Summary
Her beskriver vi en protokoll for å isolere en tilstrekkelig mengde enkeltstående ikke-kardiomyocytter med høy levedyktighet fra et musehjerte etter hjerteinfarkt (MI). Dette kan brukes til påfølgende enkeltcellesekvensering, flowcytometrianalyse og primær cellekultur.
Abstract
Hjerteinfarkt (MI) er en av de vanligste hjerte- og karsykdommene, med økende dødelighet på verdensbasis. Ikke-kardiomyocytter står for mer enn halvparten av den totale hjertecellepopulasjonen, og de bidrar til adaptive kompensasjoner ved myokardskade, inkludert inflammatoriske responser, vevsreparasjon og arrdannelse. For å studere post-MI hjertets mikromiljø, er enkeltcelle RNA-sekvensering (scRNA-seq) mye brukt til å identifisere forskjellige hjertecelletyper og intercellulær kommunikasjon. Blant prosedyrene for scRNA-seq-prøvepreparering er fremstilling av cellesuspensjonen et av de mest kritiske trinnene, fordi cellens levedyktighet kan påvirke kvaliteten på scRNA-seq-resultatene. Derfor designet vi en eksperimentell protokoll for å forberede en ikke-kardiomyocyttcellesuspensjon fra post-MI musehjerter med ekstra fokus på å forbedre cellens levedyktighet ved å velge milde fordøyelsesenzymer, kontrollere fordøyelsestiden og bruke fluorescensaktivert cellesortering (FACS). Til slutt isolerte vi CD45+ celler fra ikke-kardiomyocyttcellesuspensjonen oppnådd gjennom denne protokollen, og deretter utførte vi scRNA-seq.
Introduction
Hjerteinfarkt (MI) er en av de vanligste hjerte- og karsykdommene, og dødeligheten øker over hele verden1. MI er forårsaket av utilstrekkelig blodtilførsel til det omkringliggende myokardiet, noe som kan være et resultat av en blokkering av kranspulsårene som oppstår med aterosklerotisk plakkruptur. Selv om perkutan koronar intervensjon (PCI) har redusert dødeligheten hos akutte MI-pasienter, er den høye forekomsten av hjertesvikt etter MI fortsatt et problem2. Den viktigste patofysiologien som ligger til grunn for post-MI hjertesvikt er kroppens kompenserende respons på hjerteskader, som innebærer å erstatte den døde hjertemuskelen med ikke-kontraktile fibrotiske arr. Disse adaptive responsene er i betydelig grad avhengige av lokal betennelse mediert av interaksjonene mellom flere celletyper og hjertevevsceller, og denne betennelsen anses nå som et potensielt terapeutisk mål for å redusere fibrotisk arrdannelse og dermed beskytte mot post-MI hjertesvikt 3,4. Interessant nok opplever mikromiljøet på infarktstedet en tidsavhengig overgang i de infiltrerende celletypene og funksjonene i ulike stadier av MI 1,5. Mange studier har vist at ikke-kardiomyocytter (f.eks. immunceller, fibroblaster og endotelceller) spiller sentrale roller i post-MI-betennelse og vevsreparasjon 5,6. I de senere år har enkeltcellesekvensering blitt mye brukt som et kraftig verktøy for å belyse involveringene og funksjonene til ikke-kardiomyocytter i post-MI mikroenviroment 7,8. Dette gir innsikt i patofysiologien ved post-MI skade og reparasjon og utvikling av potensielle terapier mot post-MI hjertesvikt.
