Este protocolo describe el proceso de diferenciación de células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC) en células similares a la microglía para la experimentación in vitro . También incluimos un procedimiento detallado para generar sinaptosomas humanos a partir de neuronas motoras inferiores derivadas de iPSC que se pueden usar como sustrato para ensayos de fagocitosis in vitro utilizando sistemas de imágenes de células vivas.
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Artículo de método
Human Microglia-like Cells: Differentiation from Induced Pluripotent Stem Cells and In Vitro Live-cell Phagocytosis Assay using Human Synaptosomes
En este artículo
Resumen
Resumen
La microglía son las células inmunes residentes de origen mieloide que mantienen la homeostasis en el microambiente cerebral y se han convertido en un jugador clave en múltiples enfermedades neurológicas. El estudio de la microglía humana en la salud y la enfermedad representa un desafío debido al suministro extremadamente limitado de células humanas. Las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) derivadas de individuos humanos pueden usarse para eludir esta barrera. Aquí, se demuestra cómo diferenciar las iPSC humanas en células similares a la microglía (iMG) para la experimentación in vitro . Estos iMG exhiben las propiedades esperadas y fisiológicas de la microglía, incluida la morfología similar a la microglía, la expresión de marcadores adecuados y la fagocitosis activa. Además, se proporciona documentación para aislar y etiquetar sustratos sinaptosómicos derivados de neuronas motoras inferiores derivadas de iPSC humanas (i3LMN). Se utiliza un ensayo de imagen longitudinal de células vivas para monitorear la absorción de sinaptosomas humanos marcados con un tinte sensible al pH, lo que permite investigaciones de la capacidad fagocítica de iMG. Los protocolos descritos en este documento son ampliamente aplicables a diferentes campos que investigan la biología de la microglía humana y la contribución de la microglía a la enfermedad.
Introducción
La microglía son las células inmunes residentes en el sistema nervioso central (SNC) y desempeñan un papel crucial en el desarrollo del SNC. La microglía también es importante en el cerebro adulto para mantener la homeostasis y responder activamente a los procesos de trauma y enfermedad. La evidencia acumulada muestra que la microglía es un contribuyente clave para la patogénesis de múltiples enfermedades neurodegenerativas y del desarrollo neurológico 1,2. Aunque el conocimiento actual sobre la biología microglial se ha derivado predominantemente de modelos de ratón, estudios recientes han dilucidado diferenc....
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Protocolo
NOTA: Todos los reactivos utilizados en este protocolo deben ser estériles, y todos los pasos deben realizarse en un gabinete de bioseguridad en condiciones estériles. Todas las líneas iPSC, así como los medios de mantenimiento y diferenciación, se describen en la Tabla de materiales. El método de diferenciación de microglía ilustrado a continuación se basa en protocolos previamente publicados 7,8,12 con nuevas modificaciones descritas en este documento.
1. Diferenciación de la microglía
N....
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Resultados
Para generar iMGs utilizando este protocolo, es importante comenzar con iPSCs indiferenciadas que muestren morfología de colonia compacta con bordes bien definidos (Figura 2A). Las iPSC disociadas mantenidas como se describe en la sección de formación de EB formarán agregados esféricos, denominados EB, que crecerán en tamaño hasta el día 4 de diferenciación (Figura 2B). Una vez que los EB se recogen y chapan en las condiciones apropiadas para la generación de PM.......
