, hiPSC-CM'lerin spontan aksiyon potansiyellerinin, yama kelepçeli amplifikatörün V-mon çıkışında izlenebilen tetikleyici ve stimülasyon kayıt protokolü olmadan sürekli olarak kaydedilmesini sağlar.

5. hiPSC-CM Ca2+ geçici ölçümü

  1. Ca2+ görüntüleme21 için özelleştirilmiş hücre odacıkları hazırlamak için önceki protokole bakın. Bodrum membran matris kaplı hücre odasının hazırlanması için, hücre odalarına 200 μL hücre dışı matris kaplama çözeltisi yerleştirin. Hücre odalarını nemlendirilmiş bir hücre kültürü inkübatöründe 37 ° C'de, gece boyunca% 5 CO2'de inkübe edin.
  2. Adım 2.2'de açıklandığı gibi hiPSC-CM'lerin enzimatik ayrışmasını gerçekleştirin.
  3. Tohumlama hiPSC-CM'ler
    1. Hücre dışı matris kaplama solüsyonunu hücre odalarından çıkarın. 200 μL hiPSC-CM tohumlama ortamında kuyu başına 20.000 hücre tohumlayın.
    2. Kaplamadan 1 gün sonra hiPSC-CM tohumlama ortamını 200 μL hiPSC-CM bakım ortamı ile değiştirin. Kayıttan önce her 2 günde bir hiPSC-CM bakım ortamını değiştirin.
  4. Veri toplama
    1. Kaplamadan en az 10 gün sonra Ca2+ geçici ölçüm yapın (önerilir). Adım 1.4'te açıklandığı gibi taze Tyrode çözeltisini hazırlayın. Adım 1.6'da açıklandığı gibi taze Fura-2 yükleme çözeltisi hazırlayın.
    2. HiPSC-CM bakım ortamını aspire edin ve Tyrode çözeltisi ile iki kez yıkayın. 100 μL Fura-2 yükleme çözeltisi uygulayın ve RT'de 10 dakika kuluçkaya yatırın.
    3. Fura-2 yükleme çözümünü Tyrode çözeltisiyle değiştirin ve Fura-2'nin tamamen deesterifikasyonu için en az 5 dakika bekleyin.
    4. 40x yağ daldırma hedefi (0.95 NA) ile donatılmış ters çevrilmiş bir epifloresan mikroskobun 40x hedefine bir damla daldırma yağı ekleyin. Hücre odasını mikroskobun sahne adaptörüne yerleştirin (Şekil 5A).
    5. Sıcaklık kontrol cihazı tellerini banyo odasına takın ve 37 ° C'ye ayarlayın. Elektrik alan stimülasyon elektrotlarını takın ve darbeleri 20 ms süreyle 0,5 Hz'ye ayarlayın.
    6. Ultra yüksek hızlı dalga boyu değiştirme ışık kaynağını açın ve cihazın talimatlarına göre 340 nm ve 380 nm hızlı geçiş moduna ayarlayın.
    7. Yazılımda hem dalga boyları hem de 20 sn'lik bir kayıt süresi için 20 ms'lik bir pozlama süresi uygulayın. HiPSC-CM'lerde geçici Ca2+ 'nın gerçek zamanlı değişikliklerini yansıtan videoyu kaydedin. Verileri bir elektronik tabloya aktarın ve verileri daha önce açıklandığı gibi analiz edin23.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Bu protokol, hiPSC-CM'lerin büzülme hareketinin, alan potansiyelinin, aksiyon potansiyelinin ve Ca2+ geçiciliğinin nasıl ölçüleceğini açıklar. Enzimatik sindirim, hücre tohumlaması, bakım ve fonksiyonel tahlil iletimini içeren şematik bir diyagram Şekil 1'de gösterilmiştir. HiPSC-CM tek katmanının oluşumu, büzülme hareketi ölçümü için gereklidir (Şekil 2B). HiPSC-CM'lerin büzülme-gevşeme hareketinin temsili bir izi Şekil 2C'de gösterilmiştir. Analizör yazılımı, varsayılan ayarı kullanarak kasılma başlangıcını, büzülme zirvesini, büzülme sonunu, gevşeme zirvesini ve gevşeme sonunu algılayarak kasılma-gevşeme hareket izlerinin otomatik bir şekilde analiz edilmesini sağlar (Şekil 2D). Kasılma hızları ve gevşeme zirveleri, hiPSC-CM'lerin kasılma ve gevşeme kapasitelerini değerlendirmek için kullanılır. Ayrıca kasılma ve gevşeme deformasyon mesafeleri de elde edilebilir.

