Summary
מוצג כאן פרוטוקול המשתמש בפרומסטיגוטים גדולים של לישמניה כדי לקבוע את הקשירה, הציטוטוקסיות והאיתות המושרים על ידי רעלנים היוצרים נקבוביות. הוכחת היתכנות עם סטרפטוליזין O מסופקת. רעלנים אחרים יכולים לשמש גם כדי למנף את המוטציות הגנטיות הזמינות בל' מז'ור כדי להגדיר מנגנונים חדשים של עמידות לרעלנים.
Abstract
הבנת התפקוד והמנגנון של רעלנים יוצרי נקבוביות (PFTs) היא מאתגרת מכיוון שהתאים עמידים בפני נזקי הממברנה הנגרמים על-ידי PFTs. בעוד שגישות ביופיזיות עוזרות להבין את היווצרות הנקבוביות, לעתים קרובות הן מסתמכות על גישות רדוקציוניסטיות חסרות את ההשלמה המלאה של שומנים וחלבונים של הממברנה. תאים אנושיים בתרבית מספקים מערכת חלופית, אך המורכבות והיתירות שלהם במנגנוני התיקון מקשות על זיהוי מנגנונים ספציפיים. לעומת זאת, הפתוגן הפרוטוזואני האנושי האחראי ללישמניאזיס עורי, לישמניה מז'ור, מציע איזון אופטימלי בין מורכבות לרלוונטיות פיזיולוגית. L. major ניתנת למתיחה גנטית וניתן לתרבת אותה לצפיפות גבוהה במבחנה, וכל השפעה של הפרעות על זיהום ניתנת למדידה במודלים מבוססים של מורין. בנוסף, L. major מסנתז שומנים שונים ממקביליהם היונקים, מה שיכול לשנות את הדינמיקה של הממברנה. שינויים אלה בדינמיקה של הממברנה ניתנים לבדיקה באמצעות PFTs ממשפחת הרעלנים המאופיינים ביותר, ציטוליזין תלויי כולסטרול (CDC). CDCs נקשרים לארגוסטרול בקרום לישמניה ויכולים להרוג את L. major promastigotes, מה שמצביע על כך ש- L. major היא מערכת מודל מתאימה לקביעת המנגנונים התאיים והמולקולריים של תפקוד PFT. עבודה זו מתארת שיטות לבדיקת תפקוד PFT בפרומסטיגוטים גדולים של L. , כולל תרבית טפילים, כלים גנטיים להערכת רגישות לשומנים, מבחני קשירת ממברנות ומבחני מוות של תאים. מבחנים אלה יאפשרו שימוש מהיר ב- L. major כמערכת מודל רבת עוצמה להבנת תפקוד PFT במגוון אורגניזמים מגוונים אבולוציונית ומשותפים בארגון השומנים.
Introduction
רעלנים יוצרי נקבוביות (PFTs) הם המשפחה הגדולה ביותר של רעלנים חיידקיים1, אך המנגנונים שבאמצעותם הם מנקבים והורסים תאים אינם מובנים היטב. המשפחה הנחקרת ביותר של רעלנים יוצרי נקבוביות היא זו של ציטוליזין תלויי כולסטרול (CDC). CDCs מסונתזים בעיקר על ידי חיידקים גראם חיוביים, כולל הגורם הסיבתי של דלקת החיתולית הנמקית, סטרפטוקוקוס פיוגנס2. S. pyogenes מפריש את הסטרפטוליזין O (SLO) של CDC, אשר נקשר לסטרולים בקרום הפלזמה של התאים המארחים כמונומרים, אוליגומריז, ומכניס ~ 20-30 ננומטר נקבוביות לתוך הממברנה1. התפקיד כי שומנים לשחק בתהליך זה נשאר נקבע היטב.
גישה אחת לחקר אינטראקציות שומנים-CDC היא שימוש בליפוזומים המוגדרים כימית. בעוד שליפוזומים מוגדרים מספקים מידע על ערכי הסף הדרושים של שומנים כדי לקיים קשירת רעלנים והיווצרות נקבוביות 3,4, הם אינם משחזרים באופן מלא את תפקודי התא. לדוגמה, ליפוזומים משוחזרים חסרים את אסימטריית השומנים של פונדקאים של יונקים ושינויים בשומנים בתגובה לרעלנים5. חלופה אחת לליפוזומים היא שימוש בקווי תאים של יונקים. בעוד שקווי התאים האלה רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית, יש מידה רבה של יתירות במנגנוני חישת רעלנים והתנגדות2. כתוצאה מכך, מסלולי התיקון המשמשים להתנגדות ל-CDC נותרים לא מוגדרים היטב. יש לציין כי זרם Ca2+ הוא המפעיל העיקרי של תיקון ממברנה1. במורד הזרם של זרםCa 2+, מסלולים מרובים מעורבים, כולל תיקון תלוי סרמיד 6,7 ומסלול תיקון תלוי MEK6. מסלולים אלה מתקשרים עם אפקטים אחרים של חלבונים, כולל קומפלקס המיון האנדוזומלי הנדרש להובלה (ESCRT)8, ונספחים 6,9,10. ניתוח מסלולים אלה בתאי יונקים הוא מאתגר בשל היתירות, אשר מבלבלת את פענוח הנתונים.
אחת הדרכים לאזן את המורכבות עם פשטות לניתוח מסלולי תיקון היא השימוש באורגניזמים פשוטים יותר, כגון פתוגנים פרוטוזואנים בסוג לישמניה. לישמניה sp. גורמת ללישמניאזיס בבני אדם ובבעלי חיים אחרים. לישמניאזיס נע בין לישמניאזיס עורית (נגעים בעור מוגבלים בעצמם) ללישמניאזיס הקרביים הקטלניים (hepatosplenomegaly), בהתאם למין ולגורמים אחרים11. לישמניה מייג'ור, הגורם הסיבתי של לישמניאזיס עורי, מועברת לבני אדם באמצעות וקטור חול ומשמשת להבנת תפקוד לישמניה וזיהום12. בנוסף, לישמניה sp. הם digenic12. הם קיימים כטפילי מקרופאגים תוך-תאיים המכונים אמסטיגוטים וכפרומסטיגוטים בעלי חיים חופשיים ומסומנים בחול12. L . פרומסטיגוטים עיקריים יכולים להיות מתורבתת במדיה עם תוספת סרום כגון M199 לצפיפות גבוהה13. פרומסטיגוטים ניתנים גם למתיחה גנטית; קיימים נוקאאוטים גנטיים רבים, כולל אלה המכוונים למסלולי ביוסינתזה של שומנים13. ניתן להעריך נוקאאוטים אלה לגדילה ולהבדלים בהדבקה ובהתפתחות הנגעים באמצעות זיהום של עכברי Balb/c13.
בנוסף לקלות היחסית של תרבית לישמניה ומגוון הנוקאאוטים של ביוסינתזה של שומנים, לטפיל יש גנום פשוט יותר מאשר ליונקים. המין המאופיין ביותר של לישמניה הוא L. major, שיש לו כלים גנטיים קיימים רבים, כגון מוטנטים עם מטבוליזם שומנים פגום14. יש לציין כי חלבוני תיקון רבים נעדרים. ל-L. major אין הומולוגים שזוהו עד כה עבור חלבוני תיקון מרכזיים של יונקים כגון נספחים. זה מאפשר אפיון של מסלולי תיקון משומרים אבולוציונית ללא המורכבות של מערכות יונקים. עם זאת, מסלולי תיקון לא אופיינו בלישמניה עד כה. יחד עם זאת, מסלולי איתות מרכזיים המעורבים בתיקון, כגון מסלול MEK6, נשמרים בלישמניה sp.15,16, אם כי יש לאמת הומולוגים. מסלול החלבון קינאז המופעל על ידי מיטוגן (MAPK) נחקר היטב ב-L. mexicana, שם הוא תורם להישרדות תוך-תאית וליציבות תרמו-תאית בתאי יונקים ושולט במטה-ציקלוגנזה16. בליישמניה sp., 10 מתוך 15 MAPKs אופיינו17. LmMAPK9 ו-LmMAPK13 צפויים להיות הדומים ביותר ליונקים ERK1/2 בהתבסס על זהותם ברצף שפתי הזרחון המשומר. רצף שפתי הזרחון הוא TEY הן עבור יונקים ERK1/2 והן עבור LmMAPK9 ו- LmMAPK13. עם זאת, לשמונה מה-MAPKs של לישמניה יש מוטיב זרחון TDY15. לפחות שני הומולוגים של MEK זוהו בלישמניה sp., LmxMKK18 וקינאז הקשור ל-MEKK (MRK1)19. זה מצביע על כך שתובנות שזוהו בלישמניה יכולות להיות מתורגמות למערכות יונקים. כאשר הם אינם מתורגמים למערכות יונקים, הם מייצגים מטרות טיפוליות לטיפול בלישמניאזיס.