High-throughput RNA sequencing (RNA-Seq) er en teknikk som brukes til å studere hele transkriptomer i detalj ved hjelp av neste generasjons sekvensering (NGS) 7,8,9. Nylig har utviklingen av scRNA-Seq revolusjonert det biomedisinske forskningsfeltet. Sammenlignet med konvensjonell bulksekvensering analyserer scRNA-Seq genuttrykksprofiler og transkripsjonell heterogenitet på encellenivå 7,8. Denne teknikken fremmer signifikant forskningen av den cellulære patofysiologien til MI 9,10 ved å identifisere forskjellige sirkulerende celletyper i post-MI mikromiljøet og avdekke samspillet mellom kardiomyocytter og ikke-kardiomyocytter. Disse funnene bidrar videre til å avdekke nye terapeutiske mål for post-MI hjertesvikt. Generelt inkluderer det scRNA-seq-baserte post-MI-eksperimentet tre hoveddeler: (1) etablering av post-MI dyremodell; (2) fremstilling av cellesuspensjonen; og (3) prøvesekvensering og dataanalyse. Spesielt er forberedelse av cellesuspensjonen det mest kritiske trinnet i utarbeidelsen av scRNA-Seq-eksperimentet fordi kvaliteten på cellesuspensjonen bestemmer nøyaktigheten av resultatene.
Denne protokollen er utformet for å ekstrahere en ikke-kardiomyocyttcellesuspensjon fra hjertevevet etter MI; Det er viktig at de spesifikke detaljene for å opprettholde cellens levedyktighet og oppløsning er inkludert. I mellomtiden kan utstyret som brukes i denne protokollen, for eksempel kirurgiske sett for mus, gnagerventilatorer og sentrifuger, finnes i de fleste dyreforsøkssentre og biomedisinske laboratorier, og dermed er eksperimentkostnaden for denne protokollen relativt lav. Videre, hvis man vurderer tidspunkter og infarktsteder som variabler, kan denne protokollen brukes til å simulere et bredt spekter av kliniske scenarier, spesielt for komplikasjonene etter MI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøkene ble utført i samsvar med retningslinjene for omsorg og bruk av forsøksdyr ved Zhejiang University og ble godkjent av Animal Advisory Committee ved Zhejiang University.
1. Venstre fremre synkende koronar ligering (LAD ligering) kirurgi
MERK: Åtte uker gamle mannlige C57BL/6J-mus ble brukt som modeller. Hjertene ble høstet 2 uker etter MI. Venstre fremre nedadstigende koronarkirurgi ble utført som tidligere beskrevet og demonstrert11.
- Desinfiser de kirurgiske instrumentene med 70% etanol før kirurgi.
- Vei musen, og bedøv deretter musen med intraperitoneale injeksjoner av 1% pentobarbitalnatrium (50 mg / kg). Vær oppmerksom på tåklemmerefleksen, og mål respirasjonsfrekvensen for å evaluere anestesidybden under prosedyren.
- Plasser musen på operasjonsbordet med en varmepute på 37 °C. Bruk oftalmisk salve for å forhindre øye dehydrering.
- Depilate venstre prekordial bryst og hals med hårfjerningskrem, og bruk bomullspinner for å fjerne hår. Desinfiser huden med iodofor, etterfulgt av 70% alkohol for å rengjøre området tre ganger.
- Utfør et midtlinje cervikal snitt (0,8-1,0 cm) under et mikroskop. Separer hud, muskler og vev rundt luftrøret, og sett deretter en 20 G kanyle inn i luftrøret.
MERK: Vær oppmerksom på at kanylen settes inn i luftrøret under mikroskopisk visning for å sikre at røret ikke settes inn i spiserøret. - Koble musen til en gnagerventilator satt til 0,2 ml tidalvolum med 150 slag per minutt.
- Snitt musebrystet skrått langs midtklavikulærlinjen med en steril saks. Dissekere det subkutane vevet for å avsløre ribbeina.
- Bruk steril saks til å kutte huden skrått langs venstre midtklavikulære linje (0,8-1,0 cm). Utfør venstre torakotomi for å skille den tredje og fjerde ribben for å eksponere hjertet. Bruk en ribbe retractor for en klar sikt.
- Åpne perikardiet med buede tang, og liger deretter venstre fremre synkende arterie (under venstre atriumvedheng) ved hjelp av en 7-0 silkesutur. En blek fremre vegg av venstre ventrikel indikerer at myokardial perfusjon er vellykket avbrutt.
- Slipp ribbe retractor, og sy thoracic snittet i lag med en 5-0 silke sutur mens du utviser luft fra brystet. Sy nakkesnittet med en 5-0 sutur silkesutur.