MEA testi, alan potansiyelleri olarak bilinen aksiyon potansiyellerinin hücre dışı kaydıdır. Alan potansiyellerinin başarılı bir şekilde ölçülmesi, MEA plakalarının her bir kuyucuğundaki tüm elektrotlar üzerindeki hiPSC-CM monokatmanının tam olarak kapsanmasını gerektirir (Şekil 3C). Her elektrot tarafından kaydedilen olgun dalga formları, Şekil 3D-F'de gösterildiği gibi, kolayca tanımlanabilen özelliklere sahip kardiyak alan potansiyelini yansıtmalıdır. Belirtilen kalite standartları şunlardır: 1) temel aktivite dakikada 20-90 atım içinde kendiliğinden bir vuruş göstermeli, 2) dayak hızı, tüm kuyulardaki temel atma hızı için hesaplanan 6 SD içinde olmalı, 3) atış periyodunun varyasyon katsayısı% 5'ten az olmalı ve 4) depolarizasyon genliği 0.3 mV'un üzerinde olmalıdır, daha önce yayınlandığı gibi22. Şekil 3E, hiPSC-CM'lerin temsili alan potansiyel izlerini göstermektedir. Gezgin yazılımı, vuruşları ve FPD'yi otomatik olarak algılar ve tanımlar. Analizden sonra vuruş periyodu, FPD ve spike genliği elde edilebilir (Şekil 3F). Spesifik olarak, atış periyodu depolarizan tepeden tepeye aralık ile belirlenir, FPD, depolarize edici tepe ile repolarizasyon zirvesi arasındaki aralık ile belirlenir ve başak genliği, Şekil 3F'de gösterildiği gibi, depolarizan pozitif tepe ile negatif tepe arasındaki mesafe ile ölçülür.

Tek hücreli yama kelepçesi, hiPSC-CM'lerin elektrofizyolojik özelliklerini değerlendirmek için altın standarttır (Şekil 4B). Akım sıkıştırma modundaki tüm hücre yama kelepçesi kayıtları, tek hiPSC-CM'lerin kendiliğinden aksiyon potansiyellerini kaydedebilir (Şekil 4F). Analizden sonra, genlik, maksimum diyastolik potansiyel (MDP) ve aksiyon potansiyeli süresi (APD)% 30,% 50 ve% 90 repolarizasyon dahil olmak üzere çeşitli parametreler elde edilebilir (Şekil 4G).

Ca2+ görüntüleme için, bireysel hiPSC-CM'lerin zaman içindeki floresan yoğunluk değişiklikleri yazılım tarafından kaydedilebilir. Fura-2 yüklü hiPSC-CM'lerin temsili bir alanı Şekil 5B'de gösterilmiştir. Ultra yüksek hızlı dalga boyu değiştiren ışık kaynağının kullanılması, kare modu taraması yoluyla yüzlerce hiPSC-CM'den Ca2+ geçicilerinin kaydedilmesini sağlar. Elektronik tablo tabanlı bir program23 ile yapılan analizden sonra, her hücre için zaman içinde F340/F380 oranı elde edilebilir. Daha sonra, uyarılmış Ca2+ geçicilerinin ham izleri çizilebilir (Şekil 5C). Ayrıca genlik, diyastolik Ca2+ ve Ca2+ bozunma tau gibi parametreler elde edilebilir (Şekil 5D).