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Discusión
El protocolo de diferenciación descrito aquí proporciona un método eficiente para obtener células similares a la microglía derivadas de iPSC en ~ 6-8 semanas con alta pureza y en un rendimiento suficiente para realizar experimentos de inmunofluorescencia y otros ensayos que requieren un mayor número de células. Este protocolo ha producido hasta 1 × 106 iMGs en 1 semana, lo que permite la extracción de proteínas y ARN y los correspondientes análisis posteriores (por ejemplo, RNASeq, qRT-PCR, western blot, espec.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Agradecimientos
Los autores agradecen a Michael Ward por proporcionar la línea WTC11 hNIL iPSC para la diferenciación de neuronas motoras y a Jackson Laboratories por suministrar la línea KOLF2.1J WT clon B03 iPSC utilizada para la diferenciación de microglía. También agradecemos a Dorothy Schafer por su apoyo durante la implementación de los protocolos, a Anthony Giampetruzzi y John Landers por su ayuda con el sistema de imágenes de células vivas, así como a Hayden Gadd por sus contribuciones técnicas durante las revisiones y a Jonathan Jung por su colaboración en este estudio. Este trabajo fue apoyado por el Fondo Dan y Diane Riccio para la Neurociencia de la Escuela de Medicina UM....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| para el análisis de inmunofluorescenciaanti-IBA1 fuerte anticuerpo > | |||
| conejo | Wako Chemical USA | NC9288364 | dilución 1:350 |
| anticuerpo anti-P2RY12 para conejos | Sigma-Aldrich HPA014518 | dilución 1:50 | |
| anticuerpo anti-TMEM119 conejo | Sigma-Aldrich | HPA051870 | dilución |
| 1:100 para el análisis de Western blot | |||
| anti-β-Tubulina anticuerpo de conejo | Abcam | ab6046 | Dilución 1:500 |
| anti-Sinaptofisina (SYP) anticuerpo de conejo | Abclonal | A6344 | Dilución 1:1.000 |
| anticuerpo anti-PSD95 para ratones | Millipore | MAB1596 | 1:500 |
| tampón < >borato fuerte componentes | |||
| Ácido bórico (100 mM) | Sigma | B6768 | |
| Bicarbonato de sodio (NaHCO3) BioXtra | Sigma-Aldrich | S6297-250G | |
| Cloruro de sodio (75 mM) | Sigma | S7653 | |
| Tetraborato de sodio (25 mM) | Sigma | 221732 | |
| Materiales de cultivo celular | |||
| placas de 6 pocillos | Greiner Bio-One | 657160 | |
| 40 μ m Filtros de celdas | Falcon | 352340 | |
| 100 mm x 20 mm Cultivo de Tejidos Tratado, CELLTREAT | 229620 | ||
| Elevador de Células, Doble Extremo, Hoja Plana & Cuchilla estrecha, estéril | CELLTREAT | 229305 | |
| de baja adherencia Placa de 96 pocillos de fondo redondo | Corning | 7007 | |
| Primaria 24 pocillos de superficie de fondo plano Placa de cultivo celular modificada | de múltiples pocillos Corning | 353847,Primaria | |
| 6-pocillos Cell Clear Flat Plate Placa de cultivo multipocillo modificada en superficie | Corning | 353846 | |
| Primaria 96-pocillos Clear Flat Microplaca inferior | Corning | 353872 | |
| disociación celular | |||
| Accutase | Reactivos de | 25058CI | utilizados para la diferenciación de neuronas motoras inferiores |
| Reactivo TrypLE | Life Technologies | 12-605-010 | reactivos de disociación utilizados para la diferenciación de microglía |
| UltraPure 0,5 M EDTA, pH 8,0 | Invitrogen | 15575020 | |
| Reactivos de recubrimiento para cultivo celular | |||
| Matrigel GFR Matriz de membranas Corning | ™ | 354230 | Referido a reactivo de recubrimiento de matriz extracelular |
| CellAdhere Laminin-521 | STEMCELL Technology | 77004 | Referido a laminina 521 |
| Poly-D-Lisine | Sigma | P7405 | Reconstituir a 0,1 mg/mL en tampón de borato |
| Poly-L-Ornithine | Sigma | P3655 | Reconstituir a 1 mg/mL en tampón de borato |
| Componentes de medios iPSC | |||
| Kit mTeSR Plus Tecnología | STEMCELL | 100-0276 | Para preparar medios iPSC mezclado los componentes a 1x |
| Components of EB media | |||
| BMP-4 | Fisher Scientific PHC9534 | concentración final 50 ng/mL | |
| iPSC media | concentración final 1x | ||
| Inhibidor de ROCK Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | concentración final 10 µ M |
| SCF | PeproTech | 300-07 | concentración final 20 ng/mL |
| VEGF | PeproTech | 100-20A | concentración final 50 ng/mL |
| Componentes de medios base PMP | |||
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | concentración final 1x |