על מנת להשתמש ב- L. promastigotes כדי לחקור תיקון ממברנות ואינטראקציות עם רעלים, יש צורך בטכניקות של תפוקה בינונית . בעוד שהדמיית תאים חיים ברזולוציה גבוהה מאפשרת הדמיה של חלבונים וממברנות מסומנים בזמן אמת, התפוקה נמוכה וייתכן שהיא אינה מודדת את הישרדות התאים. מבחני כדאיות בתפוקה בינונית כוללים ספיגת צבע הנמדדת על ידי ציטומטריה של זרימה, מדידת פעילות מיטוכונדריאלית או שחרור חלבונים תאיים כמו לקטט דהידרוגנאז (LDH). בתאי יונקים, מבחני LDH אינם מודדים באופן כמותי מוות תאי20. יתר על כן, מבחנים מבוססי אוכלוסייה כמו שחרור LDH או פעילות מיטוכונדריאלית אינם מאפשרים ניתוח חד-תאי או רב-ממדי חזק20. לעומת זאת, מבחנים מבוססי ציטומטריה של זרימה מאפשרים אנליזה רב-פרמטרית של תא יחיד20. עם זאת, מבחנים אלה לא יושמו להבנת הביולוגיה של רעלנים או לתגובות לרעלנים ב - L . major promastigotes.
במחקר זה, SLO משמש ככלי להבנת ההפרעה של קרום הפלזמה של מוטציית ה-sphingolipid null של L. major בשני חוצצים שונים - המדיה M199 המשמשת באופן שגרתי לתרבות L. promastigotes גדולים והמאגר הפשוט יותר של Tyrode. בדיקת ציטומטריה של זרימה בתפוקה בינונית מתוארת ומשמשת ליצירת עקומות מינון-תגובה של רעלן. נתונים מהמבחן הציטומטרי של הזרימה ממודלים לעקומה לוגיסטית כדי לקבוע את ערכי LC50. בעזרת מידע זה, ניתן לקבוע מינון תת-ליטי של SLO כך שניתן יהיה לאמת נוגדני MAPK באמצעות כתם מערבי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ההנחיות המתאימות והפרקטיקות המיקרוביולוגיות, הבטיחות ותרביות התאים הסטנדרטיות שימשו לשימוש ולטיפול בדנ"א העיקרי והרקומביננטי של הפתוגן RG2 לישמניה . כל הניסויים עם ל. מייג'ור חי בוצעו בארון בטיחות ביולוגית במעבדה מוסמכת BSL-2. העבודה נוהלה על ידי הוועדה המוסדית לבטיחות ביולוגית של אוניברסיטת טקסס טק.
הערה: מנקודת מבט בטיחותית, פרומסטיגוטים חיים של L. הם פתוגנים מקבוצת סיכון 2. טפל תוך שימוש בהכלה, אמצעי זהירות ופיקוח מתאימים של הוועדה המוסדית לבטיחות ביולוגית (IBC). לטפל בחומרים רעילים וכימיקלים בהתאם לנהלים מוסדיים לחומרים רעילים. אם נעשה שימוש ברעלנים רקומביננטיים, ייתכן שיהיה צורך באישור ובפיקוח של IBC לצורך עבודת דנ"א רקומביננטי.
1. טיפוח והכנה של L. promastigotes גדול
- להשיג, או ליצור ולאמת, L. מוטציות גנטיות עיקריות כפי שתואר קודם לכן באמצעות רקומבינציה הומולוגית או שיטות מבוססות קריספר13,21. השתמש בנוקאאוטים המשלימים עם הגן שנוסף בחזרה על פלסמיד כדי להבטיח ספציפיות של הנוקאאוט.
- תרבות פראית מסוג L. מז'ור ו- spt2- פרומסטיגוטים בטמפרטורה של 27 מעלות צלזיוס במדיום M199 שלם. תרבית את תאי התוספת האפיזומליים (spt2-/+SPT2) ב-M199 שלם בתוספת 10 מיקרוגרם/מ"ל G418 (ראו טבלה 1 וטבלת חומרים).
הערה: כל מערך הניסויים הכולל ניסויים עם תאי L. עיקריים חייב להתבצע בארון בטיחות ביולוגית בעל אישור BSL2. - מטפחים את הפרומסטיגוטים ב-M199 בינונישלם 22 עד שהם מגיעים לשלב היומן (2-8 x 106 תאים/מ"ל), כפי שנקבע על ידי L. מבחני עקומת גדילה גדולים שנעשו בעבר23. תכננו 1 x 10 5 תאים עבור כל באר עבור ציטוטוקסיות, ועוד 5 x 105 תאים לבקרת צביעה. עבור כתם מערבי, תוכנית 2 x 107 תאים לכל באר.
הערה: בצע בדיקת ציטוטוקסיות עם שני שכפולים טכניים. - כדי לוודא את צפיפות התאים הנכונה, מערבבים אליקוט (10-40 μL) של פרומסטיגוטים עם נפח שווה של קיבוע (3.7% paraformaldehyde ב 1x PBS). טען 10 μL של הדגימה הקבועה על כל צד של hemacytometer.
אזהרה: פורמלדהיד הוא כימיקל רעיל. טיפול בהתאם למדיניות המוסדית לכימיקלים מסוכנים. - בצע ספירת תאים באמצעות מיקרוסקופ בהגדלה של פי 20. ספרו את כל התאים ב-25 הריבועים הקטנים במרכז ההמיציטומטר. חוזרים על הפעולה עבור הריבועים משני הצדדים וממוצעים של הספירות.
הערה: אם השונות בין הספירות היא >10, ספר מחדש וממוצע. אם הספירה הממוצעת היא <10 או >100, שנה את הדילול וספר מחדש ולאחר מכן חשב את צפיפות התרבות באמצעות הנוסחה הבאה:
(eq 1)
לדוגמה, אם יש בממוצע 250 לישמניה ב-25 ריבועים, צפיפות התרבית היא 5 x 106 תאים למ"ל. - לאחר הספירה, העבירו 5 x 106 תאים לצינור חרוטי של 15 מ"ל וצנטריפוגה בגודל 1,500 x g למשך 8 דקות בטמפרטורת החדר כדי לגלגל את התאים.
- השליכו את הסופר-נטנט באמצעות פיפטה של 10 מ"ל ומערבבים לזמן קצר את כדור התא. הוסף 5 מ"ל של 1x PBS לאותו צינור ושטוף את התאים על ידי היפוך עדין 3-6x. צנטריפוגה ב 1,500 x גרם במשך 8 דקות בטמפרטורת החדר כדי לזרוק את התאים.
- השליכו את הסופר-נאטנט באמצעות פיפטה של 10 מ"ל והחזירו את הכדור 5 x 106 תאים ב-5 מ"ל בינוני (למשל, M199 או חיץ של 1x Tyrode) ששימש לניסויים עם פיפטה של 5 מ"ל כדי לתת ריכוז סופי של 1 x 106 תאים למ"ל.
(eq 1)2. בדיקת ציטוטוקסיות
- הכנה ניסיונית
- לטהר את הרעלן כפי שתואר קודםלכן 24, או לרכוש את הרעלן מספק. Aliquot לתוך aliquots חד פעמי ולאחסן −80 °C למשך עד 1 שנה. הימנעו ממחזורי הפשרה מרובים בהקפאה.
- קבעו את הפעילות ההמוליטית של כל רעלן באמצעות תאי דם אדומים אנושיים (ראו טבלת חומרים)24.
הערה: פעילות המוליטית משמשת מכיוון שהיא שולטת בהבדלים בפעילות עקב טיהור, מוטציות וכו '. בחירת המינים של אריתרוציטים עשויה לשנות את הפעילות ההמוליטית (למשל, אינטרמדיליזין דורש תאי דם אדומים אנושיים). - תכנן שני שכפולים טכניים עבור כל מצב, שבעה דילולים עבור עקומת המינון-תגובה, ובקרה ללא רעלן.