Figure 1
Şekil 1. Protokolün genel şematik diyagramı. 0. günde, bodrum membran matris kaplı 96 delikli plakalar / 48 delikli MEA plakaları / 35 mm tabaklar / hücre odaları üzerinde hiPSC-CM'leri sindirin ve tohumlayın. Bir hücre hareketi görüntüleme sistemi, MEA, yama kelepçesi ve Ca2 + görüntüleme sistemi kullanarak fonksiyonel tahlilleri gerçekleştirmeden önce en az 10 günlük bir iyileşme süresine izin verin. Kısaltmalar: MEA = mikroelektrot dizisi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2. Kasılma hareketinin ölçülmesi. (A) Hücre hareketi görüntüleme sistemi. (B) hiPSC-CM tek katmanının temsili bir bölgesi. Ölçek çubuğu: 20 μm. (C) HiPSC-CM'lerin temsili kasılma-gevşeme izleri. (D) Kasılma başlangıcını, kasılma zirvesini, kasılma sonunu, gevşeme zirvesini ve gevşeme sonunu gösteren bir kasılma-gevşeme izinin şematik diyagramı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3. Alan potansiyelinin ölçülmesi. (A) 48 delikli bir MEA plakasının (solda), (ortada) 16 elektrotlu bir kuyucuğun ve (sağda) bir bazal membran matris-damlacığının kaplaması gereken alanın üst görünümleri. Buharlaşmayı telafi etmek için su rezervuarına yeterli damıtılmış su ekleyin. (B) hiPSC-CM süspansiyon ve yeniden kaplamadan sonra istenen yoğunluk. (C) HiPSC-CM tek katmanının temsili bir bölgesi. (D) 48 kuyucuklu MEA plakasının bir kuyucuğundaki 16 elektrottan sürekli dalga formu grafikleri. (E) HiPSC-CM'lerin temsili alan potansiyel izleri. (F) Parametrelerin nasıl analiz edildiğini gösteren bir alan potansiyel izlemesinin şematik diyagramı. Kısaltma: FPD = alan potansiyel süresi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4. Aksiyon potansiyelinin ölçülmesi. (A) 35 mm'lik tabaklar üzerine bazal membran matris kaplama ve hiPSC-CMs süspansiyon yerleşimi. (B) Tek hiPSC-CM'lerin temsili bölgesi. Ölçek çubuğu: 20 μm. (C-E) Patch-kelepçe sistemi kurulumu. (F) HiPSC-CM'lerin temsili eylem potansiyel izleri. (G) Parametrelerin nasıl analiz edildiğini gösteren bir eylem potansiyeli izlemesinin şematik diyagramı. Kısaltmalar: APD = aksiyon potansiyeli süresi, MDP = maksimum diyastolik potansiyel. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5. Ca2+ geçici ölçümü. (A) Ca2+ görüntüleme sistemi. (B) Fura-2 yüklü tek hiPSC-CM'lerin temsili bir bölgesi. Ölçek çubuğu: 100 μm. (C) Temsili Ca2+ hiPSC-CM'lerin geçici izleri. (D) Parametrelerin nasıl analiz edildiğini gösteren bir Ca2+ geçici izlemenin şematik diyagramı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

İnsan iPSC teknolojisi, hastalık modelleme ve ilaç taraması için güçlü bir platform olarak ortaya çıkmıştır. Burada, hiPSC-CM kontraktilitesini, alan potansiyelini, aksiyon potansiyelini ve Ca2 + geçicisini ölçmek için ayrıntılı bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol, hiPSC-CM kontraktilitesinin ve elektrofizyolojisinin kapsamlı bir karakterizasyonunu sağlar. Bu fonksiyonel testler grubumuzun 12,13,18,24,25,26,27 sayılı yayınlarında uygulanmıştır.

İyi vuruş koşullarında olan hiPSC-CM'leri kullanmak önemlidir, aksi takdirde okumaların sinyal-gürültü oranı önemli ölçüde düşecektir. Ek olarak, ölçümlerden önce hiPSC-CM'lerin yüksek saflığının sağlanması arzu edilir. Kardiyomiyosit olmayanların varlığı, her ikisi de hiPSC-CM monokatmanının oluşumunu gerektiren kasılma hareketinin ve alan potansiyeli ölçümlerinin veri doğruluğunu özellikle tehlikeye atabilir. Ayrıca, hiPSC-CM'lerin olgunlaşmamış olması, hiPSC-CM'lerin çeşitli alanlarda tam olarak uygulanmasını engelleyen önemli bir endişe kaynağı olmaya devam etmektedir28. HiPSC-CM'lerin morfoloji, kontraktilite, elektrofizyoloji, Ca2+ kullanımı ve metabolizma29 dahil olmak üzere birçok açıdan fonksiyonel olarak olgunlaşmamış olduğu bilinmektedir. Bu nedenle, fonksiyonel tahliller yapılmadan önce hiPSC-CM'lerin kültürde en az 30. güne kadar tutulması önerilir. Alternatif olarak, fonksiyonel tahliller30 yapılmadan önce hiPSC-CM'lerin olgunluğunu artırmak için oluşturulmuş çeşitli stratejiler benimsenebilir. Örneğin, metabolik olgunlaşma ortamında kültürlenen hiPSC-CM'ler, normal RPMI ortamında kültürlenen hiPSC-CM'lere kıyasla oldukça negatif MDP aksiyon potansiyelleri ve Ca2 + geçicilerinin önemli ölçüde daha hızlı bozunmasını sergilemiştir31. Son olarak, hiPSC-CMs32'nin partiden partiye varyasyonları vardır. Bu nedenle, aynı iPSC hatlarının en az üç bağımsız farklılaşmasından üretilen hiPSC-CM'ler hakkında veri toplanmalıdır.

