Summary
Här beskriver vi ett protokoll för att isolera en tillräcklig mängd enstaka icke-kardiomyocyter med hög livskraft från ett mushjärta efter hjärtinfarkt (MI). Detta kan användas för efterföljande encellssekvensering, flödescytometrianalys och primär cellodling.
Abstract
Hjärtinfarkt (MI) är en av de vanligaste hjärt-kärlsjukdomarna, med ökande dödlighet över hela världen. Icke-kardiomyocyter står för mer än hälften av den totala hjärtcellspopulationen, och de bidrar till adaptiva kompensationer vid myokardskada, inklusive inflammatoriska svar, vävnadsreparation och ärrbildning. För att studera hjärtmikromiljön efter MI används encells-RNA-sekvensering (scRNA-seq) i stor utsträckning för att identifiera olika hjärtcellstyper och intercellulär kommunikation. Bland procedurerna för scRNA-seq-provberedning är beredning av cellsuspensionen ett av de mest kritiska stegen, eftersom cellviabiliteten kan påverka kvaliteten på scRNA-seq-resultaten. Därför utformade vi ett experimentellt protokoll för att förbereda en icke-kardiomyocytcellsuspension från post-MI-mushjärtan med extra fokus på att förbättra cellviabiliteten genom att välja milda matsmältningsenzymer, kontrollera matsmältningstiden och applicera fluorescensaktiverad cellsortering (FACS). Slutligen isolerade vi CD45 + -celler från den icke-kardiomyocytcellsuspensionen erhållen genom detta protokoll, och sedan utförde vi scRNA-seq.
Introduction
Hjärtinfarkt (MI) är en av de vanligaste hjärt-kärlsjukdomarna, och dess dödlighet ökar över hela världen1. MI orsakas av otillräcklig blodtillförsel till det omgivande myokardiet, vilket kan vara ett resultat av en kranskärlsblockering som uppstår vid aterosklerotisk plackbrott. Även om perkutan koronar intervention (PCI) har minskat dödligheten hos akuta MI-patienter, är den höga förekomsten av hjärtsvikt efter MI fortfarande ett problem2. Den viktigaste patofysiologin bakom hjärtsvikt efter hjärtinfarkt är kroppens kompensatoriska svar på hjärtskador, vilket innebär att den döda hjärtmuskeln ersätts med icke-kontraktila fibrotiska ärr. Dessa adaptiva svar är signifikant beroende av lokal inflammation medierad av interaktionerna mellan flera celltyper och hjärtvävnadsceller, och denna inflammation betraktas nu som ett potentiellt terapeutiskt mål för att minska fibrotisk ärrbildning och därmed skydda mot hjärtsvikt efter MI 3,4. Intressant nog upplever mikromiljön vid infarktstället en tidsberoende övergång i de infiltrerande celltyperna och funktionerna i olika stadier av MI 1,5. Många studier har visat att icke-kardiomyocyter (t.ex. immunceller, fibroblaster och endotelceller) spelar centrala roller vid inflammation efter MI och vävnadsreparation 5,6. Under de senaste åren har encellssekvensering använts i stor utsträckning som ett kraftfullt verktyg för att belysa involveringar och funktioner hos icke-kardiomyocyter i mikromiljönefter MI 7,8. Detta ger insikter i patofysiologin för post-MI skada och reparation och utvecklingen av potentiella terapier mot post-MI hjärtsvikt.
