Construcción de péptidos cíclicos penetrantes de células para mejorar la penetración de barreras biológicas

Resumen

Este protocolo describe la síntesis de péptidos cíclicos penetrantes de células con enlaces cruzados aromáticos y la evaluación de su permeabilidad a través de barreras biológicas.

Resumen

El cáncer ha sido un gran desafío en la salud mundial. Sin embargo, el complejo microambiente tumoral generalmente limita el acceso de la terapéutica a las células tumorales más profundas, lo que lleva a la recurrencia del tumor. Para conquistar la penetración limitada de las barreras biológicas, se han descubierto péptidos de penetración celular (CPP) con excelente capacidad de translocación de membrana y han surgido como transportadores moleculares útiles para entregar diversas cargas a las células. Sin embargo, las CPP lineales convencionales generalmente muestran una estabilidad proteolítica comprometida, lo que limita su permeabilidad a través de las barreras biológicas. Por lo tanto, el desarrollo de nuevos transportadores moleculares que puedan penetrar las barreras biológicas y exhibir una mayor estabilidad proteolítica es muy deseado para promover la eficiencia de la administración de fármacos en aplicaciones biomédicas. Hemos sintetizado previamente un panel de CPP cíclicos cortos con enlaces cruzados aromáticos, que exhibieron una permeabilidad superior en células y tejidos cancerosos en comparación con sus contrapartes lineales. Aquí, se describe un protocolo conciso para la síntesis del péptido cíclico de poliarginina R8 marcado con fluorescencia y su contraparte lineal, así como los pasos clave para investigar su permeabilidad celular.

Introducción

Las últimas décadas han sido testigos de rápidos avances en el desarrollo de péptidos de penetración celular (CPP) para la administración de fármacos. Los CPP se han utilizado ampliamente como transportadores moleculares para el tratamiento de una variedad de enfermedades potencialmente mortales, incluidos los trastornos neurológicos^1,2, las enfermedades cardíacas³, la diabetes⁴, la dermatosis⁵ y el cáncer ^6,7. El cáncer sigue siendo una carga sanitaria mundial acompañada de una al....

Protocolo

1. Preparación del equipo

NOTA: Realice todos los procedimientos en una campana extractora de humos de funcionamiento con el equipo de protección personal adecuado.

1. Montar el aparato manual de síntesis de péptidos en la campana extractora (Figura 1). Coloque las llaves de paso de tres vías (consulte la Tabla de materiales) en el colector de vacío (consulte la Tabla de materiales) y conéctelas al nitrógeno (N₂). Asegúrese de tapar las entradas no utilizadas.
2. Coloque una columna de polipropileno de 10 ml (consulte la Tabla d....

Resultados

En este protocolo, se presentó un procedimiento sintético para restringir la poliarginina lineal R8 en su forma cíclica. El SPPS se realizó manualmente utilizando un aparato simple (Figura 1). El proceso sintético detallado de SPPS se muestra en la Figura 2. Brevemente, la resina estaba suficientemente hinchada, seguida de la desprotección del grupo protector de N α-Mmoc. Luego, el aminoácido protegido con N α-Fmoc se ancló.......

Discusión

La estabilización química de péptidos mediante la incorporación de restricciones conformacionales ha demostrado ser una estrategia eficaz para mejorar la estabilidad y permeabilidad celular del péptido²⁶. En este protocolo, se describe un procedimiento paso a paso para la síntesis de CPP cíclicos con enlaces cruzados aromáticos y la evaluación de su permeabilidad a través de barreras biológicas. En comparación con los enlaces cruzados hidrofílicos lactámicos o triazoles^22,27

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1,2-etanedithiol	Aladdin K1722093		hedor
2-(7-Azobenzotriazol)-N,N,N',N'-tetrametiluronio hexafluorofosfato (HATU)	HEOWNS	A-0443697
4,4'-bis(bromometil)bifenil	TCI	B1921
4T1	células ATCC		Las células 4T1 se cultivaron en medio DMEM suplementado con 10% de FBS (Hyclone) en un tanque de 37 ° Incubadora humidificada C que contiene 5% de CO2.
Acetonitrilo	Adamas	1484971	toxicidad
Diclorometano	Energía	W330229	la piel dañino
Éter dietílico	Aldrich		673811 inflamable
Sulfóxido de dimetilo	Beyotime	ST038	dañino para la piel
Dulbecco' s Medio de águila modificado (DMEM)	Gibco
Espectrómetro de masas de ionización por electrospray	Waters	G2-S Tof
FITC)	Energía	E0801812500
Microscopio fluorescente	Carl Zeiss	Axio Observer 7
Fmoc-Arg(Pbf)-OH	HEOWNS	F-81070
Fmoc-Cys(Trt)-OH	GL Biochem	GLS201115-35202
Fmoc-β Las células HeLa de Ala-OH	Adamas	51341C
	ATCC		se cultivaron en DMEM suplementadas con un 10% de FBS (Hyclone) en un 37 ° Incubadora humidificada C que contiene 5% de CO2.
Cromatografía líquida de alta resolución	Agilent Agilent	1260
Cromatografía líquida de alta resolución columna	Agilent	Poroshell EC-C18 120, 4,6 × 150 mm (tamaño de poro 120 Å, tamaño de partícula 4 μ m)
Liofilizador	SP Scientific	Vir Tis
Metanol	Aldrich	9758	toxicidad Placa
microtitulación	Thermo μ placa de caída	N12391
Morpholine	HEOWNS	M99040	irritante
Lector de microplacas multitecnología	Thermo	VARIOSKAN LUX
N,N-Diisopropiletilamina	HEOWNS	E-81416
irritante N,N-dimetil formamida	Energía	B020051	perjudicial para la piel
Columna Poly-Prep	Bio-Rad	7321010	columnas de cromatografía de polipropileno
Resina Rink Amide MBHA (0,572 mmol/g)	GL Biochem	GLS180301-49101
Llaves de paso de tres vías	Bio-Rad	7328107
Inserto de placa para cultivo de tejidos	LABSELECT	14211
Ácido trifluoroacético	HEOWNS	T63278	corrosivo
Triisopropilsilano	HEOWNS	T-0284475
Tripsina	BioFroxx	1004
Colector de vacío	Promega	A7231

Ácido tetraacético de etileno diamina (EDTA)BioFroxx 1340 Suero fetal bovino (FBS)HyClone Citómetro de flujo Beckman Coulter CytoFLEX Isómero de isotiocianato de fluoresceína ( de