Hücre hareketi görüntüleme sistemi, hiPSC-CM'lerin kasılma ve gevşeme hareketini ölçmek için yüksek verim ve verimli bir platform sağlar. Bununla birlikte, büyük bir dezavantaj, doğrudan kasılma kuvvetini değil, bunun yerine büzülme ve gevşeme hızını ölçmesidir. Ek olarak, bir tek katman oluşturmak için hiPSC-CM'lerin sayısı farklı olduğunda hızlar değişir. Bu nedenle, 96 kuyucuklu plakaların her bir kuyucuğunda tam olarak 50.000 hücrenin tohumlanması çok önemlidir.

MEA tarafından ölçülen FPD, QT süresi boyunca bir vekil olarak kullanılmıştır ve bu nedenle ilaca bağlı QT uzamasının değerlendirilmesinde yaygın olarak kullanılmaktadır33. QT süresine benzer şekilde, FPD hıza bağlı olarak yenilir. Bu nedenle, FPD verilerini tam olarak yorumlamak için vuruş hızındaki düzeltme gereklidir. Bu protokolde, MEA ölçümünün kaplamadan en az 10 gün sonra yapılması önerilmektedir. Bununla birlikte, bazen alan potansiyel sinyalinin kaplamadan 10 gün sonra hala kararsız olması mümkündür. Bu durumda, hiPSC-CM kültürünü 2-3 gün daha uzatın.

Yama-kelepçe tekniği, hiPSC-CM'lerin elektrofizyolojisini ve iyon kanallarını analiz etmek için çok yönlü bir araçtır. Geleneksel yama kelepçesinin en büyük dezavantajı, yüksek verimli çalışmalarda uygulanmasını engelleyen düşük verim özelliğidir. Ek olarak, bu teknikte deneyim kazanmadan önce uzun bir öğrenme eğrisi ve kapsamlı bir uygulama gerektirir. Bununla birlikte, geleneksel yama-kelepçe tekniği, hiPSC-CM'lerin elektrofizyolojisini anlamak için hala altın standart olarak kabul edilmektedir. HiPSC-CM'lerin APD'sinin yüksek verim ile değerlendirilmesi gerekiyorsa, hızlandırılmış aksiyon potansiyeli 2 sensörü (ASAP2)21 kullanılarak hiPSC-CM aksiyon potansiyelinin optik görüntülenmesi ile başlanması da önerilir. Birincil hedefler elde edildikten sonra, daha doğru fenotipleme ve validasyon için daha ileri çalışmalarda geleneksel bir aksiyon potansiyeli kullanılabilir. Ek olarak, otomatik yama kelepçesi çeşitli alanlarda, özellikle kanalopatide giderek daha fazla kullanılmaktadır. Örneğin, hERG kanallarının ve voltaj kapılı sodyum kanallarının birden fazla varyantı tarafından taşınan iyon kanalı akımları, otomatik yama kelepçesi34,35,36,37 ile karakterize edilmiştir. Ayrıca, hiPSC-CM'lerde otomatik yama kelepçesinin kullanımı son zamanlarda38,39 olarak tespit edilmiştir. Otomatik yama kelepçesinin yürütülmesi için, okuyucular daha önce yayınlanmış protokollere başvurabilir40. Yüksek verim ve makine kullanımındaki basitliğin avantajları sayesinde, otomatik yama kelepçelerinin ilaç keşfi ve ilaç geliştirmede giderek daha önemli roller oynayacağına şüphe yoktur.