RNA-sekvensering med hög genomströmning (RNA-Seq) är en teknik som används för att studera hela transkriptom i detalj med hjälp av nästa generations sekvensering (NGS) 7,8,9. På senare tid har utvecklingen av scRNA-Seq revolutionerat det biomedicinska forskningsfältet. Jämfört med konventionell bulksekvensering analyserar scRNA-Seq genuttrycksprofiler och transkriptionell heterogenitet på encellsnivå 7,8. Denna teknik främjar signifikant forskningen av den cellulära patofysiologin för MI 9,10 genom att identifiera olika cirkulerande celltyper i mikromiljön efter MI och avslöja interaktionen mellan kardiomyocyter och icke-kardiomyocyter. Dessa fynd bidrar ytterligare till att avslöja nya terapeutiska mål för hjärtsvikt efter MI. I allmänhet innehåller det scRNA-seq-baserade post-MI-experimentet tre huvudavsnitt: (1) upprättandet av post-MI-djurmodell; 2) framställning av cellsuspensionen, och (3) provsekvensering och dataanalys. Märkbart är beredningen av cellsuspensionen det mest kritiska steget i beredningen av scRNA-Seq-experimentet eftersom kvaliteten på cellsuspensionen bestämmer resultatens noggrannhet.
Detta protokoll är utformat för att extrahera en icke-kardiomyocytcellsuspension från hjärtvävnaden efter MI; Signifikant ingår de specifika detaljerna för att upprätthålla cellviabilitet och upplösning. Under tiden kan utrustningen som används i detta protokoll, såsom kirurgiska kit för möss, gnagareventilatorer och centrifuger, hittas i de flesta djurförsökscentra och biomedicinska laboratorier, och därmed är experimentkostnaden för detta protokoll relativt låg. Dessutom, om man betraktar tidpunkter och platser för infarkt som variabler, kan detta protokoll tillämpas för att simulera ett brett spektrum av kliniska scenarier, särskilt för post-MI-komplikationer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla experiment utfördes i enlighet med riktlinjerna för vård och användning av laboratoriedjur vid Zhejiang University och godkändes av Animal Advisory Committee vid Zhejiang University.
1. Vänster främre fallande kranskärlsligering (LAD-ligering) kirurgi
OBS: Åtta veckor gamla manliga C57BL / 6J möss användes som modeller. Hjärtan skördades 2 veckor efter MI. Vänster främre fallande kranskärlsligeringskirurgi utfördes som tidigare beskrivits och visats11.
- Desinficera de kirurgiska instrumenten med 70% etanol före operationen.
- Väg musen och bedöva sedan musen med intraperitoneala injektioner av 1% pentobarbitalnatrium (50 mg/kg). Observera tå-klämreflexen och mät andningsfrekvensen för att utvärdera anestesidjupet under proceduren.
- Placera musen på operationsbordet med en värmedyna på 37 °C. Använd oftalmisk salva för att förhindra uttorkning av ögonen.
- Depilera dess vänstra precordial bröst och nacke med hårborttagningskräm och använd bomullspinnar för att ta bort hårstrån. Desinficera huden med jodofor, följt av 70% alkohol för att rengöra området tre gånger.
- Utför ett mittlinje cervikal snitt (0,8-1,0 cm) under ett mikroskop. Separera huden, musklerna och vävnaden som omger luftstrupen och sätt sedan in en 20 G kanyl i luftstrupen.
OBS: Observera när du sätter in kanylen i luftstrupen under mikroskopisk vy för att säkerställa att röret inte sätts in i matstrupen. - Anslut musen till en gnagarventilator inställd på 0,2 ml tidalvolym med 150 slag per minut.
- Skär musbröstet snett längs mittklavikulära linjen med en steril sax. Dissekera den subkutana vävnaden för att exponera revbenen.
- Använd steril sax för att skära huden snett längs den vänstra mittklavikulära linjen (0,8-1,0 cm). Utför vänster thorakotomi för att separera tredje och fjärde revbenen för att exponera hjärtat. Använd en rib retractor för en tydlig sikt.
- Öppna perikardiet med böjda pincett och ligera sedan den vänstra främre nedåtgående artären (under vänster atriumbilaga) med en 7-0 silkesutur. En blek främre vägg i vänster kammare indikerar att myokardperfusionen framgångsrikt avbryts.
- Släpp revbensupprullaren och sy bröstkorgssnittet i lager med en 5-0 silkesutur medan du utvisar luft från bröstet. Sy halssnittet med en 5-0 sutursilkesutur.