| Penicilina-Estreptomicina (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | concentración final 100 U/mL |
| X-VIVO 15 | Lonza | 12001-988 | concentración final 1x |
| Componentes de medios completos PMP | |||
| 55 mM 2-mercaptoetanol | Gibco | 21985023 | concentración final 55 µ M |
| IL-3 | PeproTech | 200-03 | concentración final 25 ng/mL |
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | concentración final 100 ng/mL |
| PMP medios base | final 1x | ||
| Componentes de medios base iMG | |||
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634010 | concentración final 1x |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | concentración final 1x |
| suplemento de N2, 100x | Gibco | 17502-048 | concentración final 1x |
| Penicilina-estreptomicina (10.000 U/mL) | Gibco | 15140122 | concentración final 100 U/mL |
| Componentes de medios completos iMG | |||
| 55 mM 2-mercaptoetanol | Gibco | 21985023 | concentración final 55 µ M |
| IL-34 | PeproTech o Biologend | 200-34 o 577904 | concentración final 100 ng/mL |
| iMG medios base | concentración final 1x | ||
| M-CSF | PeproTech | 300-25 | concentración final 5 ng/mL |
| TGF-β | PeproTech | 100-21 | concentración final 50 ng/mL |
| Componentes de medios base de inducción | |||
| DMEM/F12 con concentración final de 11330032 HEPES | Gibco | 1x | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | concentración final 1x |
| suplemento de N2, 100x | Gibco | 17502-048 | final concentración 1x |
| Aminoácidos no esenciales (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | concentración final 1x |
| Componentes de Medios de inducción completos | |||
| Compuesto E | Calbiochem | 565790 | concentración final 0,2 μ M y reconstituir el reactivo madre a 2 mM en etanol 1:1 y DMSO |
| Doxiciclina | Sigma | D9891 | concentración final 2 μ g/mL y reconstituya el reactivo madre a 2 mg/mL en DPBS |
| em>Medios base de inducción | concentración final 1x | ||
| ROCK Y27632 | Fisher Scientific | BD 562822 | concentración final 10 μ M |
| Componentes de Neuron media | |||
| B-27 Plus Sistema de cultivo neuronal | Gibco | A3653401 | concentración final 1x para medios y suministro |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | concentración final 1x |
| Suplemento de N2, 100x | Gibco | 17502-048 | concentración final 1x |
| Aminoácidos no esenciales (NEAA), 100x | Gibco | 11140050 | concentración final 1x |
| iPSC líneas utilizadas en este estudio | |||
| KOLF2.1J: clon WT B03 | The Jackson Laboratories | ||
| of Health | |||
| reactivos de aislamiento de sinaptosomas | |||
| Kit de ensayo de proteínas BCA | Thermo Scientific Pierce | 23227 | |
| dimetilsulfóxido (DMSO) | Sigma | D2650 | |
| Syn-PER Reactivo de extracción de proteínas sináptico | Thermo Scientific | 87793 | Referido al reactivo de lisis celular para el aislamiento de sinaptosomas |
| Colorantes de ensayo de fagocitosis | |||
| Reactivo NucBlue Live Ready | Invitrogen | R37605 | |
| pHrodo Rojo, éster de succinimidilo | ThermoFisher Scientific | P36600 | Referido a colorantes sensibles al pH |
| Otros reactivos de cultivo celular tripano fuerte | |||
| 0,4% | AMRESCO INC | K940-100ML | |
| Albúmina sérica bovina (BSA) | Sigma | 22144-77-0 | |
| BrdU | Sigma | B9285 | Reconstituir a 40 mM en agua estéril |
| Citocalasina D | Sigma | concentración final 10 µ M | |
| DPBS con Calcio y magnesio | Corning | 21-030-CV | |
| DPBS sin calcio y magnesio | Corning | 21-031-CV | Referido a DPBS |
| KnockOut DMEM/F-12 | Gibco | 12660012 | Referido a DMEM-F12 optimizado para el crecimiento de células madre pluripotentes embrionarias humanas e inducidas |
| Laminina Proteína de ratón, | natural Gibco | 23017015 | Referido a laminina |
| Software y equipo | |||
| centrífuga | Eppendorf | Modelo 5810R | |
| Citación 5 Imágenes de células vivas lector | Biotek | ||
| Gen5 Microplate Reader and Imager Software | Biotek | versión 3.03 | |
| Multi-Therm Heat-Shake | Benchmark | se refiere como agitador de tubos | |
| Sonicador de agua | Elma | Mode Transsonic 310 |
Referencias
- Heider, J., Vogel, S., Volkmer, H., Breitmeyer, R. Human iPSC-derived glia as a tool for neuropsychiatric research and drug development. International Journal of Molecular Sciences. 22 (19), 10254(2021).
- Muzio, L., Viotti, A., Martino, G.
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Reimpresiones y permisos