Oranmetrik Ca 2 + 'ya duyarlı bir boya olan Fura-2'nin kullanılması, hiPSC-CM'lerin diyastolik Ca2 + 'sının ölçülmesinin, boya yükleme süresi, düzensiz boya dağılımı ve foto-ağartma gibi deneysel önyargı faktörlerinden çok daha az etkilenmesini sağlar. Bu, belirli kalp hastalıklarının diyastolik disfonksiyonunu özetlemek için önemlidir. Ana sınırlama, konfokal mikroskopi ile uyumsuz olabilecek bir UV uyarma ışık kaynağı gerektirmesidir.

Özetle, ilaç geliştirmenin klinik öncesi aşamasında kardiyotoksisite değerlendirmesinde son zamanlarda kaydedilen ilerlemelere rağmen, kardiyotoksisite önde gelen güvenlik endişelerinden biri olmaya devam etmektedir. HiPSC-CM'lerin standart klinik öncesi güvenlik değerlendirme sürecine giderek daha fazla dahil edilmesi, aday bileşiklerin toksisite tahmininin doğruluğunu artırma potansiyeline sahiptir. Ek olarak, hastaya özgü hiPSC-CM'ler kişiselleştirilmiş kardiyak ilaç seçimi ve advers ilaç yanıtı tahmini sağlar. Burada açıklanan çeşitli fonksiyonel tahlilleri kullanan protokol, ilaç taraması ve hastalık modellemesinde hiPSC-CM'lerin uygulamalarının genişletilmesine yardımcı olacaktır.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

J.C.W., Greenstone Biosciences'ın kurucu ortaklarından biridir, ancak burada sunulan çalışma tamamen bağımsız olduğu için rakip çıkarları yoktur. Diğer yazarlar rakip çıkarlar olmadığını beyan ederler.

Acknowledgments

Blake Wu'ya el yazmasını düzelttiği için teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) R01 HL113006, R01 HL141371, R01 HL163680, R01 HL141851, U01FD005978 ve NASA NNX16A069A (JCW) ve AHA Doktora Sonrası Burs 872244 (GMP) tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35 mm glass bottom dish with 20 mm micro-well #1.5 cover glass Cellvis D35-20-1.5-N Patch clamp
50x B27 supplements Life Technologies 17504-044 hiPSC-CM culture medium
6-well culture plate E & K Scientific EK-27160 hiPSC-CM culture
96-well flat clear bottom black polystyrene TC-treated microplates Corning 3603 Contraction motion measurement
Accutase Sigma-Aldrich A6964 Enzymatic dissociation
Axion's Integrated Studio (AxIS) Axion Biosystems navigator software
Borosilicate glass capillaries Harvard Apparatus BF 100-50-10, Patch clamp
CaCl2 1 M in H2O Sigma-Aldrich 21115 Tyrode’s solution
Cell counting chamber slides ThermoFisher Scientific C10228 Cell counting
CytoView 48-well MEA plates Axion Biosystems M768-tMEA-48B MEA
DMEM/F12 Gibco/Life Technologies 12634028 Extracellular matrix medium
DPBS, no calcium, no magnesium Fisher Scientific 14-190-250
EGTA Sigma-Aldrich E3889 Intracellular pipette solution
EPC 10 USB patch clamp amplifier Warner Instruments 89-5000 Patch clamp
Fura-2, AM, cell permeant ThermoFisher Scientific F1221 Ca2+ transient measurement
Glucose Sigma-Aldrich G8270 Tyrode’s solution
HEPES Sigma-Aldrich H3375 Tyrode’s solution
hiPSCs Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank
KCl Sigma-Aldrich 529552 Tyrode’s solution
KnockOut Serum Replacement ThermoFisher Scientific 10828-028 hiPSC-CM seeding medium
KOH 8 M Sigma-Aldrich P4494 Intracellular pipette solution
Lambda DG 4 Sutter Instrument Company Ca2+ transient measurement; ultra-high-speed wavelength switching light source
Luna-FL automated fluorescence cell counter WISBIOMED LB-L20001 Cell counting
Maestro Pro MEA system Axion Biosystems MEA
Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix Corning 356231 Extracellular matrix medium
MgATP Sigma-Aldrich A9187 Intracellular pipette solution
MgCl2 Sigma-Aldrich M8266 Tyrode’s solution
NaCl Sigma-Aldrich S9888 Tyrode’s solution
NaOH 10 M Sigma-Aldrich 72068 Tyrode’s solution
NIS Elements AR
Pluronic F-127 (20% Solution in DMSO) ThermoFisher Scientific P3000MP Ca2+ transient measurement
RPMI 1640 medium Life Technologies 11875-119 hiPSC-CM culture medium
Sony SI8000 Cell Motion Imaging System Sony Biotechnology Contraction motion measurement
Sutter Micropipette puller Sutter Instruments P-97 Patch clamp
Trypan blue stain Life Technologies T10282 Cell counting