- Ta bort trakealtuben från musen när dess spontana andning har återställts. Injicera intraperitonealt 0,5 ml förvärmd steril saltlösning. Injicera buprenorfin (0,1 mg/kg) var 12:e timme subkutant för att minimera smärta.
- Slutligen placera musen på värmedynan för att vänta på återupplivning. Övervaka musen för att säkerställa att den inte lider av överdriven dyspné eller blödning via visuell observation.
- Sätt tillbaka musen i buret när den vaknar. Under den första veckan ska du övervaka musen dagligen för att kontrollera att dess rörlighet, skötsel och matvanor är tillräckliga. Enligt experimentets behov, skörda hjärtat vid olika tidpunkter efter MI.
OBS: I detta protokoll bereddes encellssuspensionen med hjärtat 2 veckor efter MI.
2. Beredning av hjärtcellssuspensionen
- Beredning av lösningar och media
- Hjärtvävnadsdissociationsbuffert: Blanda 10 mg kollagenas IV (600 U / ml), 5 mg dispase II (0,5 U / ml) och 50 μL DNas I (100 μg / ml) i 5 ml RPMI 1640. Förvärm mediet till 37 °C i vattenbad före användning.
- Celltvättbuffert: Förbered 1% BSA eller 10% FBS i fosfatbuffrad saltlösning (PBS, PH 7.4) och håll vid 4 ° C eller på is.
- Perfusionslösning: Förkyld PBS (PH 7.4) som perfusionslösning.
- Lysbuffert för röda blodkroppar (RBC): Använd RBC-lysbufferten som nämns av tillverkaren.
OBS: Se materialtabellen för listan över reagenser och utrustning som används i denna studie.
- Avliva musen genom en intraperitoneal pentobarbital natriuminjektion (150 mg/kg).
- Hjärtdissektion
- Placera musen i ryggläge genom att fästa bakbenen på plats med tejp.
- Spraya kroppen med 70% etanol och skär sedan vertikalt genom bukhuden och musklerna samtidigt som du undviker att genomborra levern. Öppna försiktigt bröstkorgen samtidigt som du undviker att punktera hjärtat.
- Använd den förkylda PBS (PH 7.4) för att perfusera vänster kammare tills den färglösa perfusionsvätskan observeras (cirka 15 ml PBS [pH 7,4] behövs).
- Lyft försiktigt hjärtat från bröstkorgen med pincett och skär bort överflödig vävnad fäst på utsidan av hjärtat med oftalmisk sax. Placera hjärtat i 1 ml förkyld PBS (PH 7,4) i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Enzymatisk dissociation av hjärtvävnaden
- Överför mushjärtat till en brunn på en 24-brunnsplatta med 150 μL av hjärtvävnadsdissociationsbufferten placerad på is och skär den i små bitar (~ 1 mm) med en sax.
- Överför den malet hjärtvävnaden till ett 15 ml centrifugrör med 5 ml vävnadsdissociationsbuffert.
OBS: Den rekommenderade buffertvolymen för hjärtvävnadsdissociation är 5 ml / hjärta. - Placera centrifugröret i den elektriskt termostatiska fram- och återgående skakapparaten vid 125 rpm i 1 h vid 37 °C. Pipettera vävnadssuspensionen upp och ner 10 gånger var 20:e minut.
- Filtrera cellsuspensionen genom en 70 μm cellsil för att avlägsna osmält vävnad och klumpar. Tillsätt 25 ml av celltvättbufferten för att skölja originalröret och överför det sedan för att skölja cellsilen. Filtrera sedan cellsuspensionen genom en 40 μm cellsil för att ytterligare avlägsna cellklumpar.
- Centrifugera den filtrerade cellsuspensionen vid 300 x g i 5 min vid 4 °C. Kassera supernatanten och suspendera sedan cellprovet igen i 1x RBC-lysbuffert i 5 minuter vid rumstemperatur (RT).