הערה: עם פרומסטיגוטים מסוג פרא (WT), spt2 ו-spt2-/+SPT2, ניתן לבדוק שני טיפולים בלוח V-תחתון אחד 96-well. לדוגמה, ניתן להשוות את הרגישות למדיה (איור 1). במקום צלחת V-bottom, ניתן להשתמש בצינורות מיקרוטיטר בגודל 1.2 מ"ל (ראו טבלת חומרים). בשל זמני הרכישה על הציטומטר, הפעלת יותר מצלחת אחת בכל פעם אינה מומלצת. - קבע באיזה מאגר בדיקה להשתמש בהתבסס על תנאי הבדיקה הדרושים ומטרת הניסוי.
הערה: בדוגמה זו, משווים שני מאגרי בדיקה: M199 והמאגר של Tyrode בתוספת צבע הכדאיות פרופידיום יודיד (PI). כולסטרול בסרום יפריע לפעילות CDC24. - חשב את כמות הרעלן הדרושה בהתבסס על התנאים ומספר הגנוטיפים המטופלים. ודא ש-50% תסיסה ספציפית מתרחשת באמצע עקומת הדילול.
הערה: עבור CDC, דילול סדרתי כפול ייתן טווח טוב עבור מודלים לוגיסטיים מאוחרים יותר. עבור spt2- promastigotes, 4,000 HU/mL SLO הוא דילול ההתחלה המומלץ. כאשר משתמשים ברעלים לא פעילים, ניתן להשתמש במקום זאת במסה השווה למינון הגבוה ביותר. - תכנן נפח סופי של 200 μL לכל באר, והוסף נפח קטן נוסף (50-100 μL) כדי להסביר את שגיאת הפיפטה.
הערה: עם שלושה גנוטיפים, שכל אחד מהם נעשה בשכפול, יהיו שש דגימות לדילול סדרתי. - קבע את הכמות הכוללת של הרעלן הדרוש באמצעות הנוסחה הבאה:
(eq 2)
כאשר ActivityMax הוא הריכוז הגבוה ביותר בשימוש (HU/mL); TotalFinalVolume הוא הנפח הכולל (עבור שש דגימות, 200 x 6 + 100 = 1,300 μL); ActivityStock היא הפעילות של מלאי הרעלן (HU/mL); ו- VolStockToxin הוא נפח מלאי הרעלנים הדרוש. - הכינו מאגר בדיקה מספיק הדרוש לניסוי. השלימו את המדיום הבסיסי עם צבע כדאיות וכל Ca 2+ או EGTA הדרושים לשליטה ברמות Ca2+. מערבולת לערבב.
הערה: לדוגמה, עבור כל חיץ של 10 מ"ל Tyrode, הוסף 50 μL של 2 מ"ג / מ"ל PI ו 200 μL של 100 mM CaCl2, נותן ריכוזים סופיים של 10 מיקרוגרם / מ"ל ו 2 mM, בהתאמה. - ודא שצבע הכדאיות PI אינו מתנגש עם בדיקות אחרות המשמשות, כגון עבור בדיקות קשירה פלואורסצנטיות באמצעות Cy5 או AlexaFluor647-רעלים מצומדים20,25.
- תכנן דילולי רעלנים כדי ליצור תמיסה של פי 2 של רעלן. הוסיפו חיץ בדיקה לצינורות צנטריפוגה של 1.5 מ"ל וצננו על קרח. יש להוסיף את הרעלן רק מיד לפני תחילת הבדיקה.
הערה: בדוגמה זו, 1.3 מ"ל של מאגר בדיקה יתווספו עבור הדילול העליון, ו- 650 μL יתווספו עבור דילולים סדרתיים כדי להכין את תמיסת הרעלן 2x.
- ניסוי
- שמור 0.5 מ"ל של promastigotes מעובד משלב 1.8 בצינור נפרד כמו "שליטה מוכתמת".
הערה: דוגמה זו תשמש להגדרת גידור על ציטומטר הזרימה. - יש להוסיף 2 מ"ג/מ"ל PI לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם/מ"ל לשאר הפרומסטיגוטים. וורטקס במשך 3 שניות.
הערה: לאחר הוספת PI לפרומסטיגוטים המעובדים, ניתן להשתמש בתאים אלה רק למשך פרק זמן של 2.5 שעות. לאחר 2.5 שעות, התאים מתחילים למות, והתוצאות הופכות שגויות. - הוסיפו 1 x 105 (ב-100 μL/well) פרומסטיגוטים מעובדים לכל באר של צלחת V-bottom 96-well או 1.2 mL microtiter tubes (איור 1). הניחו את הצלחת או את מתלה הצינורות על קרח בזווית של כ-45° מהצפייה. בצע את העבודה בארון בטיחות ביולוגית בעת טיפול בפרומסטיגוטים של לישמניה .
- הוסף 100 μL של מאגר בדיקה עם PI לכל פקד ללא רעלן (שורה אחרונה). ודא שהפקד נוסף כהלכה על-ידי זיהוי חזותי של צינורות עם נפח כולל של 200 μL שנראים בצבע כהה יותר.
- מוציאים את הרעלן מ-80 מעלות צלזיוס, מפשירים על קרח וממלאים לפי הצורך. הוסף את נפח הרעלן המחושב בשלב 2.1.5 לדילול הגבוה ביותר (שהוכן בשלב 2.1.10). לאחר מכן, דיללו את הרעלן באופן סדרתי (איור 1). פיפטה למעלה ולמטה לפחות 8x כדי להבטיח ערבוב.
הערה: יש לבצע את המבצע על קרח מכיוון ש-CDC מושבת במהירות בטמפרטורת החדר. - החל מריכוז הרעלנים הנמוך ביותר, הוסיפו במהירות 100 μL של רעלן לשורה הנכונה (איור 1 ואיור 2) והמשיכו עד שכל הרעלן נוסף לתאים.
- אטמו את הצלחת עם סרט איטום. דגירה ב-37°C למשך 30 דקות. לאחר תקופת הדגירה, לארוז ולהעביר את הצלחת לציטומטר הזרימה.
- שמור 0.5 מ"ל של promastigotes מעובד משלב 1.8 בצינור נפרד כמו "שליטה מוכתמת".
- איסוף נתונים
- הגדר את ציטומטר הזרימה (ראה טבלת חומרים) ותוכנת רכישה בהתאם להוראות היצרן ובהתאם למדיניות המתקן. אין לבצע את הליך הציטומטריה של הזרימה ללא הכשרה מוקדמת על הציטומטר.
הערה: בדוגמה זו, נעשה שימוש ב- Attune NxT בעל 4 לייזרים. PI נאסף בערוץ YL-1 (נרגש על ידי לייזר 561 ננומטר, עבר דרך LP 577, משתקף מ-600 DLP, ומסונן דרך פס פס 585/16), אם כי הספקטרום הרחב של PI מאפשר איסוף בערוצים אחרים. - באמצעות דגימת L. major promastigote שלא הוכתמה, קבעו את השערים לפיזור קדימה ולצד ואת הפרמטרים הפלואורסצנטיים הראשוניים בהתבסס על הצבעים שנבחרו.
- כלול פרמטר אחד נוסף אם תרצה עבור חלקות נקודה כדי לבדוק את ה-autofluorescence (לדוגמה, "ללא כתם") (איור 3).
הערה: בדוגמה זו, נעשה שימוש בערוץ BL-1 (נרגש על ידי לייזר של 488 ננומטר, עבר דרך 495 DLP ו- 503 LP, משתקף מ- 555 DLP ומסונן דרך פס פס 530/30). - באמצעות בקרות מוכתמות בודדות, הגדר את השערים לצבע הכדאיות (PI במחקר זה) ולכל רעלנים המסומנים באופן פלואורסצנטי. נטר את הפיזור קדימה לעומת הזמן עבור מיקרו-סתימות.
הערה: PI יכתים במעומעם את כל התאים שמעל לפקדים שאינם מוכתמים. תאים מתים יהיו ניתנים להפרדה בקלות, עם תאים מחלחלים באופן ארעי בין אוכלוסיות. - רכוש >10,000 אירועים מגודרים עבור כל דגימה בציטומטר.
הערה: מומלץ לקרוא מרגישות ביותר לפחות רגישה, אך ניתן להפוך את סדר הרכישה כדי לקבוע כל השפעה של סדר הקריאה על תוצאות המדגם. - שמור את הנתונים וייצא לפי הצורך לניתוח.