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wouters, O. J., McKee, M., Luyten, J. Estimated research and development investment needed to bring a new medicine to market, 2009-2018. Journal of the American Medical Association. 323 (9), 844-853 (2020).
  2. Pang, L., et al. Workshop report: FDA workshop on improving cardiotoxicity assessment with human-relevant platforms. Circulation Research. 125 (9), 855-867 (2019).
  3. Mamoshina, P., Rodriguez, B., Bueno-Orovio, A. Toward a broader view of mechanisms of drug cardiotoxicity. Cell Reports Medicine. 2 (3), 100216 (2021).
  4. Paik, D. T., Chandy, M., Wu, J. C. Patient and disease-specific induced pluripotent stem cells for discovery of personalized cardiovascular drugs and therapeutics. Pharmacological Reviews. 72 (1), 320-342 (2020).
  5. Kaese, S., Verheule, S. Cardiac electrophysiology in mice: a matter of size. Frontiers in Physiology. 3, 345 (2012).
  6. Clark, W. A., Chizzonite, R. A., Everett, A. W., Rabinowitz, M., Zak, R. Species correlations between cardiac isomyosins. A comparison of electrophoretic and immunological properties. Journal of Biological Chemistry. 257 (10), 5449-5454 (1982).
  7. Werfel, S., et al. Characterization of circular RNAs in human, mouse, and rat hearts. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 98, 103-107 (2016).
  8. Burridge, P. W., et al. Chemically defined generation of human cardiomyocytes. Nature Methods. 11 (8), 855-860 (2014).
  9. Sharma, A., et al. Derivation of highly purified cardiomyocytes from human induced pluripotent stem cells using small molecule-modulated differentiation and subsequent glucose starvation. Journal of Visualized Experiments. (97), e52628 (2015).
  10. Itzhaki, I., et al. Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells. Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).
  11. Lan, F., et al. Abnormal calcium handling properties underlie familial hypertrophic cardiomyopathy pathology in patient-specific induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 12 (1), 101-113 (2013).
  12. Wu, H., et al. Modelling diastolic dysfunction in induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes from hypertrophic cardiomyopathy patients. European Heart Journal. 40 (45), 3685-3695 (2019).
  13. Lee, J., et al. Activation of PDGF pathway links LMNA mutation to dilated cardiomyopathy. Nature. 572 (7769), 335-340 (2019).
  14. Sun, N., et al. Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy. Science Translational Medicine. 4 (130), (2012).
  15. Chen, S. N., et al. Activation of PDGFRA signaling contributes to filamin C-related arrhythmogenic cardiomyopathy. Science Advances. 8 (8), (2022).
  16. Sharma, A., et al. High-throughput screening of tyrosine kinase inhibitor cardiotoxicity with human induced pluripotent stem cells. Science Translational Medicine. 9 (377), (2017).
  17. Burridge, P. W., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes recapitulate the predilection of breast cancer patients to doxorubicin-induced cardiotoxicity. Nature Medicine. 22 (5), 547-556 (2016).
  18. Kitani, T., et al. Human-induced pluripotent stem cell model of trastuzumab-induced cardiac dysfunction in patients with breast cancer. Circulation. 139 (21), 2451-2465 (2019).
  19. Matsa, E., et al. Transcriptome profiling of patient-specific human iPSC-cardiomyocytes predicts individual drug safety and efficacy responses in vitro. Cell Stem Cell. 19 (3), 311-325 (2016).
  20. Stillitano, F., et al. Modeling susceptibility to drug-induced long QT with a panel of subject-specific induced pluripotent stem cells. Elife. 6, (2017).
  21. Zhang, J. Z., et al. Protocol to measure contraction, calcium, and action potential in human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. STAR Protocols. 2 (4), 100859 (2021).
  22. Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
