Aislamiento fecal murino y trasplante de microbiota

Los trastornos cardiometabólicos, incluidas las cardiopatías y los accidentes cerebrovasculares, son las principales causas mundiales de muerte¹. La inactividad física, la mala nutrición, la edad avanzada y la genética modulan la fisiopatología de estos trastornos. La evidencia acumulada respalda el concepto de que la microbiota intestinal afecta a los trastornos cardiovasculares y metabólicos, incluida^{la diabetes tipo} 2, la obesidad³ y la hipertensión⁴, que pueden ser clave para el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos para estas enfermedades.

Los mecanismos exactos por los cuales la microbiota causa enfermedades aún se desconocen, y los estudios actuales son muy variables, en parte debido a diferencias metodológicas. El trasplante de microbiota fecal (TMF) es un enfoque valioso para delinear un papel directo de la microbiota total o de las especies aisladas en la fisiopatología de la enfermedad. El TMF es ampliamente utilizado en estudios con animales para inducir o suprimir un fenotipo. Por ejemplo, la ingesta calórica y el metabolismo de la glucosa pueden ser modulados mediante la transferencia de materia fecal de un donante enfermo a un receptor sano ^5,6. En humanos, el TMF ha demostrado ser una opción de tratamiento segura para pacientes con infección recurrente por Clostridium difficile ⁷. Está surgiendo evidencia que apoya su uso en el tratamiento de las enfermedades cardiovasculares; por ejemplo, el TMF de pacientes con síndrome metabólico a delgado mejora la sensibilidad a la insulina⁸. La disbiosis intestinal también se asocia con presión arterial alta en estudios en humanos y roedores 9,10,11. El TMF de ratones alimentados con una dieta alta en sal en ratones libres de gérmenes predispone a los receptores a la inflamación y la hipertensión¹².

A pesar de la alta tasa de éxito del FMT en roedores, persisten los desafíos traslacionales. Los ensayos clínicos que utilizan FMT para tratar la obesidad y el síndrome metabólico indican efectos mínimos o nulos sobre estos trastornos^13,14,15. Por lo tanto, se necesitan más estudios para identificar vías terapéuticas adicionales dirigidas a la microbiota intestinal para el tratamiento de trastornos cardiometabólicos. La mayor parte de la evidencia disponible sobre la microbiota intestinal y las enfermedades cardiovasculares es asociativa. El protocolo descrito discute cómo utilizar una combinación de FMT y la técnica de laminación suiza para mostrar una asociación entre la enfermedad y la microbiota intestinal y evaluar directamente la integridad de todas las partes del intestino^{intestinal 16,17,18}.

El objetivo general de este método es proporcionar orientación para estudiar los efectos del microbioma intestinal en la enfermedad cardiovascular experimental. Este protocolo proporciona más detalles y consideraciones clave en el diseño experimental para promover la traducción fisiológica y aumentar el rigor y la reproducibilidad de los hallazgos.

El Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Vanderbilt aprobó todos los procedimientos descritos en este manuscrito. Los ratones machos C57B1/6 a los 3 meses de edad, comprados en el Laboratorio Jackson, fueron alojados y cuidados de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.

1. Recolección, almacenamiento y procesamiento de muestras fecales humanas

1. Recoja una muestra de heces, utilizando un recipiente estéril si el sujeto está en la clínica. Refrigerar las muestras de heces a 4 °C dentro de las 36 h siguientes a la recolección hasta que estén listas para el procesamiento. Alternativamente, recoja muestras de heces utilizando una herramienta disponible comercialmente para una estabilidad fácil y extendida del ADN a temperatura ambiente, especialmente para uso en el hogar.
2. Desinfecte una campana extractora de humos de nivel de bioseguridad con una solución de lejía al 10% u otro desinfectante aprobado por la Agencia de Protección Ambiental.
3. Retire las heces del almacenamiento en frío y llévelas a la campana extractora; use una espátula desechable para hacer alícuotas de ~ 1 g y guárdelas en un congelador a -80 ° C hasta que esté completamente listo para el procesamiento.
4. Deseche todos los artículos desechables en la basura de riesgo biológico. Desinfecte todas las superficies (capucha y cualquier superficie que toque el procesador) y los elementos que se retiren de la cubierta.