- הגדר את ציטומטר הזרימה (ראה טבלת חומרים) ותוכנת רכישה בהתאם להוראות היצרן ובהתאם למדיניות המתקן. אין לבצע את הליך הציטומטריה של הזרימה ללא הכשרה מוקדמת על הציטומטר.
- ניתוח נתונים
הערה: במחקר זה, Excel עם תוסף Solver (ראה טבלת חומרים) שימש לניתוח נתונים (ראה קובץ משלים 1).- סה"כ שער, תא בודד L. פרומסטיגוטים עיקריים על ידי פיזור קדימה וצד וזמן לפי הצורך (איור 3). השתמש בגובה או באזור לפי המומלץ עבור ציטומטר הזרימה.
הערה: עבור ציטומטר הזרימה המשמש כאן, גובה הוא הפרמטר המומלץ במקום שטח. - זהה ושער תאים מתים כ"PI גבוה". שער תאי ביניים כמו "PI נמוך". תאים גבוהים של PI הם תאים מתים, בעוד שתאים נמוכים של PI מחלחלים באופן חולף26.
הערה: תאים גבוהים PI מציגים בדרך כלל הסטה של 2-3 לוגים מתאים שליליים. - ייצא את הנתונים ל- Excel. השג את שם/מזהה המדגם ו-%PI גבוה כדי לקבוע הרג.
הערה: אם נעשה שימוש ברעלים פלואורסצנטיים, יהיה צורך בעוצמה הפלואורסצנטית החציונית (MFI) של אוכלוסיות חיות, חדירות ארעיות ושליליות. ניתן לייצא %PI נמוך לצורך חלחול חולף. - קבע את רמת ה-PI הגבוהה הממוצעת עבור כל מצב בין שני המשכפלים הטכניים.
הערה: אם יש צורך ב-MFI ממוצע עבור רעלנים פלואורסצנטיים, חשב גם זאת. - חשב %Lysis ספציפי מתוך %PI גבוה באמצעות הנוסחה הבאה24,25:
(eq 3)
כאשר PIhighxpt הוא % PI גבוה עבור מצב הניסוי; ו-PIhighctl הוא אחוז ה-PI הגבוה לשליטה ללא רעלים. - תרשים %ליזיס ספציפי נגד ריכוז רעלן עבור עקומת המינון-תגובה (איור 4).
- ארגן את עקומת המינון-תגובה ב- Excel לצורך מידול לוגיסטי. כלול ריכוז רעלנים וממוצע %ליזיס ספציפי יחד עם פרטי ניסוי ו/או חישובים גבוהים של %PI גולמי (טבלה 2).
- ודא שהתוספת Solver זמינה.
הערה: כדי להפוך את Solver לזמין בגירסת שולחן העבודה של Excel, עבור אל אפשרויות > קובץ > תוספות וסמן את התיבה Solver . הפעל מחדש את Excel. - תייג ארבע עמודות נוספות כ"מעוצב", "שיורית", "פרמטרים" ו"ערכי פרמטרים". ודא שהעמודות הראשונות תואמות לפרמטרים הניסוייים, לריכוז הרעלן ול-%Lysis ספציפי (טבלה 2).
- הוסף את הפרמטרים הבאים בעמודה "פרמטרים": L, k, c, SUM ו- LC50. אתחל את הפרמטרים L, k ו- c על-ידי הזנת הערכים הבאים בעמודה "ערכי פרמטרים": 100, 0.05, 1,000.
- בעמודה "מודל", צור את המודל הלוגיסטי באמצעות הנוסחה הבאה:
(eq 4)
הגדר את L, k ו- c לתאים המכילים פרמטרים אלה בעמודה "ערכי פרמטרים".
הגדר x לתא המכיל את ריכוז הרעלן.
הערה: עבור טבלה 2, תא G4, הנוסחה היא כדלקמן: =$J$3/(1+EXP(-$J$4*(D4-$J$5))) - החל משוואה זו על כל ערכי %Lysis ספציפיים, למעט הפקד ללא רעלים.
- בעמודה "שיורית", חשב את ריבוע ההפרש בין המספר הממודל לבין התזה הספציפית בפועל באמצעות המשוואה הבאה:
(סעיף 5)
כאשר y הוא הניסוי %Lysis ספציפי; ו- m הוא הערך המתאים בעמודה "ממודל" המחושב בשלבים 2.4.10-2.4.11. - בעמודה "ערכי פרמטרים" לצד "SUM", סכם את כל הערכים בעמודה שיורית.
- בעמודה "ערכי פרמטרים" לצד "LC50", אתחל את המשוואה כדי לחשב את LC50 מהערכים שנקבעו. פעולה זו פותרת את Eq 4 עבור x כאשר m = 50.
(eq 6)
עבור טבלה 2, הנוסחה של Excel היא כדלקמן: =J5-(LN(J3/(50)-1))/J4 - פתח את הפותר מהכרטיסיה נתונים. בחר באפשרות Set Purpose (הגדר מטרה) כתא המכיל את סכום השאריות שחושבו. הגדר אותו למינימום.
- שנה את תאי המשתנים עבור ערכי הפרמטרים של L, k ו- c.
הערה: הפותר עשוי להתנהג טוב יותר אם "הפוך משתנים בלתי מוגבלים ללא שליליים" נותר מסומן. - עבור ערכי k שליליים, שנה את Eq 4 ו- Eq 6 על-ידי חישוב −1 מ- k כדי לשנות את k לחיובי. השתמש בשיטת הפתרון הלא ליניארית GRG. לחץ על פתור.
- בדוק את העקומה ושה- LC50 מחושב באופן אוטומטי באמצעות Eq 6 (טבלה 2). אמת את ההתאמה על-ידי התוויית %תזה ספציפית ומידול כנגד ריכוז רעלנים באופן גרפי.
הערה: ניתן לבדוק זאת גם על ידי חישוב R2 עבור העקומה.
- סה"כ שער, תא בודד L. פרומסטיגוטים עיקריים על ידי פיזור קדימה וצד וזמן לפי הצורך (איור 3). השתמש בגובה או באזור לפי המומלץ עבור ציטומטר הזרימה.
(eq 2)
(eq 3)
(eq 4)
(סעיף 5)
(eq 6)3. אנליזת חלבונים של פרומסטיגוטים גדולים L. מאותגרים רעלן
- הכן ל . פרומסטיגוטים עיקריים כמתואר בסעיף 1.
- יש להשעות 2 x 107 WT, spt2-, ו- spt2-/+SPT2 L. פרומסטיגוטים עיקריים ב-2 מ"ל של מאגר הבדיקה הרצוי באמצעות פיפטה של 5 מ"ל (למשל, M199 ללא סרום). יש להוסיף רעלן לריכוז התת-ליטי הסופי ולדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
הערה: לדוגמה, מינון תת-ליטי של SLO עבור spt2- promastigotes הוא 500 HU/mL. - כלול גנוטיפים אחרים ובקרות ללא רעלנים.
- צנטריפוגה של הפרומסטיגוטים בגודל 1,500 x גרם למשך 10 דקות כדי להמטיר את התאים. השליכו את הסופרנטנט באמצעות פיפטה של 10 מ"ל. הפעל את הצינור הסגור המכיל את כדור התא במהירות שלוש פעמים על פני משטח לא סדיר, כגון הגריל של ארון הבטיחות הביולוגית, כדי לפרק את כדור התא.
הערה: כדור התא כמעט בלתי נראה לעין בלתי. - שחזרו מאגר דגימת SDS-PAGE אחד עם 2-mercaptoethanol מיד לפני השימוש וחממו ל-95°C למשך 10 דקות לפני התוספת לכדור התא. השהה את גלולת התא במאגר דגימה חם 1x SDS-PAGE, וערבב היטב על-ידי צנרת למעלה ולמטה. מחממים את גלולת התא המחודשת במאגר דגימה אחד בטמפרטורה של 95°C למשך 10 דקות.
הערה: לאחר משענות במאגר הדגימה, אחסן את הדגימות לטווח ארוך ב- −20 °C במידת הצורך. - הכינו את ג'ל הפירוק. דגה את כל הרכיבים למעט אמוניום פרסולפט (APS) ו- TEMED למשך 15 דקות.
- הוסיפו APS ו-TEMED מיד לפני יציקת הג'ל. בזהירות לכסות את ג'ל פתרון עם מים. אפשר לג'ל הפותר להתפלמר, ~ 30-45 דקות.