- Fjern luftrøret fra musen når den spontane pusten er gjenopprettet. Injiser intraperitonealt 0,5 ml forvarmet sterilt saltvann. Injiser buprenorfin (0,1 mg/kg) subkutant hver 12. time for å minimere smerte.
- Til slutt plasserer du musen på varmeputen for å vente på gjenopplivning. Overvåk musen for å sikre at den ikke lider av overdreven dyspné eller blødning via visuell observasjon.
- Sett musen tilbake i buret etter at den våkner. Den første uken må du overvåke musen daglig for å bekrefte at dens mobilitet, pelsstell og spisevaner er tilstrekkelige. I henhold til eksperimentets behov, høst hjertet på forskjellige tidspunkter etter MI.
MERK: I denne protokollen ble encellesuspensjonen fremstilt med hjertet 2 uker etter MI.
2. Fremstilling av hjerte-encelle-suspensjonen
- Klargjøring av løsningene og mediet
- Hjertevevsdissosiasjonsbuffer: Bland 10 mg kollagenase IV (600 E/ml), 5 mg dispase II (0,5 U/ml) og 50 μL DNase I (100 μg/ml) i 5 ml RPMI 1640. Forvarm dette mediet til 37 °C i et vannbad før bruk.
- Cellevaskebuffer: Tilbered 1 % BSA eller 10 % FBS i fosfatbufret saltvann (PBS, PH 7,4), og oppbevar ved 4 °C eller på is.
- Perfusjonsløsning: Forkjøl PBS (PH 7.4) som perfusjonsløsning.
- Røde blodlegemer (RBC) lysisbuffer: Bruk RBC-lysisbufferen som nevnt av produsenten.
MERK: Se materialfortegnelsen for listen over reagenser og utstyr som brukes i denne studien.
- Avlive musen med en intraperitoneal pentobarbitalnatriuminjeksjon (150 mg/kg).
- Hjerte disseksjon
- Plasser musen i liggende stilling ved å feste bakbenene på plass med tape.
- Spray kroppen med 70% etanol, og kutt deretter vertikalt gjennom bukhuden og musklene mens du unngår å stikke hull i leveren. Åpne brystkassen forsiktig mens du unngår å punktere hjertet.
- Bruk den forkjølte PBS (PH 7,4) til å perfusere venstre ventrikkel til den fargeløse perfusjonsvæsken er observert (ca. 15 ml PBS [pH 7,4] er nødvendig).
- Løft forsiktig hjertet fra thorax med tang, og klipp bort overflødig vev festet til utsiden av hjertet med oftalmisk saks. Plasser hjertet i 1 ml forkjølt PBS (PH 7,4) i et 1,5 ml mikrosentrifugerør.
- Enzymatisk dissosiasjon av hjertevevet
- Overfør musehjertet til en brønn på en 24-brønnsplate med 150 μL av hjertevevets dissosiasjonsbuffer plassert på is, og kutt den i små biter (~ 1 mm) med en saks.
- Overfør det hakkede hjertevevet til et 15 ml sentrifugerør med 5 ml av vevsdissosiasjonsbufferen.
MERK: Det anbefalte buffervolumet for hjertevevsdissosiasjon er 5 ml/hjerte. - Plasser sentrifugerøret i den elektrisk termostatiske stempelshakeren ved 125 o / min i 1 time ved 37 °C. Pipet vevssuspensjonen opp og ned 10 ganger hvert 20. minutt.
- Filtrer cellesuspensjonen gjennom en 70 μm cellesil for å fjerne ufordøyd vev og klumper. Tilsett 25 ml av cellevaskbufferen for å skylle det opprinnelige røret, og overfør det deretter for å skylle cellesilen. Deretter filtrerer du cellesuspensjonen gjennom en 40 μm cellesil for å fjerne celleklumper ytterligere.
- Sentrifuger den filtrerte cellesuspensjonen ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C. Kast supernatanten, og resuspender deretter celleprøven i 1x RBC lysisbuffer i 5 minutter ved romtemperatur (RT).