2. Recogida aséptica de muestras fecales de ratón

NOTA: Utilice técnicas asépticas, incluyendo instrumentos esterilizados.

1. Eutanasia al ratón por asfixia de_CO2 . Rocíe el pecho y los lados del ratón con etanol al 70% y abra cuidadosamente la piel y la cavidad peritoneal para exponer el tracto gastrointestinal.
2. Aísle el ciego y use tijeras quirúrgicas estériles para cortarlo por la mitad. Brevemente, exponer el ciego y cortar 0,5 cm proximalmente desde el íleon y 0,5 cm distalmente en su unión con el colon. Transfiera el ciego aislado a una placa de Petri estéril.
3. Utilice una espátula estéril para transferir el contenido de cecal a tubos estériles y almacene las alícuotas en un congelador a -80 °C¹⁹.
   NOTA: Dado que la mayoría de las bacterias en el intestino son anaerobias, la exposición al oxígeno puede dañar o matar a los organismos durante el procedimiento de aislamiento en una atmósfera de habitación. Por lo tanto, las muestras fecales deben aislarse en cámaras anaeróbicas para mantener la viabilidad de las bacterias.

3. Trasplante de materia fecal

1. Resuspender los gránulos fecales frescos o previamente congelados en solución salina estéril en una proporción de 1:20 (p:v) y vórtice hasta homogeneizar.
2. Pase el homogeneizado a través de un filtro de nylon de poro de 30 μm para eliminar las partículas grandes. Centrifugar a 79 × g durante 5 min y recoger el sobrenadante para su uso en el trasplante.
3. Sonda oral 100 μL de la suspensión por ratón receptor libre de gérmenes durante 3 días consecutivos, seguida de sonda sonda cada 3 días durante 2 semanas. Utilizar ratones convencionales para estudiar los mecanismos de la microbiota intestinal si han sido tratados primero con antibióticos para eliminar la propia microbiota endémica del receptor. Por ejemplo, administrar ceftriaxona (400 mg / kg) diariamente a los ratones receptores durante 5 días consecutivos por sonda oral antes de la mezcla fecal.
   NOTA: Los estudios sugieren que un mínimo de 2 semanas de este tratamiento es necesario para provocar cambios cardiovasculares, incluyendo la presión arterial²⁰.
4. Asegúrese de que los ratones receptores libres de gérmenes estén alojados en aisladores de película gnotobiótica y alimentados con alimentos y agua estériles.

4. Mediciones de la presión arterial sistólica

NOTA: Los ratones gnotobióticos que recibieron FMT de ratones C57Bl/6 de 3 meses de edad alojados convencionalmente fueron implantados con minibombas osmóticas (Alzet, modelo 2002) para infusión de dosis bajas de angiotensina II (140 ng/kg/min) durante 2 semanas. La presión arterial se controló semanalmente a través del manguito de la cola. El protocolo para implantar minibombas osmóticas ha sido previamente descrito²¹. El manguito de la cola se realizó como se resume brevemente a continuación. Un método no invasivo para medir la presión arterial, como el manguito de la cola, es adecuado para estudios de FMT en ratones gnotobióticos. Los pasos detallados sobre cómo realizar el manguito de cola se han descrito anteriormente²².