- מסננים את המים ומכינים את ג'ל הערימה. מוסיפים את ג'ל הערימה, תוך הקפדה על מניעת בועות. הכנס מסרק עם המספר הרלוונטי של בארות, ולאפשר פולימריזציה במשך 5 דקות. עקוב אחר פילמור באמצעות כל שאריות ג'ל הערימה.
- הרכיבו את הג'ל להפעלת SDS-PAGE והוסיפו מאגר מאגר לתא.
- טען 10 μL מכל דגימה לכל באר, או 8 μL של סולם החלבון. הפעל ב 180 V עד שהדגימות נכנסות לג'ל הפירוק, ולאחר מכן להפחית את המתח ל ~ 160 V ולהפעיל עד חזית הצבע הוא ~ 0.5 ס"מ מקצה הצלחת.
הערה: הזמן שלוקח לדגימות להגיע לתחתית עשוי להשתנות בין 1-1.5 שעות. ניתן להאריך את הזמן על ידי הפחתת המתח. לעולם אל תפחית את המתח לאפס. מתחים גבוהים יותר עלולים להגביר את הג'ל "מחייך" ולפצח את הצלחות. - מעבירים את הג'ל לכתם קומאסי (לצביעת חלבונים) או למאגר העברה פי 1 (להכתמה מערבית). לצביעת Coomassie, יש להכתים למשך הלילה, ולאחר מכן לטשטש, להצטלם ולייבש.
- עבור כתם מערבי, להכין את מערכת ההעברה על פי הוראות היצרן.
- להעברה רטובה, השתמש במאגר העברה קר פי 1 ובפדים רטובים מראש, נייר סינון וניטרוצלולוז. עבור מערכת Bio-rad Protean III (ראו טבלת חומרים) המשמשת כאן, ניתן לחתוך את נייר הסינון ל-10 ס"מ על 7.5 ס"מ. חותכים את הניטרוצלולוז ל-9 ס"מ על 6.75 ס"מ.
הערה: ניטרוצלולוז דליק מאוד. הימנע מלהבות פתוחות ומקורות פוטנציאליים אחרים של הצתה. - הניחו את קלטת ההעברה עם רפידות, נייר סינון וניטרוצלולוז. גלגלו בועות אוויר. מוסיפים את הג'ל בזהירות.
- הוסיפו את נייר הסינון ופרשו בועות אוויר. מוסיפים את הפד, סוגרים את הקלטת ומכניסים למחזיק בכיוון הנכון (ודאו שניטרוצלולוז פונה אל ההד האדום). מוסיפים מוט ערבוב וחבילת קרח בצד, וממלאים את המאגר בחיץ העברה קר פי 1. העברה ב 110 V למשך 90 דקות.
הערה: החום שנוצר במהלך ההעברה עלול להשפיע לרעה על ההעברה. כדי להבטיח העברה טובה, השתמש תמיד במאגר העברה קר 1x. - הסר את הניטרוצלולוז והכתם עם תמיסת פונסו למשך ~ 5 דקות. יש לשטוף במים טהורים במיוחד. מסמנים את סולם החלבון בעיפרון וחותכים את הכתם לפי הצורך. נטרל את הכתם באמצעות מאגר העברת שאריות.
הערה: ניתן לעשות שימוש חוזר בפונסו פעמים רבות. - חסום את הניטרוצלולוז ב-25 מ"ל של 5% BSA ב-1x TBST ב-4 מעלות צלזיוס, עם רעידות, למשך הלילה. לאחר מכן, השליכו את תמיסת החסימה והוסיפו נוגדן ראשי (1:1,000) ב-1% BSA ב-1x TBST. יש לנער בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה.
הערה: ניתן לשמור את הנוגדן העיקרי בטמפרטורה של −20 מעלות צלזיוס ולעשות בו שימוש חוזר מספר פעמים. - שטפו את הניטרוצלולוז 3x במשך 10 דקות כל אחד ב-1x TBST עם רעידות. יש להשליך את הכביסה ולהוסיף 10 מ"ל של נוגדן משני מצומד HRP (1:10,000) ב-1% BSA ב-1x TBST. יש לנער בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת. שטפו את הניטרוצלולוז 3x במשך 10 דקות כל אחד ב-1x TBST עם רעידות.
- הכינו מגיב ECL מיד לפני הדמיית הניטרוצלולוז. מיד לפני ההדמיה, decant את TBST ולהוסיף את מגיב ECL ניטרוצלולוז. יש לנער במשך דקה אחת. דמיינו את הג'ל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
רגישות פרומסטיגוטה מוגברת ל-SLO במאגר של Tyrode בהשוואה ל-M199
רגישות ה- SLO של L. promastigotes גדולים הושוותה בין מאגרי בדיקה שונים. פרומסטיגוטים מסוג Wild, spt2 ו-spt2-/+SPT2 אותגרו עם SLO ב-M199 ללא סרום או במאגר של Tyrode בתוספת 2 mM CaCl2 למשך 30 דקות לפני ניתוח על ציטומטר זרימה. טפילים מתאימים לניתוח היו תאים בודדים שזוהו על ידי פרופילי פיזור קדימה/צד (איור 3A,B). הנתונים נאספו באמצעות ערוצים BL1 (עירור 488, מסנן פליטה 530/30) כבקרת פליטה אוטומטית ו- YL1 (עירור 561 ננומטר, מסנן פליטה 585/16) עבור PI. BL1 שימש לזיהוי בעיות פוטנציאליות של אוטופלואורסצנציה או פיצוי (ציר x באיור 3C-E). השימוש בקו 561 ננומטר הפחית את הגלישה מ- PI לערוץ BL1. החלק של התאים המתים נקבע עבור כל מצב, ואחוז ליזיס ספציפי נקבע. פרומסטיגוטים מסוג Wildtype ו-spt2-/+SPT2 היו עמידים ל-SLO ב-M199 נטול סרום, אך היו להם תזה ספציפית מינורית (<20%) במאגר של טירוד (איור 4A). פרומסטיגוטים מסוג spt2 עם מחסור בספינגוליפידים היו רגישים ל-SLO גם ב-M199 נטול סרום וגם במאגר של טירודה (איור 4). כדי לכמת את העלייה ברגישות מהמאגר של Tyrode בהשוואה ל-M199 נטול סרום, עקומת המינון-תגובה התאימה למודל לוגיסטי, וה-LC50 חושב עבור כל תנאי (איור 4B). הפרומסטיגוטים spt2 היו רגישים בערך פי שמונה ל-SLO בחיץ של טיירוד מאשר ב-M199 (איור 4B). נתונים אלה מראים כי הרגישות לרעלנים עשויה להשתנות בהתאם למאגר שבו נעשה שימוש. התאמת עקומה מאפשרת השוואה של שינויים בכל עקומת המינון-תגובה. לפיכך, ציטומטריה של זרימה מאפשרת בדיקה בתפוקה בינונית כדי להשוות את רגישות הרעלן של L. promastigotes גדולים בתנאים שונים.
הפעלת מסלול MEK ב - L. major ללא תלות באתגר הרעלן
הנתונים החד-תאיים על הישרדות התאים מבדיקת הציטוטוקסיות מאפשרים בדיקות במורד הזרם במינוני רעלן תת-תאי. לדוגמה, ניתן לבחון ל' מז'ור מסלולים ביוכימיים על ידי הכתמה מערבית לאחר אתגר הרעלן. מסלול MEK מופעל במהלך תיקון ממברנה בתאי יונקים6. לא ידוע אם מסלול זה מופעל בעקבות אתגר SLO ב- L. major או אם הנוגדנים הזמינים מסחרית מזהים הומולוגים של L. major MAPK. פרומסטיגוטים WT, spt2-, ו-spt2-/+SPT2 אותגרו עם מינון תת-ליטי (500 HU/mL) של SLO ונותחו על ידי כתם מערבי. פס של ~120 kDa נצפה עבור phospho-MEK בפרומסטיגוטים הגדולים של L. (איור 5). עבור סך MEK, נצפו להקות ב~120 kDa ו-~55 kDa (איור 5), התואמות את הגדלים של MRK1 ו-LmxMKK, בהתאמה. Phospho-ERK זיהה פסים דומים, בעוד שכתם נוגדני ERK לא היה חזק בבדיקה זו (איור 5). ליפופוספוגליקן (גפ"מ) וטובולין הוכתמו גם הם כבקרות העמסה. נתונים אלה חושפים את החשיבות של אימות נוגדנים לשימוש ב- L. major.