- Tillsätt fyra gånger mer volym av celltvättbufferten och centrifugera vid 300 x g i 5 minuter vid 4 °C.
- Ta bort supernatanten och suspendera cellerna igen i 10 ml av celltvättbufferten. Centrifugera vid 300 x g i 5 min vid 4 °C.
- Ta bort supernatanten och suspendera cellerna igen i 1 ml av celltvättbufferten.
- Blanda 18 μl av cellsuspensionen med 2 μl färgningslösning av akridinapelsin (AO)/propidiumjodid (PI) (9:1) och tillsätt 10 μl av blandningen till ett utstryksglas i räknekammaren. Utvärdera cellnummer och livskraft med hjälp av en automatisk cellräknare.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En encellssuspension med hög vitalitet erhölls genom implementering av avsnitt 2 i detta protokoll. Cellfragment kunde dock fortfarande observeras (figur 1A); därför utfördes fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) för att ytterligare förbättra kvaliteten16. Efter FACS minskar den genomsnittliga cellstorleken från 9,6 μm till 9,1 μm ( tabell 1), vilket tyder på att andelen cellfragment effektivt kan reduceras i cellsuspensionen med FACS (figur 1B). Den grindstrategi som används för FACS visas i figur 1C.
Förutom bilderna i figur 1 mättes cellkoncentrationen, den genomsnittliga cellstorleken och cellviabiliteten med en cellräknare (tabell 1). Skillnaderna i cellkoncentrationer berodde på cellsuspensionens volym. Märkbart minskade den genomsnittliga cellstorleken efter FACS (tabell 1), vilket visar att FACS effektivt kan minska cellklumpar och ta bort cellfragment.
ScRNA-seq utfördes för att studera den hjärtimmunologiska mikromiljön samtidigt som cellsuspensionskvaliteten erhölls genom detta protokoll. Efter att ha förberett encellssuspensionen sorterade vi först cellerna som uttryckte ytproteinet CD45, vilket är en vanlig markör för ett brett spektrum av immunceller. Därefter utförde vi scRNA-seq på CD45 + -celler med 10X Genomics-plattformen17. På detta sätt samlade vi 14 217 enskilda celler från tre friska hjärtprover i en sammanslagen datamängd efter kvalitetskontroll (tabell 2). Den oövervakade klustringen och minskningen av t-distribuerad stokastisk granninbäddning (t-SNE) dimensionalitet visade en uppenbar separation av sju typer av immunceller (figur 2). Dessutom visade varje immuncellstyp ett högt uttryck av klassiska markörer. Sammanfattningsvis visar dessa resultat att encellssuspensionen framställd av detta protokoll har en hög potens för encellssekvensering.
Figur 1: Cellviabilitet i hjärtsuspensionen med en cell. (A) Cellviabilitet utan FACS. De svarta pilspetsarna indikerar cellfragment (ingen fluorescens). (B) Cellviabilitet med FACS. Den gula pilen indikerar levande celler (grön fluorescens) och den röda pilen indikerar döda celler (röd fluorescens). (C) Grindstrategi. Skalstapel: 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Encells-RNA-sekvensering av hjärt-CD45 + -celler från tre mushjärtprover. (A) tSNE-diagram över CD45+ celler som visar immuncellpopulationerna identifierade baserat på kanoniska markörgener. (B) Värmekarta över de fem främsta differentiellt uttryckta generna i varje subpopulation. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Före FACS | Efter FACS | |
| Total cellkoncentration (celler/ml) | 1,51 x 106 | 3,40 x 105 |
| Levande cellkoncentration (celler/ml) | 1,40 x 106 | 3,15 x 105 |
| Död cellkoncentration (celler/ml) | 1,09 x 105 | 2,48 x 104 |
| Lönsamhet (%) | 92.8 | 92.7 |
| Genomsnittlig cellstorlek (μm) | 9.6 | 9.1 |
Tabell 1: Hjärt encellssuspension före och efter FACS. Celldensiteterna hos hjärtcellssuspensionen erhållen före och efter FACS jämförs med hjälp av en automatiserad cellräknare.
| Uppskattningar | |
| Uppskattat antal celler | 14,217 |
| Genomsnittliga läsningar per cell | 81,017 |
| Mediangener per cell | 1,374 |
| Totalt antal upptäckta gener | 18,424 |
| Median UMI räknas per cell | 4,021 |
| Giltiga streckkoder | 98.4% |
| Läser mappade till genom | 95.1% |
Tabell 2: Statistik för kvalitetskontroll. Tabellen listar de olika uppskattningarna av encellsdata för friska mushjärtan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denna artikel syftade till att beskriva ett protokoll för att isolera enstaka icke-kardiomyocyter från mushjärtan efter MI. Protokollet kan tillämpas för att isolera olika typer av celler i post-MI-mikromiljön med hög kvalitet, inklusive immunceller, endotelceller och fibroblaster. Tre viktiga faktorer är avgörande för att erhålla en högkvalitativ cellsuspension för encellssekvensering. Den första är inställningen av enzymatisk matsmältning. Det är viktigt att kontrollera tiden för matsmältningen och volymen och koncentrationen av matsmältningsenzymerna för att säkerställa både cellviabilitet och isoleringseffektivitet. I det här fallet ökade vi på lämpligt sätt koncentrationen av enzymet och förlängde matsmältningstiden. Här rekommenderar vi en matsmältningstid på 45 min till 1 h. En kortare varaktighet kan öka cellviabiliteten men kan leda till otillräcklig hjärtvävnadssmältning och kan öka mängden cellklumpar. Dessutom använde vi DNas I för att förhindra cellaggregering eftersom lytiska celler kan frigöra fritt DNA för att linda de omgivande cellerna för att bilda cellklumpar13. Den andra väsentliga faktorn är att använda en celltvättlösning som innehåller BSA eller FBS. BSA eller FBS kan inte bara skydda enzymernas aktivitet utan också förbättra cellernas livskraft. Den sista väsentliga faktorn är att underlätta FACS för att eliminera cellfragment och döda celler. Cellfragment kan resultera i ett felaktigt cellantal och livskraft. Dessa faktorer tillsammans förbättrar livskraften och renheten hos cellsuspensionen, vilket gör den mer kompatibel med encellssekvensering.
Detta protokoll beskriver först cellsuspensionspreparatet för encellssekvensering, och det innehåller också ytterligare procedurer för att förbättra kvaliteten på cellsuspensionen till en relativt låg kostnad. I jämförelse med andra protokoll som använts av tidigare studier undviker vi att använda matsmältningsenzymer som kan orsaka aggregering av celler inducerade av fritt DNA, såsom trypsin14. Avlägsnandet av cellskräp är en av de största utmaningarna för encellsstudier, och vissa studier använder kit för borttagning av döda celler för att förbättra cellviabiliteten innan proverna körs14,15. Men här föreslår vi att du använder FACS för att förbättra provets renhet på grund av dess höga effektivitet för att minska döda celler och skräp.
Den encellssuspension som erhålls genom detta protokoll kan analyseras ytterligare genom flödesanalys eller primär cellodling (aseptiska standardprocedurer)18. Eftersom matsmältningsenzymerna är relativt milda är det lämpligt att smälta hjärtvävnad som tas i olika stadier av MI, liksom från friska hjärtan. Detta protokoll har dock vissa begränsningar. Till exempel främjar långvarig matsmältning vid 37 °C oundvikligen uttrycket av stressgener19,20. Denna begränsning kan lösas genom att använda aktivt proteas vid låg temperatur eller minska matsmältningstiden följt av FACS. Dessutom inkluderar detta protokoll inte isolering av kardiomyocyter, och därför är det inte lämpligt för studier av lokala vävnadssvar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av Zhejiangprovinsens naturvetenskapliga fonder (LQ22H020010).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acridine Orange / Propidium Iodide Stain | Logos biosystems | F23001 | |
| Automated Cell Counter | Logos biosystems | L20001 | |
| Bovine Serum Albumin | Servicebio | G5001 | Cytoprotective effect |
| Cell Counting Slides | Logos biosystems | L12001 | |
| Collagenase Type IV | Gibco | 17104019 | Digestive enzymes |
| Dispase II | Sigma | D4693 | Digestive enzymes |
| Dnase I | Roche | 11284932001 | Prevent cell clumping |
| Falcon 40μm Cell Strainer | Falcon | 352340 | Remove cell clumps |
| Falcon 70μm Cell Strainer | Falcon | 352350 | Remove undigested tissue and clumps |
| Flow Cell Sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
| Iodophor | OU QING SI | 10054963976859 | |
| Needle Holder | FST | 12061-01 | |
| Ophthalmic Forceps | RWD | F14012-10 | |
| Ophthalmic Scissors | RWD | S11036-08 | |
| Phosphate Buffered Saline | Servicebio | G4202-500ML | |
| RBC Lysis Buffer | Beyotime | C3702-120ml | Remove red blood cells |
| Rib Retractor | FST | 17005-04 | |
| Rodent Ventilator | Harvard | 730043 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | Solvent solution of enzyme |
| Sterile Scissor | RWD | S14014-10 |
References
- Reed, G. W., Rossi, J. E., Cannon, C. P.
- Gu, J., et al. Incident heart failure in patients with coronary artery disease undergoing percutaneous coronary intervention. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 727727 (2021).
- Frangogiannis, N. G. The inflammatory response in myocardial injury, repair, and remodelling. Nature Reviews. Cardiology. 11 (5), 255-265 (2014).
- Kain, V., Prabhu, S. D., Halade, G. V. Inflammation revisited: Inflammation versus resolution of inflammation following myocardial infarction. Basic Research in Cardiology. 109 (6), 444 (2014).
- Tzahor, E., Dimmeler, S. A coalition to heal-the impact of the cardiac microenvironment. Science. 377 (6610), 4443 (2022).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
- Jaitin, D. A., et al. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science. 343 (6172), 776-779 (2014).
- Massaia, A., et al. Single cell gene expression to understand the dynamic architecture of the heart. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 167 (2018).
- Papalexi, E., Satija, R. Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity. Nature Reviews. Immunology. 18 (1), 35-45 (2018).
- Jin, K., et al. Single-cell RNA sequencing reveals the temporal diversity and dynamics of cardiac immunity after myocardial infarction. Small Methods. 6 (3), 2100752 (2022).
- Tombor, L. S., et al. Single cell sequencing reveals endothelial plasticity with transient mesenchymal activation after myocardial infarction. Nature Communications. 12 (1), 681 (2021).
- Virag, J. A., Lust, R. M. Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction. Journal of Visualized Experiments. (52), e2581 (2011).
- Reichard, A., Asosingh, K. Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry. Cytometry Part A. 95 (2), 219-226 (2018).
- Gladka, M. M., et al. Single-cell sequencing of the healthy and diseased heart reveals cytoskeleton-associated protein 4 as a new modulator of fibroblasts activation. Circulation. 138 (2), 166-180 (2018).
- Garcia-Flores, V., et al. Preparation of single-cell suspensions from the human placenta. Nature Protocols. , (2022).
- Guez-Barber, D., et al. FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain. Journal of Neuroscience Methods. 203 (1), 10-18 (2012).
- Rheinländera, A., Schravenab, B., Bommhardt, U. CD45 in human physiology and clinical medicine. Immunology Letters. 196, 22-32 (2018).
- Hua, X., et al. Single-cell RNA sequencing to dissect the immunological network of autoimmune myocarditis. Circulation. 142 (4), 384-400 (2020).
- Grindberg, R. V., et al.
- Vanden Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14, 935-936 (2017).