- Tilsett fire ganger mer volum av cellevaskebufferen, og sentrifuger ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Fjern supernatanten og resuspender cellene i 10 ml av cellevaskbufferen. Sentrifuge ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C.
- Fjern supernatanten og resuspender cellene i 1 ml av cellevaskbufferen.
- Bland 18 μL av cellesuspensjonen med 2 μL akridin oransje (AO) / propidiumjodid (PI) fargeløsning (9: 1), og tilsett 10 μL av blandingen til et lysbilde i tellekammeret. Evaluer cellenumrene og levedyktigheten ved hjelp av en automatisk celleteller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En encellesuspensjon med høy vitalitet ble oppnådd ved å implementere avsnitt 2 i denne protokollen. Imidlertid kunne cellefragmenter fortsatt observeres (figur 1A); Derfor ble fluorescensaktivert cellesortering (FACS) utført for å forbedre kvalitetenytterligere 16. Etter FACS reduseres gjennomsnittlig cellestørrelse fra 9,6 μm til 9,1 μm ( tabell 1), noe som antyder at andelen cellefragmenter effektivt kan reduseres i cellesuspensjonen ved FACS (figur 1B). Gatingstrategien som brukes for FACS er vist i figur 1C.
I tillegg til bildene i figur 1 ble cellekonsentrasjon, gjennomsnittlig cellestørrelse og cellelevedyktighet målt med en celleteller (tabell 1). Forskjellene i cellekonsentrasjoner skyldtes volumet av cellesuspensjonen. Merkbart reduserte den gjennomsnittlige cellestørrelsen etter FACS (tabell 1), noe som viser at FACS effektivt kan redusere celleklumping og fjerne cellefragmenter.
ScRNA-seq ble utført for å studere det hjerteimmunologiske mikromiljøet mens man verifiserte cellesuspensjonskvaliteten oppnådd gjennom denne protokollen. Etter å ha forberedt encellesuspensjonen, sorterte vi først cellene som uttrykte overflateprotein CD45, som er en vanlig markør for et bredt spekter av immunceller. Deretter utførte vi scRNA-seq på CD45+ -celler ved hjelp av 10X Genomics-plattformen17. På denne måten samlet vi 14 217 enkeltceller fra tre friske hjerteprøver til et sammenslått datasett etter kvalitetskontroll (tabell 2). Den ikke-overvåkede klyngingen og reduksjonen i t-distribuert stokastisk naboinnebygging (t-SNE) dimensjonalitet viste en åpenbar separasjon av syv typer immunceller (figur 2). Videre viste hver immuncelletype et høyt uttrykk av klassiske markører. Endelig viser disse resultatene at enkeltcellesuspensjonen fremstilt av denne protokollen har høy styrke for enkeltcellesekvensering.
Figur 1: Cellenes levedyktighet i hjertets encellede suspensjon. (A) Celle levedyktighet uten FACS. De svarte pilspissene indikerer cellefragmenter (ingen fluorescens). (B) Celle levedyktighet med FACS. Den gule pilen indikerer levende celler (grønn fluorescens), og den røde pilen indikerer døde celler (rød fluorescens). (C) Gating strategi. Skala bar: 50 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Encellet RNA-sekvensering av CD45+ -celler i hjertet fra tre museblodprøver. (A) tSNE-plott av CD45+ -celler som viser immuncellepopulasjonene identifisert basert på kanoniske markørgener. (B) Varmekart over de fem øverste differensielt uttrykte genene i hver underpopulasjon. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Før FACS | Etter FACS | |
| Total cellekonsentrasjon (celler/ml) | 1,51 x 106 | 3,40 x 105 |
| Levende cellekonsentrasjon (celler/ml) | 1,40 x 106 | 3,15 x 105 |
| Død cellekonsentrasjon (celler/ml) | 1,09 x 105 | 2,48 x 104 |
| Levedyktighet (%) | 92.8 | 92.7 |
| Gjennomsnittlig cellestørrelse (μm) | 9.6 | 9.1 |
Tabell 1: Hjerte-encelle-suspensjon før og etter FACS. Celletettheten til hjerte-encelle-suspensjonen oppnådd før og etter FACS sammenlignes ved hjelp av en automatisert celleteller.