איור 1: לוחות 96 בארות מאפשרים מערך מסודר למבחני ציטוטוקסיות. מבחן הציטוטוקסיות מחולק לשישה טורים של שני שכפולים טכניים כל אחד. עם בקרות, זה מאפשר שני תנאים להיבדק לכל צלחת. בדוגמה זו, פרומסטיגוטים L.major שהוחזרו ב-M199 ללא סרום מושווים לאלה שבמאגר של טיירודה. הגנוטיפים עוקבים אחר הסדר של סוג הבר (WT) (ירוק), spt2- (אדום) ו- spt2-/+SPT2 (כחול). הרעלן (SLO) מתווסף כך שהריכוז עובר מהריכוז הגבוה ביותר בחלק העליון של הצלחת לתחתית, ומשאיר את השורה האחרונה כבקרה ללא רעלן. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: הגדרה עקבית מאפשרת תוצאות של ציטוטוקסיות הניתנות לשחזור. לאחר חישוב כמות הרעלן הדרושה, מוכן נפח מאגר הבדיקה הדרוש לפתרון פי 2. צבע הכדאיות (PI) ו- CaCl2 מתווספים לפי הצורך והמאגר מחולק לצינורות של 1.5 מ"ל. לאחר שטיפה והשעיה במאגר בדיקה, מספרים שווים של פרומסטיגוטים גדולים L . מחולקים בכל באר של צלחת 96 באר. הרעלן מתווסף למאגר הבדיקה ומדולל באופן סדרתי ממינון הרעלן הגבוה ביותר (צינור ראשון) עד למינון הנמוך ביותר (צינור 7) מיד לפני התוספת לתאים. הרעלן מתווסף לתאים בלוח 96 הבאר החל מתחתית הצלחת במינון הרעלן הנמוך ביותר (שורה 7) ועד למינון הגבוה ביותר (שורה ראשונה). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: אסטרטגיית ה-gating מבחינה בין אוכלוסיות חיות ומתות של תאים. L. פרומסטיגוטים עיקריים המוכתמים ב- PI ומאותגרים עם SLO נותחו על ידי ציטומטריה של זרימה. (א,ב) אסטרטגיית ה-gating מזהה תאים בודדים מתוך סך L. major בהתבסס על פיזור קדימה וצד. (ג-ה) צביעת PI מוערכת בשלב הבא, והתאים מגודרים לאוכלוסיות PI גבוהות, PI נמוכות ושליליות PI. מוצגים נתונים מייצגים עבור (C) ללא רעלן, (D) 1,000 HU/mL, ו- (E) 4,000 HU/mL SLO. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: החיץ של טירודה משפר את הרגישות של L. promastigotes גדולים בהשוואה ל-M199. Wildtype (WT), spt2-, ו-spt2-/+SPT2 L. פרומסטיגוטים עיקריים ב-M199 ללא סרום או חיץ של טירודה בתוספת 2 mM CaCl2 אותגרו עם SLO בריכוזים שצוינו ב-37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, וספיגת PI נותחה על ידי ציטומטריה של זרימה. חישוב %ליסיס ספציפי. נבנה מודל לוגיסטי וה-LC50 חושב עבור המוטנטים spt2. גרפים מציגים (A) ממוצע ± SEM או (B) ניסויים בודדים משלושה ניסויים בלתי תלויים. מבחן t לא משויך של סטודנט עם התיקון של וולש שימש עבור ערכי LC50. ** p < 0.01 אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: Phospho-ERK ו-phospho-MEK1/2 מזהים חלבונים עיקריים מסוג L. ללא תלות בספינגוליפידים או באתגר הרעלן. Wildtype (WT), spt2-, ו-spt2-/+SPT2 L. פרומסטיגוטים עיקריים אותגרו במשך 30 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם או בלי 500 HU/mL SLO ב-M199 ללא סרום בתוספת 2 mM CaCl2. הליזטים של התאים נפתרו על ידי SDS-PAGE, הועברו לניטרוצלולוז, ונבדקו עבור פוספו-מק (pMEK), סך MEK, פוספו-ERK (pERK), ERK כולל, ליפופוספוגליקן (גפ"מ) או טובולין, ואחריו נוגדנים משניים מצומדים HRP ו-ECL. כתם מייצג משני ניסויים עצמאיים מוצג בכל מקרה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.
טבלה 1: קומפוזיציות מאגר ומדיה. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
טבלה 2: פריסה לדוגמה עבור חישובי Excel. אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.
קובץ משלים 1: גיליון אלקטרוני של Excel עם נוסחאות. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
במחקר זה תוארו שיטות לחקר המנגנונים והתפקודים המולקולריים של PFTs, תוך שימוש בפתוגן האנושי לישמניה מייג'ור כמערכת מודל. פותחה בדיקת ציטוטוקסיות מבוססת ציטוטוקסיות של זרימה בתפוקה בינונית למדידת כדאיות של תא בודד. הכדאיות היא כמותית ברמת האוכלוסייה מכיוון שניתן לחשב ערכי LC50 מעקומת המינון-תגובה באמצעות מודלים לוגיסטיים. כהוכחה עקרונית, נעשה שימוש בבדיקה ציטומטרית של זרימה כדי להמחיש שבחירת המדיה יכולה לשנות את הרגישות של L.major מסוג בר וחסר ספינגוליפידים ל-SLO ולקבוע את מינון הרעלן התת-ליטי בכל מדיום. כהוכחה עקרונית במבחנים במורד הזרם, נוגדני phospho-MAPK ו- phospho-ERK נבדקו ב- L. promastigotes עיקריים במהלך אתגר הרעלן. באופן כללי, L. major promastigotes הם מערכת מודל רלוונטית מבחינה פתוגנית וניתנת למתיחה גנטית שניתן להשתמש בה כדי להבין טוב יותר את המנגנונים והתפקודים של נזק בתיווך רעלן לתאים.
בדיקת הציטומטריה של הזרימה מציעה גמישות גבוהה. צבעי כדאיות אחרים יכולים להיות מוחלפים ב- PI אם תרצה בכך. בתאי יונקים לא נצפו הבדלים ביכולת הדיווח של טווח של צבעי כדאיות20. הבחירה ברעלן, ל. גנוטיפ עיקרי, תוספת של כל הטיפולים, ובחירת חיץ הבדיקה עשויים להיות מגוונים לפי הצורך. ניתן להעריך את קשירת הרעלן במקביל לציטוטוקסיות או במקומה, אם הרעלן שבו נעשה שימוש מצומד לפלואורופור, כגון Cy5. עבור L. גנוטיפים עיקריים, חשוב לכלול זנים משלימים כדי להבטיח שהפנוטיפ נובע מכך שהגן נדפק. במחקר הוכחת היתכנות זה, מדיום הבסיס ששימש לגידול ל. מז'ור, M199, העניק הגנה רבה יותר ל- L. promastigotes גדולים מאשר החיץ של טיירוד. החיץ של טירודה הגביר את הרגישות של מוטציית spt2-mutant של L. major promastigotes בהשוואה לשימוש ב-M199 ללא סרום, מדיה בסיסית המשמשת להפצת L. promastigotes גדולים במבחנה. זה מצביע על כך שיש רכיב ציטו-מגן אחד או יותר ב-M199. שני חומרים פוטנציאליים להגנה מפני ציטו-ציטו-הם גליצין או אלנין, שהם ציטו-פרוטקטור במערכות אחרות של יונקים27,28. בסך הכל, בדיקת ציטוטוקסיות ציטומטריה של זרימה מספקת פלטפורמה גמישה לניתוח רעלנים שונים, תנאים וגנוטיפים של טפילים.