1. Brevemente, recupere los ratones de los aisladores gnotobióticos y precaliente la plataforma de la máquina del manguito de la cola y el soporte del ratón.
2. Coloque a los ratones conscientes en restricciones en la plataforma calentada y recoja al menos tres rondas de mediciones de presión sistólica utilizando una pletismografía del manguito de la cola. Realice los siguientes pasos a continuación en 3 días consecutivos antes de los días de medición adecuados, para entrenar a los ratones a ser restringidos con el fin de reducir el estrés.
   1. Coloque suavemente el ratón en el soporte precalentado y deje la cola afuera. Pegue cuidadosamente la parte superior sin pellizcarla, para no estresar el mouse.
   2. Deje que el ratón descanse en el soporte; Colocar en la plataforma durante 3-5 min cubierto por una sábana para aclimatar.
3. Promedie las mediciones de todas las rondas para una presión sistólica promedio para cada animal.

5. Evaluación del TMF a los cambios cardiovasculares

1. Después de la medición de la presión arterial, sacrificar a los ratones y recoger asépticamente el contenido de cecal, como se describe en la sección 2.
2. Recolectar los intestinos y otros tejidos, incluidos el corazón, la aorta, el hígado, las arterias mesentéricas y los riñones, para examinar el papel de la microbiota intestinal en la salud cardiometabólica. Para cosechar tejidos, localice el tejido en el ratón y use tijeras para extirparlos.
3. Realizar un análisis de secuenciación metagenómica en muestras fecales / contenido cecal recolectado de los ratones donantes y receptores para confirmar el injerto de la microbiota intestinal después del FMT²³. La primera prueba de la colonización exitosa de la microbiota es confirmar que la microbiota del donante y la del receptor son similares.
4. Utilizar la técnica Swiss-roll (ver sección 6) en el tejido intestinal recolectado, junto con inmunotinción e histología para examinar los cambios morfológicos y de expresión celular²⁴.

6. Hacer rollos suizos de intestino intestinal

1. Día 1
   1. En un ratón correctamente sacrificado rociado con etanol al 70%, diseccione el intestino del ratón desde el lado anal (fijado en retroperitoneo) hasta el lado del estómago. Coloque la totalidad del tracto gastrointestinal aislado en una placa de Petri que contenga solución salina tamponada con fosfato (PBS). Sostenga suavemente el extremo proximal desde el extremo del estómago y retire la grasa circundante y el tejido conectivo con la mano.
   2. Aísle el intestino delgado (cefalada del apéndice) y haga un zigzag tipo Z con cada longitud. Luego, cortar para obtener el duodeno, el yeyuno y el íleon sucesivamente, como se describió anteriormente²⁵. Aísle el colon cortando la sección del intestino debajo del ciego.
   3. Cortar el duodeno, el yeyuno, el íleon y el colon.
   4. Enjuague y lave el intestino por dentro usando PBS con una jeringa y una aguja con la punta de una bola, para no desgarrar el intestino.
   5. Ponga la tripa en papel de filtro. Etiquete el papel con el nombre de la sección (por ejemplo, duodeno) y luego 'P' en la esquina superior derecha para proximal o 'D' para distal en la esquina inferior derecha.
   6. Corte la tripa longitudinalmente con tijeras de punta de bola. Abra la tripa en el papel de filtro. Lave con más PBS según sea necesario.
   7. Intercala la tripa entre dos papeles de filtro. Grape los papeles de filtro en cuatro puntos/esquinas cerca del intestino.
   8. Remojar en solución tampón neutra de formalina al 10% (4,0 g de fosfato de sodio, monobásico, 6,5 g de fosfato de sodio, dibásico, 100 ml de formaldehído al 37%, 900 ml de agua destilada). Agite con un balancín de plataforma a 5 rpm a temperatura ambiente durante la noche.
2. Día 2
   1. Prepare agarosa al 2% en agua destilada y caliente con una barra de agitación en un vaso de precipitados cubierto con papel de aluminio.
   2. Recuperar los tejidos; Tire el papel de filtro superior. Haga rodar la tripa desde el lado proximal para que el lado proximal entre primero, y rodar hacia adentro para que la luz también esté dentro en el portaobjetos. Pin con una aguja de 30 G o dos, según sea necesario.
   3. Aspire 1 ml de agarosa usando pipetas de transferencia graduadas desechables y vierta la agarosa en una sección intestinal enrollada sobre una superficie plana evitando burbujas de aire en los tejidos.
   4. Deje que la agarosa se enfríe y se solidifique. Use una cuchilla de afeitar para recortar la agarosa extra alrededor de la sección de tejido.
   5. Coloque las secciones intestinales en casetes de procesamiento / incrustación de tejidos (más grandes que los regulares para acomodar el aumento de altura debido a la agarosa). Remojar en etanol al 70% a 4 °C.
   6. Prepare portaobjetos de tejido incrustados en parafina y proceda a la inmunotinción, como se describe a continuación.

7. Inmunotinción del tracto intestinal intestinal

1. Desparafinización
   1. Pase por los siguientes baños con toboganes en un estante: xileno durante 3 min, xileno fresco nuevamente durante 3 min, xileno con 100% etanol (1: 1) durante 3 min, 95% etanol durante 3 min, 70% etanol durante 3 min y 50% etanol durante 3 min.
   2. Enjuague suavemente con agua corriente fría del grifo. Almacenar en un baño de agua del grifo.
2. Recuperación de antígenos
   1. Después de la desparafinización, hervir los portaobjetos en una rejilla en un baño de tampón de recuperación de antígenos (0.01M citrato trisódico dihidratado a pH 6 y 0.05% Tween-20) a 100 °C durante 20 min.
   2. Corra bajo agua fría del grifo.
3. Tinción
   1. Retire los portaobjetos del baño y coloque el pañuelo boca arriba en una caja portaobjetos con toallitas húmedas de laboratorio / toallas de papel en la parte inferior. Dibuje un contorno alrededor del tejido con un rotulador hidrofóbico.
   2. Deje caer solución salina tamponada con Tris (TBS) + 0.025% Triton X-100 sobre el tejido e incubar durante 5 min. Repita este paso.
   3. Bloquear con TBS + 10% de suero fetal bovino (FBS) + 1% de albúmina sérica bovina (BSA) durante 2 h a temperatura ambiente. Gire los portaobjetos de lado y retire el tampón de bloqueo de una toallita de laboratorio.
   4. Añadir solución de anticuerpos primarios e incubar a 4 °C durante al menos 2 h o durante la noche. Lavar suavemente con TBS + 0.025% Triton X-100 pipeteando suavemente ~200 μL sobre la sección.
   5. Añadir solución de anticuerpos secundarios e incubar durante 1 h a temperatura ambiente. Enjuagar las diapositivas 3 x 5 min con TBS enjuagando con una pipeta, como en el paso 7.3.4.
   6. Montaje con medio de montaje y un cubreobjetos.

Los pasos descritos anteriormente se resumen en la figura 1. El contenido cecal de ratón o las heces humanas se resuspenden en solución salina estéril para preparar una suspensión para dar a ratones libres de gérmenes (100 μL) por sonda nasogástrica, primero durante 3 días consecutivos, luego una vez cada 3 días. Al final del protocolo, la presión arterial se mide mediante el método del manguito de cola, los ratones son sacrificados y los tejidos se cosechan para la evaluación de los cambios en la microbiota intestinal y los cambios cardiovasculares y metabólicos.

Un paso clave en la elección de la microbiota es garantizar que el fenotipo de interés de la enfermedad esté presente en el donante y se asocie con cambios disbióticos. Por ejemplo, una dieta alta en sal está fuertemente relacionada con la disbiosis y la disfunción cardiovascular. Este estudio utilizó un donante de ratón que fue alimentado con una dieta de NaCl al 8%. Los cambios en la microbiota intestinal en respuesta al alto contenido de sal incluyeron una disminución de la biodiversidad bacteriana (Figura 2A), que se agrupó por separado de la microbiota de sal normal (Figura 2B). La relación Firmicutes/Bacteroidetes también aumentó (Figura 2C), lo que sugiere altos cambios en la microbiota inducida por la sal (modificada de Ferguson et al.12).

Para determinar el papel de la disbiosis inducida por sal alta en la predisposición a la hipertensión, se realizó FMT de ratones alimentados con alta sal a ratones libres de gérmenes y se evaluaron las respuestas de la presión arterial a una dosis baja de angiotensina II (Ang II). En este estudio se utilizaron ratones machos C57BL/6 a los 3 meses de edad. A los ratones receptores se les implantaron minibombas osmóticas para administrar una dosis baja continua de Ang II (140 ng / kg /) durante 2 semanas en ratones. Los ratones que recibieron FMT de donantes alimentados con alto contenido de sal mostraron un aumento significativo en la presión arterial con el tratamiento con Ang II en comparación con los receptores normales de microbiota salina (Figura 3). Este hallazgo indica que el TMF preparó a los ratones receptores para desarrollar hipertensión12. Los detalles sobre el protocolo del manguito de la cola en roedores se han reportado previamente12,26.

La microbiota intestinal disbiótica contribuye a la enfermedad en parte debido a una pared intestinal inflamada y permeable. Por lo tanto, el examen de la pared intestinal mediante inmunohistoquímica se puede utilizar para interrogar los cambios en áreas intestinales específicas en cualquier estado de enfermedad, incluso más allá del TMF. La Figura 4 demuestra que podemos realizar inmunohistoquímica en el íleon utilizando una técnica de rollo suizo y varios marcadores de tinción, como hematoxilina y eosina (H&E), tricrómico de Masson, y marcadores de células inmunes como anti-CD3 y anti-CD68., como se describió anteriormente 12, y apolipoproteína AI (AI), que se había acumulado en el íleon de ratones proteinúricos (Figura 4).

Figura 1: Diagrama que resume el diseño del protocolo. Las muestras fecales recolectadas de un sujeto humano o ratón convencional se utilizan para el trasplante en ratones libres de gérmenes. Abreviaturas: FMT = trasplante de microbiota fecal; PA = presión arterial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Los ratones con una dieta alta en sal exhiben disbiosis de microbiota intestinal. (A) Estimación de la biodiversidad de especies en contenido cecal obtenido de ratones con dietas normales de sal (negra) y alta en sal (roja). (B) La escala multidimensional no métrica muestra que las bacterias de la sal normal y los ratones con dieta alta en sal forman grupos separados. (C) El alto contenido de sal se asocia con un aumento de la proporción Firmicutes/Bacteroidetes. (***p < 0.0001, usando pruebas t de Student no pareadas de dos colas). Esta figura está adaptada de Ferguson et al.12. Abreviaturas: NMDS = escala multidimensional no métrica; NS = sal normal; HS = alto contenido de sal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: El TMF de ratones alimentados con alto contenido de sal predispone a ratones libres de gérmenes a la hipertensión inducida por angiotensina II. La transferencia de microbiota intestinal disbiótica inducida por alta sal se asoció con un aumento significativo de la presión sistólica en ratones libres de gérmenes en comparación con los ratones que recibieron microbiota intestinal de sal normal. Esta figura está adaptada de Ferguson et al.12. Abreviaturas: FMT = trasplante de microbiota fecal; PA = presión arterial; Ang II = angiotensina II; NS = sal normal; HS = alto contenido de sal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Imagen inmunohistoquímica que ilustra cómo evaluar los cambios en los marcadores de enfermedad en el intestino. Imágenes representativas que muestran la tinción de apolipoproteína AI en ilea obtenida de ratones que tenían hiperlipidemia sin proteinuria (A) o con (B). Ampliación: 5x a una escala de 200 μm (A, B, izquierda); 10x a una escala de 100 μm (A, B, derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores no declaran ningún conflicto de intereses, financieros o de otro tipo.