| Estimater | |
| Estimert antall celler | 14,217 |
| Gjennomsnittsavlesninger per celle | 81,017 |
| Mediangener per celle | 1,374 |
| Totalt antall påviste gener | 18,424 |
| Median UMI-antall per celle | 4,021 |
| Gyldige strekkoder | 98.4% |
| Leser kartlagt til genom | 95.1% |
Tabell 2: Statistikk over kvalitetskontroll. Tabellen viser de forskjellige estimatene av encelledataene til friske musehjerter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne artikkelen hadde som mål å beskrive en protokoll for å isolere enkeltstående ikke-kardiomyocytter fra musehjerter post MI. Protokollen kan brukes til å isolere forskjellige typer celler i post-MI mikromiljøet med høy kvalitet, inkludert immunceller, endotelceller og fibroblaster. Tre viktige faktorer er avgjørende for å oppnå en cellesuspensjon av høy kvalitet for enkeltcellesekvensering. Den første er innstillingen av enzymatisk fordøyelse. Det er viktig å kontrollere tidspunktet for fordøyelsen og volumet og konsentrasjonen av fordøyelsesenzymer for å sikre både celle levedyktighet og isolasjonseffektivitet. I dette tilfellet økte vi konsentrasjonen av enzymet på riktig måte og forlenget fordøyelsestiden. Her anbefaler vi en fordøyelsesvarighet på 45 min til 1 time. En kortere varighet kan øke cellens levedyktighet, men kan føre til utilstrekkelig fordøyelse av hjertevev og kan øke mengden celleklumper. I tillegg brukte vi DNase I for å forhindre celleaggregering fordi lytiske celler kan frigjøre fritt DNA for å vikle de omkringliggende cellene for å danne celleklumper13. Den andre viktige faktoren er å bruke en cellevaskeløsning som inneholder BSA eller FBS. BSA eller FBS kan ikke bare beskytte aktiviteten til enzymene, men også forbedre cellens levedyktighet. Den siste essensielle faktoren er å legge til rette for FACS for å eliminere cellefragmenter og døde celler. Cellefragmenter kan resultere i en unøyaktig celletelling og levedyktighet. Disse faktorene sammen forbedrer levedyktigheten og renheten til cellesuspensjonen, noe som gjør den mer kompatibel med enkeltcellesekvensering.
Denne protokollen beskriver først cellesuspensjonspreparatet for enkeltcellesekvensering, og den inkluderer også tilleggsprosedyrer for å forbedre kvaliteten på cellesuspensjonen til en relativt lav kostnad. Sammenlignet med andre protokoller som brukes av tidligere studier, unngår vi å bruke fordøyelsesenzymer som kan forårsake aggregering av celler indusert av fritt DNA, for eksempel trypsin14. Fjerning av celleavfall er en av de største utfordringene for enkeltcellestudier, og noen studier bruker fjerningssett for døde celler for å forbedre cellens levedyktighet før du kjører prøvene14,15. Her foreslår vi imidlertid at du bruker FACS for å forbedre prøverenheten på grunn av den høye effektiviteten når det gjelder å redusere døde celler og rusk.