הצימוד של הבדיקה הציטומטרית של הזרימה עם מודלים לוגיסטיים מספק מידע משופר על רגישות התאים ל- PFTs. ראשית, יחידות המוליטיות שימשו במקום מסה עבור רעלים פעילים. זה איפשר נורמליזציה של הנתונים על פני תכשירי רעלנים שונים ותוצאות בדיקה עקביות ואיפשר השוואה ישירה של הרג בין רעלים למטרות. בעוד שליזיס ספציפי שימש לניתוח תרומתו של הרעלן לקטלניות, הבקרות הדרושות לכל מצב מספקות מידע על הרג בסיסי. אם סוכן הוא רעיל במיוחד, הוא יופיע בבקרות אלה. תזה ספציפית על פני ריכוזים מרובים מאפשרת יצירת עקומת מינון-תגובה. עקומות מינון-תגובה חיוניות לפענוח פעילות רעלנים. במקרים רבים, מעבדות ידווחו על הבדלים ברגישות לרעלנים בריכוז אחד. בהתאם לחלק של עקומת המינון-תגובה שנבחרה, הבדל זה עשוי להיות מעוות כדי לתת כל רושם של רגישות או התנגדות הרצויה. ניתוח כל עקומות המינון-תגובה עשוי להיעשות באמצעות מודלים לוגיסטיים. מידול לוגיסטי הוא פשוט באמצעות תוכנה זמינה ומספק מידע נוסף על LC50, תלילות העקומה (k) והתזה המקסימלית (L). ניתן להשתמש בהבדלים בכל הפרמטרים הללו כדי לקבוע מובהקות סטטיסטית בין העקומות. שינויים בתזה מקסימלית עשויים להיות שימושיים עבור רעלנים פעילים חלקית, רעלנים לא פעילים או סוגי תאים עמידים. בסך הכל ניתנו שיטות כמותיות למדידת שינויים בציטוטוקסיות.
למרות היתרונות של שימוש במבחן ציטוטוקסיות ציטוטומטרי של זרימה כמותית בתפוקה בינונית, ישנן אזהרות שיש לקחת בחשבון בעת שימוש בבדיקה זו. יש לציין כי היעדר סרום מגביל את זמני הדגירה ל-1-2 שעות. בנקודות זמן מאוחרות יותר, מוות מרקע גבוה יותר מסבך את הפרשנות של התוצאות. הסרת הסרום נחוצה עבור CDCs כי הכולסטרול בסרום מעכב CDCs24. גורמים אחרים בסרום עשויים גם הם לשנות את רגישות התאים לרעלנים. אתגר נוסף הוא ריכוז הסידן המשמש בבדיקה. בעוד שמבחני תיקון ממברנות משתמשים בדרך כלל ב-2 mM Ca2 + כדי לחקות Ca2+ חוץ-תאי, מאגרי סידן גבוהים עלולים להסתכן בשקיעת סידן בציטומטר הזרימה, מה שעלול לגרום לגוש תאים ו/או לסתום את המיקרופלואידיקה. ניקוי הציטומטר עם 2 mM EDTA לפני ניקוי עם Hellmanex III (ראו טבלת חומרים) ו/או אקונומיקה מפחית הצטברות Ca2+ . אזהרה אחרונה היא למודלים הלוגיסטיים. תוסף Solver לעיתים "ייתקע" בערך מינימלי מקומי שאינו מספק התאמה אופטימלית. במקרים אלה, שינוי ידני של הפרמטרים והפעלה מחדש של ה- Solver עשויים לשפר את המודל. כאשר העקומה הלוגיסטית המלאה אינה מסופקת, ה- Solver עשוי גם לבצע אקסטרפולציה של ערכים גדולים עבור L. חשוב לאסוף מספיק נקודות נתונים כדי ליצור עקומה לוגיסטית מלאה. אם לא ניתן למדל בקלות את עקומת המינון-תגובה באמצעות עקומה לוגיסטית, ערכי LC50 עשויים להישאר לא מוגדרים (לדוגמה, > 4,000 HU/mL), או שעקומה אחרת עשויה להתאים לנתונים.
לאחר שנקבע המינון התת-ליטי של SLO, ניתן היה לבדוק את התגובה התאית ל-SLO. הוכחה עקרונית ניתנה על ידי בדיקת נוגדנים במסלול MEK-ERK בל' מייג'ור מכיוון שהפעלת MEK שולטת ב~70% מהתיקון נגד SLO בתאי יונקים6. הנוגדן phospho-MEK זיהה פס ~ 120 kDa התואם ל- MRK1. זרחון חזק של ההומולוג LmxMKK, הצפוי ב-55 kDa, לא זוהה. עם זאת, הנוגדן MEK זיהה פסים התואמים הן ל-MRK1 והן ל-LmxMKK. הנוגדן phospho-ERK זיהה גם רצועות ב~120 kDa ו-55 kDa. רצועת 55 kDa תואמת את הגודל של MAPK5. נוגדן ה-ERK לא היה חזק בבדיקה זו. יהיה צורך בספקטרומטריית מסות או בשיטות אחרות כדי לאשר את זהותם של חלבונים אלה. הזרחון של הומולוגים לישמניאליים של MEK1/2 ו-ERK1/2 זוהה ללא תלות באתגר הרעלן. באופן כללי, מנה תת-ליטית של רעלן שנקבעה על ידי ציטומטריה של זרימה שימשה לאיתור קינאזות בבדיקה במורד הזרם, כמו כתם מערבי.
קיימות גם אזהרות עם ניתוחי הכתמים המערביים. יש לציין כי רוב הנוגדנים המסחריים אינם מגודלים באופן ספציפי נגד חלבונים לישמניאליים. במקום זאת, נוגדנים המכוונים להומולוגים באורגניזמים אחרים חייבים להיות מאומתים ומאומתים תחילה. הכנת המדגם עשויה להשפיע על תוצאת הכתם בסופו של דבר. יש להוסיף את החומר המצמצם במאגר הדגימה, 2-mercaptoethanol, מיד לפני הוספת מאגר דגימת SDS לכדור התא. בעוד שכדורי תאים שעברו החייאה עשויים להיות מאוחסנים בטמפרטורה של −20° צלזיוס, הם אינם שורדים מחזורי הקפאה/הפשרה רבים. נוגדנים ראשוניים המכוונים לחלבונים הומולוגיים כגון MAPK בלישמניה צריכים להיות מודגרים עם הכתמים למשך הלילה עבור רצועות איכותיות יותר על כתמים מערביים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות של המכונים הלאומיים לבריאות מעניק R21AI156225 ל- PAK ו- KZ (co-I) ו- R01AI139198 ל- KZ (co-I). CH רוצה להודות למחלקה למדעי הביולוגיה על עוזר ההוראה שניתן במהלך המחקר הזה.
לסוכנויות המימון לא היה כל תפקיד בתכנון המחקר; באיסוף, ניתוח או פרשנות של נתונים; בכתיבת כתב היד; וגם לא בהחלטה לפרסם את התוצאות. התוכן הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את העמדות הרשמיות של הגורמים המממנים. המחברים מצהירים שאין להם ניגודי עניינים מתחרים.
