El objetivo aquí es delinear un protocolo para investigar los mecanismos de la disbiosis en la enfermedad cardiovascular. Este documento discute cómo recolectar y trasplantar asépticamente muestras fecales murinas, aislar intestinos y usar el método "Swiss-roll", seguido de técnicas de inmunotinción para interrogar los cambios en el tracto gastrointestinal.
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Artículo de método
Aislamiento fecal murino y trasplante de microbiota
En este artículo
Resumen
Resumen
La disbiosis de la microbiota intestinal desempeña un papel en la fisiopatología de los trastornos cardiovasculares y metabólicos, pero los mecanismos no se comprenden bien. El trasplante de microbiota fecal (TMF) es un enfoque valioso para delinear un papel directo de la microbiota total o de las especies aisladas en la fisiopatología de la enfermedad. Es una opción de tratamiento segura para pacientes con infección recurrente por Clostridium difficile . Los estudios preclínicos demuestran que la manipulación de la microbiota intestinal es una herramienta útil para estudiar el vínculo mecanicista entre la disbiosis y la enfermedad. El trasplante de microbiota fecal puede ayudar a dilucidar nuevas terapias dirigidas a la microbiota intestinal para el tratamiento y la enfermedad cardiometabólica. A pesar de una alta tasa de éxito en roedores, sigue habiendo cambios de traslación asociados con el trasplante. El objetivo aquí es proporcionar orientación en el estudio de los efectos del microbioma intestinal en la enfermedad cardiovascular experimental. En este estudio, se describe un protocolo detallado para la recolección, manipulación, procesamiento y trasplante de microbiota fecal en estudios murinos. Los pasos de recolección y procesamiento se describen tanto para donantes humanos como para roedores. Por último, describimos el uso de una combinación de las técnicas suizas de laminación e inmunotinción para evaluar la morfología específica del intestino y los cambios en la integridad de las enfermedades cardiovasculares y los mecanismos relacionados con la microbiota intestinal.
Introducción
Los trastornos cardiometabólicos, incluidas las cardiopatías y los accidentes cerebrovasculares, son las principales causas mundiales de muerte1. La inactividad física, la mala nutrición, la edad avanzada y la genética modulan la fisiopatología de estos trastornos. La evidencia acumulada respalda el concepto de que la microbiota intestinal afecta a los trastornos cardiovasculares y metabólicos, incluidala diabetes tipo 2, la obesidad3 y la hipertensión4, que pueden ser clave para el desarrollo de nuevos enfoques terapéuticos para estas enfermedades.
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Protocolo
El Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Vanderbilt aprobó todos los procedimientos descritos en este manuscrito. Los ratones machos C57B1/6 a los 3 meses de edad, comprados en el Laboratorio Jackson, fueron alojados y cuidados de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.
1. Recolección, almacenamiento y procesamiento de muestras fecales humanas
- Recoja una muestra de heces, utilizando un recipiente estéril si el sujeto está en la clínica. Refrigerar las muestras de heces a 4 °C dentro de las 36 h siguientes a la recolección hasta que estén listas para el....
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Resultados
Los pasos descritos anteriormente se resumen en la figura 1. El contenido cecal de ratón o las heces humanas se resuspenden en solución salina estéril para preparar una suspensión para dar a ratones libres de gérmenes (100 μL) por sonda nasogástrica, primero durante 3 días consecutivos, luego una vez cada 3 días. Al final del protocolo, la presión arterial se mide mediante el método del manguito de cola, los ratones son sacrificados y los tejidos se cosechan para la evaluación de los cambios.......
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Discusión
Un enfoque valioso para estudiar el papel causal de la microbiota intestinal en las enfermedades cardiovasculares y metabólicas es transferir la microbiota total o seleccionar especies de interés en ratones libres de gérmenes. Aquí, describimos protocolos para recolectar muestras fecales de humanos y ratones alojados convencionalmente en ratones libres de gérmenes para estudiar el papel de la microbiota intestinal en los trastornos hipertensivos.
En ratones, utilizamos contenidos cecales recol.......
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Divulgaciones
Los autores no declaran ningún conflicto de intereses, financieros o de otro tipo.
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado por Vanderbilt Clinical and Translational Science Award Grant UL1TR002243 (a A.K.) del Centro Nacional para el Avance de las Ciencias Traslacionales; Subvención POST903428 de la American Heart Association (a J.A.I.); y las subvenciones K01HL13049, R03HL155041, R01449 del Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre (a A.K.) y la subvención de los NIH 1P01HL116263 (a V.K.). La Figura 1 fue creada usando Biorender.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Alexa Fluor 488 Tyamide SuperBoost | ThermoFisher | B40932 | |
| Cámara anaeróbica | COY | 7150220 | |
| Apolipoproteína AI | Novus Biologicals | NBP2-52979 | |
| Tijeras de arteria - punta de bola | Fine Science Tools | 14086-09 | |
| Solución de lejía | Fisher Scientific | 14-412-53 | |
| Albúmina sérica bovina | Fisher Scientific | B14 | |
| CD3 anticuerpo | ThermoFisher | 14-0032-82 | |
| Anticuerpo monoclonal CD68 | ThermoFisher | 14-0681-82 | |
| Centrífuga | Fisher Scientific | 75-004-221 | |
| Monitor de alto rendimiento CODA | Kent Scientic Corporation | CODA-HT8 | |
| Viales criogénicos | Fisher Scientific | 10-500-26 | |
| Pipetas de transferencia graduadas desechables | Fisher Scientific | 137119AM | |
| Jeringas desechables | Fisher Scientific | 14-823-2A | |
| Etanol | Fisher Scientific | AA33361M1 | |
| Aguja de alimentación | Fine Science Tools | 18061-38 | |
| Hoja de papel de filtro | Fisher Scientific | 09-802 | |
| Formalina (10%) | Fisher Scientific | 23-730-581 | |
| Dieta alta en sal | Teklad | TD.03142 | |
| OMNIgene.GUT | DNAgenotek | OM-200+ACP102 | |
| Minibombas osmóticas | Alzet | MODELO 2002 | |
| Bolígrafo PAP | Millipore Sigma | Z377821-1EA | |
| Placa de Petri | Fisher Scientific | AS4050 | |
| Puntas de pipeta | Fisher Scientific | 21-236-18C | |
| Pipetas | Fisher Scientific | 14-388-100 | |
| Serile Solución salina tamponada con fosfato | Fisher Scientific | AAJ61196AP | |
| Espátula inteligente | Fisher Scientific | NC0133733 | |
| Dispositivo de recogida de heces | Fisher Scientific | 50-203-7255 | |
| TBS Buffer | Fisher Scientific | R017R.0000 | |
| Triton X-100 | Millipore Sigma | 9036-19-5 | |
| Balancín de plataforma Varimix | Fisher Scientific | 09047113Q | |
| Mezclador de vórtice | Fisher Scientific | 02-215-41 | |
| Xileno | Fisher Scientific | 1330-20-7, 100-41-4 |
Referencias
- Virani, S. S., et al. Heart disease and stroke statistics-2021 update: a report From the American Heart Association. Circulation. 143 (8), 254(2021).
- Wu, H., et al. The gut microbiota in prediabetes and diabetes:....
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Reimpresiones y permisos