Encellesuspensjonen oppnådd ved denne protokollen kan analyseres videre ved strømningsanalyse eller primær cellekultur (standard aseptiske prosedyrer)18. Siden fordøyelsesenzymer er relativt milde, er det egnet til å fordøye hjertevev tatt i forskjellige stadier av MI, så vel som fra friske hjerter. Denne protokollen har imidlertid visse begrensninger. For eksempel fremmer langvarig fordøyelse ved 37 °C uunngåelig uttrykket av stressgener19,20. Denne begrensningen kan løses ved å bruke aktiv protease med lav temperatur eller redusere fordøyelsestiden etterfulgt av FACS. Denne protokollen inkluderer heller ikke isolering av kardiomyocytter, og er derfor ikke egnet for studier på lokale vevsresponser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer at de ikke har noen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Funds of Zhejiang-provinsen (LQ22H020010).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acridine Orange / Propidium Iodide Stain | Logos biosystems | F23001 | |
| Automated Cell Counter | Logos biosystems | L20001 | |
| Bovine Serum Albumin | Servicebio | G5001 | Cytoprotective effect |
| Cell Counting Slides | Logos biosystems | L12001 | |
| Collagenase Type IV | Gibco | 17104019 | Digestive enzymes |
| Dispase II | Sigma | D4693 | Digestive enzymes |
| Dnase I | Roche | 11284932001 | Prevent cell clumping |
| Falcon 40μm Cell Strainer | Falcon | 352340 | Remove cell clumps |
| Falcon 70μm Cell Strainer | Falcon | 352350 | Remove undigested tissue and clumps |
| Flow Cell Sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
| Iodophor | OU QING SI | 10054963976859 | |
| Needle Holder | FST | 12061-01 | |
| Ophthalmic Forceps | RWD | F14012-10 | |
| Ophthalmic Scissors | RWD | S11036-08 | |
| Phosphate Buffered Saline | Servicebio | G4202-500ML | |
| RBC Lysis Buffer | Beyotime | C3702-120ml | Remove red blood cells |
| Rib Retractor | FST | 17005-04 | |
| Rodent Ventilator | Harvard | 730043 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | Solvent solution of enzyme |
| Sterile Scissor | RWD | S14014-10 |
References
- Reed, G. W., Rossi, J. E., Cannon, C. P.
- Gu, J., et al. Incident heart failure in patients with coronary artery disease undergoing percutaneous coronary intervention. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 727727 (2021).
- Frangogiannis, N. G. The inflammatory response in myocardial injury, repair, and remodelling. Nature Reviews. Cardiology. 11 (5), 255-265 (2014).
- Kain, V., Prabhu, S. D., Halade, G. V. Inflammation revisited: Inflammation versus resolution of inflammation following myocardial infarction. Basic Research in Cardiology. 109 (6), 444 (2014).
- Tzahor, E., Dimmeler, S. A coalition to heal-the impact of the cardiac microenvironment. Science. 377 (6610), 4443 (2022).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
- Jaitin, D. A., et al. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science. 343 (6172), 776-779 (2014).
- Massaia, A., et al. Single cell gene expression to understand the dynamic architecture of the heart. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 167 (2018).
- Papalexi, E., Satija, R. Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity. Nature Reviews. Immunology. 18 (1), 35-45 (2018).
- Jin, K., et al. Single-cell RNA sequencing reveals the temporal diversity and dynamics of cardiac immunity after myocardial infarction. Small Methods. 6 (3), 2100752 (2022).
- Tombor, L. S., et al. Single cell sequencing reveals endothelial plasticity with transient mesenchymal activation after myocardial infarction. Nature Communications. 12 (1), 681 (2021).
- Virag, J. A., Lust, R. M. Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction. Journal of Visualized Experiments. (52), e2581 (2011).
- Reichard, A., Asosingh, K. Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry. Cytometry Part A. 95 (2), 219-226 (2018).
- Gladka, M. M., et al. Single-cell sequencing of the healthy and diseased heart reveals cytoskeleton-associated protein 4 as a new modulator of fibroblasts activation. Circulation. 138 (2), 166-180 (2018).
- Garcia-Flores, V., et al. Preparation of single-cell suspensions from the human placenta. Nature Protocols. , (2022).
- Guez-Barber, D., et al. FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain. Journal of Neuroscience Methods. 203 (1), 10-18 (2012).
- Rheinländera, A., Schravenab, B., Bommhardt, U. CD45 in human physiology and clinical medicine. Immunology Letters. 196, 22-32 (2018).
- Hua, X., et al. Single-cell RNA sequencing to dissect the immunological network of autoimmune myocarditis. Circulation. 142 (4), 384-400 (2020).
- Grindberg, R. V., et al.
- Vanden Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14, 935-936 (2017).