Acknowledgments
המחברים רוצים להודות לחברי מעבדות קייל וג'אנג על הסקירה הביקורתית של כתב היד. המחברים מודים למיקרוסקופיה של המכללה לאמנויות ומדעים על השימוש במתקנים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.2 mL microtiter (Marsh) tubes | Fisher | 02-681-376 | Cytotoxicity assay |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Fisher | 05-408-129 | Toxin dilutions |
| 15 mL centrifuge tube | Avantor VWR (Radnor, PA) | 89039-666 | To hold cells and media |
| 1x Phosphate buffered saline (PBS) | Fisher | BP399 | For cell processing |
| 3% H2O2 | Walmart (Fayetteville, AR) | N/A | For ECL |
| 5x M199 | Cell-gro | 11150067 | Basal growth media for L. major promastigotes |
| Biosafety cabinet | Baker | To culture cells in sterile conditions | |
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher | BP1605-100 | Fraction V acceptable purity |
| CaCl2 | Fisher | BP510-100 | Stock concentration 100 mM |
| Centrifuge | Thermo Fisher | Heraeus Megafuge 40R | To pellet the cells from culture |
| Cy5 Mono-reactive dye pack | Cytiva (Marlborough, MA) | PA25031 | Fluorophore label for toxins |
| Digital dry bath | Benchmark | BSH1002 | To denature protein samples |
| EGTA | Amresco | 0732-100G | Stock concentration 0.5 M |
| Excel | Microsoft (Redmond, VA) | Data analysis software | |
| Flow cytometer (4-laser Attune NxT) | Fisher | Cytometer for data acquisition | |
| FlowJo | BD (Ashland, OR) | Software | |
| Formaldehyde | Fisher | BP531-500 | Fixative for counting cells |
| G418 | Fisher | BP673-1 | Selection agent for cells |
| Hellmanex III | Sigma | Z805939 | Dilute 1:4 for cleaning cytometer |
| Hemacytometer | Fisher | 0267151B | For counting cells |
| Human red blood cells | Zen-bio (Durham, NC) | SER-10MLRBC | To validate toxin activity |
| Ice bucket | |||
| Light microscope | Nikon | Eclipse 55i | To visualize cells |
| Nitrocellulose | Fisher | 88018 | For probing proteins via antibodies |
| Pipettors and tips | Avantor VWR | To dispense reagents | |
| Power supply | Bio-Rad | To run SDS-PAGE and transfers | |
| Propidium iodide | Biotium | 40016 | Stock concentration 2 mg/mL in water |
| Protein ladder | Bio-Rad | 161-0373 | To determine molecular weight of proteins |
| SDS-PAGE Running Apparatus (Mini Protean III) | Bio-Rad | 165-3302 | To separate proteins based on their size |
| Sealing tape | R&D | DY992 | To seal plates with cells |
| Streptolysin O C530A plasmid insert | Cloned into pBAD-gIII vector (Reference: 7) | ||
| Streptolysin O C530A toxin | Lab purified | Specific activity 4.34 x 105 HU/mg | |
| Swinging bucket rotor | Thermo Fisher | 75003607 | To centrifuge cells |
| V-bottom plate | Greiner Bio-one | 651206 | For cytotoxicity assay |
| Vortex | Benchmark | BV1000 | To mix cells |
| Western blot imaging system (Chemi-doc) | Bio-Rad | To visualize proteins by western blot | |
| Western Blot Transfer Apparatus (Mini Protean III) | Bio-Rad | 170-3930 | Transfer proteins to nitrocellulose |
| Whatman Filter paper | GE Healthcare Life Sciences | 3030-700 | Used in transfer of proteins to nitrocellulose |
| Antibody | |||
| Anti-ERK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9102S | Rabbit (1:1000 dilution) |
| Anti-lipophosphoglycan (LPG) antibody | CreativeBioLabs | Cat# WIC79.3 | Mouse (1: 1000) |
| Anti-MEK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9122L | Rabbit (1:1000) |
| Anti-mouse IgG, HRP conjugate | Jackson Immunoresearch | Cat#715-035-151 | Donkey (1:10000) |
| Anti-phosphoERK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9101S | Rabbit (1:1000) |
| Anti-pMEK antibody | Cell Signaling Technologies | Cat# 9121S | Rabbit (1:1000) |
| Anti-rabbit IgG, HRP conjugate | Jackson Immunoresearch | Cat#711-035-152 | Donkey (1:10000) |
| Anti-tubulin antibody | Sigma | Cat# T5168 | Mouse (1: 2000) |
| Leishmania major Genotypes | Reference: 13 | ||
| Episomal addback (spt2-/+SPT2) | Δspt2::HYG/Δspt2:PAC/+pXG-SPT2 | ||
| Serine palmitoyltransferase subunit 2 knockout (spt2-) | Δspt2::HYG/Δspt2::PAC | ||
| Wild type (WT) | LV39 clone 5 (Rho/SU/59/P) |
References
- Thapa, R., Ray, S., Keyel, P. A. Interaction of macrophages and cholesterol-dependent cytolysins: The impact on immune response and cellular survival. Toxins. 12 (9), 531 (2020).
- Limbago, B., Penumalli, V., Weinrick, B., Scott, J. R. Role of streptolysin O in a mouse model of invasive group A streptococcal disease. Infection & Immunity. 68 (11), 6384-6390 (2000).
- Farrand, A. J., et al. The cholesterol-dependent cytolysin membrane-binding interface discriminates lipid environments of cholesterol to support beta-barrel pore insertion. Journal of Biological Chemistry. 290 (29), 17733-17744 (2015).
- Soltani, C. E., Hotze, E. M., Johnson, A. E., Tweten, R. K. Structural elements of the cholesterol-dependent cytolysins that are responsible for their cholesterol-sensitive membrane interactions. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (51), 20226-20231 (2007).
- Schoenauer, R., et al. Down-regulation of acid sphingomyelinase and neutral sphingomyelinase-2 inversely determines the cellular resistance to plasmalemmal injury by pore-forming toxins. FASEB Journal. 33 (1), 275-285 (2019).
- Ray, S., Roth, R., Keyel, P. A. Membrane repair triggered by cholesterol-dependent cytolysins is activated by mixed lineage kinases and MEK. Science Advances. 8 (11), (2022).
- Babiychuk, E. B., Monastyrskaya, K., Draeger, A. Fluorescent annexin A1 reveals dynamics of ceramide platforms in living cells. Traffic. 9 (10), 1757-1775 (2008).
- Jimenez, A. J., et al. ESCRT machinery is required for plasma membrane repair. Science. 343 (6174), 1247136 (2014).
- Demonbreun, A. R., et al. An actin-dependent annexin complex mediates plasma membrane repair in muscle. Journal of Cell Biology. 213 (6), 705-718 (2016).
- Wolfmeier, H., et al. Ca(2)(+)-dependent repair of pneumolysin pores: A new paradigm for host cellular defense against bacterial pore-forming toxins. Biochimica et Biophysica Acta. 1853 (2), 2045-2054 (2015).
- Bravo, F., Sanchez, M. R. New and re-emerging cutaneous infectious diseases in Latin America and other geographic areas. Dermatologic Clinics. 21 (4), 655-668 (2003).
- Manfredi, M., Iuliano, S. Cutaneous leishmaniasis with long duration and bleeding ulcer. Clinical Microbiology Open Access. 05, 2-6 (2016).
- Zhang, K., et al. Sphingolipids are essential for differentiation but not growth in Leishmania. EMBO Journal. 22 (22), 6016-6026 (2003).
- Zhang, K. Balancing de novo synthesis and salvage of lipids by Leishmania amastigotes. Current Opinions in Microbiology. 63, 98-103 (2021).
- Kaur, P., Goyal, N. Pathogenic role of mitogen activated protein kinases in protozoan parasites. Biochimie. 193, 78-89 (2022).
- Wiese, M. Leishmania MAP kinases--Familiar proteins in an unusual context. International Journal of Parasitology. 37 (10), 1053-1062 (2007).
- Brumlik, M. J., Pandeswara, S., Ludwig, S. M., Murthy, K., Curiel, T. J. Parasite mitogen-activated protein kinases as drug discovery targets to treat human protozoan pathogens. Journal of Signal Transduction. 2011, 971968 (2011).
- Wiese, M., Kuhn, D., Grunfelder, C. G.
- Agron, P. G., Reed, S. L., Engel, J. N. An essential, putative MEK kinase of Leishmania major. Molecular Biochemistry of Parasitology. 142 (1), 121-125 (2005).
- Ray, S., Thapa, R., Keyel, P. A. Multiple parameters beyond lipid binding affinity drive cytotoxicity of cholesterol-dependent cytolysins. Toxins. 11 (1), (2018).
- Beneke, T., et al. A CRISPR Cas9 high-throughput genome editing toolkit for kinetoplastids. Royal Society Open Science. 4 (5), 170095 (2017).
- Kapler, G. M., Coburn, C. M., Beverley, S. M. Stable transfection of the human parasite Leishmania major delineates a 30-kilobase region sufficient for extrachromosomal replication and expression. Molecular and Cellular Biology. 10 (3), 1084-1094 (1990).
- Moitra, S., Pawlowic, M. C., Hsu, F. F., Zhang, K. Phosphatidylcholine synthesis through cholinephosphate cytidylyltransferase is dispensable in Leishmania major. Scientific Reports. 9, 7602 (2019).
- Keyel, P. A., Heid, M. E., Watkins, S. C., Salter, R. D. Visualization of bacterial toxin induced responses using live cell fluorescence microscopy. Journal of Visualized Experiments. (68), 4227 (2012).
- Romero, M., et al. Intrinsic repair protects cells from pore-forming toxins by microvesicle shedding. Cell Death & Differentiation. 24 (5), 798-808 (2017).
- Keyel, P. A., et al. Streptolysin O clearance through sequestration into blebs that bud passively from the plasma membrane. Journal of Cell Science. 124, 2414-2423 (2011).
- Dong, Z., Patel, Y., Saikumar, P., Weinberg, J. M., Venkatachalam, M. A. Development of porous defects in plasma membranes of adenosine triphosphate-depleted Madin-Darby canine kidney cells and its inhibition by glycine. Laboratory Investigations. 78 (6), 657-668 (1998).
- Loomis, W. P., den Hartigh, A. B., Cookson, B. T., Fink, S. L. Diverse small molecules prevent macrophage lysis during pyroptosis. Cell Death & Disease. 10 (4), 326 (2019).