  23. Greensmith, D. J. Ca analysis: an Excel based program for the analysis of intracellular calcium transients including multiple, simultaneous regression analysis. Computer Methods and Programs in Biomedicine. 113 (1), 241-250 (2014).
  24. Ma, N., et al. Determining the pathogenicity of a genomic variant of uncertain significance using CRISPR/Cas9 and human-induced pluripotent stem cells. Circulation. 138 (23), 2666-2681 (2018).
  25. Lam, C. K., et al. Identifying the transcriptome signatures of calcium channel blockers in human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 125 (2), 212-222 (2019).
  26. Seeger, T., et al. A premature termination codon mutation in MYBPC3 causes hypertrophic cardiomyopathy via chronic activation of nonsense-mediated decay. Circulation. 139 (6), 799-811 (2019).
  27. Zhang, J. Z., et al. Effects of cryopreservation on human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for assessing drug safety response profiles. Stem Cell Reports. 16 (1), 168-181 (2021).
  28. Yu, B., Zhao, S. R., Yan, C. D., Zhang, M., Wu, J. C. Deconvoluting the cells of the human heart with iPSC technology: cell types, protocols, and uses. Current Cardiology Reports. 24 (5), 487-496 (2022).
  29. Thomas, D., Cunningham, N. J., Shenoy, S., Wu, J. C. Human-induced pluripotent stem cells in cardiovascular research: current approaches in cardiac differentiation, maturation strategies, and scalable production. Cardiovascular Research. 118 (1), 20-36 (2022).
  30. Zhu, R., et al. Physical developmental cues for the maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Stem Cell Research & Therapy. 5 (5), 117 (2014).
  31. Feyen, D. A. M., et al. Metabolic maturation media improve physiological function of human iPSC-derived cardiomyocytes. Cell Reports. 32 (3), 107925 (2020).
  32. Gintant, G., et al. Use of human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes in preclinical cancer drug cardiotoxicity testing: a scientific statement from the American Heart Association. Circulation Research. 125 (10), 75-92 (2019).
  33. Kussauer, S., David, R., Lemcke, H. hiPSCs Derived cardiac cells for drug and toxicity screening and disease modeling: what micro- electrode-array analyses can tell us. Cells. 8 (11), (2019).
  34. Ng, C. A., et al. High-throughput phenotyping of heteromeric human ether-a-go-go-related gene potassium channel variants can discriminate pathogenic from rare benign variants. Heart Rhythm. 17 (3), 492-500 (2020).
  35. Obergrussberger, A., Friis, S., Bruggemann, A., Fertig, N. Automated patch clamp in drug discovery: major breakthroughs and innovation in the last decade. Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (1), 1-5 (2021).
  36. Kozek, K. A., et al. High-throughput discovery of trafficking-deficient variants in the cardiac potassium channel KV11.1. Heart Rhythm. 17 (12), 2180-2189 (2020).
  37. Heyne, H. O., et al. Predicting functional effects of missense variants in voltage-gated sodium and calcium channels. Science Translational Medicine. 12 (556), (2020).
  38. Li, W., et al. Establishment of an automated patch-clamp platform for electrophysiological and pharmacological evaluation of hiPSC-CMs. Stem Cell Research. 41, 101662 (2019).
  39. Li, W., Luo, X., Ulbricht, Y., Guan, K. Blebbistatin protects iPSC-CMs from hypercontraction and facilitates automated patch-clamp based electrophysiological study. Stem Cell Research. 56, 102565 (2021).
  40. Milligan, C. J., Möller, C. Ion Channels: Methods and Protocols. Gamper, N. , Humana Press. 171-187 (2013).

Tags

Tıp Sayı 186
İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Kardiyomiyositler Üzerindeki Mikroelektrot Dizisi ve Yama Kelepçesi Kayıtlarının Teknik Uygulamaları
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhao, S. R.,… More

Zhao, S. R., Mondéjar-Parreño, G., Li, D., Shen, M., Wu, J. C. Technical Applications of Microelectrode Array and Patch Clamp Recordings on Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes. J. Vis. Exp. (186), e64265, doi:10.3791/64265 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter