Aptamer tabanlı hedef tespiti, 3 aşamalı G-dörtlü izotermal üstel amplifikasyon reaksiyonu ile kolaylaştırılmıştır

Summary

Mevcut protokol, hedefleri tespit etmek için hızlı, 3 aşamalı, aptamer tabanlı üstel amplifikasyon testinin kullanımını göstermektedir. Numune hazırlama, sinyal amplifikasyonu ve renk gelişimi, kafein üzerinde teofilin varlığını tanımak için bu sistemi uygulamak için ele alınmıştır.

Abstract

Aptamerler, yüksek afinite ve özgüllükle bağlanan hedef tanıma molekülleridir. Bu özellikler, sinyal üretme kabiliyetine sahip diğer molekülleri kontrol etmek için kullanılabilir. Burada açıklanan sistem için, modifiye edilmiş bir çekiç kafalı ribozimin Kök II'si olan aptamerik bir alan aracılığıyla hedef tanıma, başlangıçta yapılandırılmamış yapıyı stabilize ederek kendiliğinden yarılan ribozimi aktive eder. Cis-cleaving RNA, Kök III ve Kök I'in birleşme noktasında hareket eder ve iki bölünme ürünü oluşturur. Daha uzun bölünme ürünü, iki benzer katalitik olarak aktif G-dörtlüsünün izotermal üstel amplifikasyon reaksiyonunu (EXPAR) hazırlar. Ortaya çıkan bu amplifikasyon ürünleri, çıplak gözün algılayabileceği bir çıkışla kolorimetrik bir substratın indirgenmesine bağlı olan peroksidaz indirgemesini katalize eder. Bu çalışmada açıklanan 3 parçalı sistem, enzime bağlı immünosorbent tahlilleri (ELISA'lar) gibi tespit yöntemlerini, 15 dakika gibi kısa bir sürede 0.5 μM teofilin kadar düşük bir sürede varlığını göstermek için görsel olarak tespit edilebilir bir sinyal üreterek geliştirir.

Introduction

Aptamerler tipik olarak, istenen hedeflere yüksek bağlanma afinitesi ve özgüllüğü olan evrimsel bir süreçle seçilen tek sarmallı DNA veya RNA'dır¹. Bağlama kabiliyetine ek olarak, aptamerler sinyal çıkış fonksiyonları^2,3 ile motiflere bağlanabilir ve kontrol edilebilir^, bu da söz konusu sinyali yükseltir ve sistemin hassasiyetini arttırır. G-dörtlü izotermal üstel amplifikasyon reaksiyonu (GQ-EXPAR) sistemi, görsel bir çıktı^üretmek için tek bir reaksiyon kabına ardışık bileşenler eklendikçe görsel bir sinyal geliştiren üç parçalı bir sistemdir (Şekil 1). Bu sistem, ilgilenilen bir hedefin hızlı ve spesifik bir şekilde tespit edilmesini sağlamak için kolaylaştırılmış bir iş akışı kullanarak belirli bir numunedeki belirli bir hedefin, burada teofilin 15 dakika içinde tespit edilmesini sağlar. Bu yöntem, hedef konsantrasyonun spesifik niceliğinin, kısa sürede yanıtın yüksek özgüllüğünden daha düşük bir endişe kaynağı olduğu numuneler için düşünülmelidir.

Bir allosterik riboswitch, kendi kendine bölünmeye uğrayan bir yapı değiştiren RNA molekülü (ribozim), başlangıç sinyalini üretir. Bu yapı, Kök II'de bölünme aktivitesinin düzenleyicisi olarak tanıtılan aptamerik bir alana sahip çekiç kafalı ribozime dayanmaktadır. Kendi kendine bölünme fonksiyonu, aptamerik alanı hedef^5'e bağlandığında stabilize edildiğinde aktive olur. Aksi takdirde, anahtar yerel durumunda etkin değildir.

Sonraki üstel amplifikasyon reaksiyonu (EXPAR), bir izotermal amplifikasyon reaksiyonu^6'yı asal hale getirmek için kendinden parçalanmış RNA ipliğinin ilk aşamadan salınmasını kullanır. EXPAR'ın amplifikasyon ürünü, sistemin son aşaması için temel görevi gören peroksidaz aktivitesi^7'ye sahiptir. Bazı substratlar peroksit parçalanması ile birlikte oksitlendiğinde, çeşitli enstrümantasyonda ölçülebilen bir floresan çıkışı üretirler. Diğer yaygın substratlar, görsel algılama için renkli bir ürün üretmek üzere değiştirilebilir. EXPAR ve amplifikasyon ürünlerinin peroksidaz aktivitesi, 2 aşamalı bir sinyal arttırıcı olarak işlev görür ve geleneksel stratejilere kıyasla duyarlılığı daha yüksek seviyelere çıkarır ^7,8.

Teofilin kafeine karşı teofilin tespiti, sadece tek bir metil grubuna göre farklılık gösterdikleri için bu algılama platformunun özgüllüğünün bir örneği olarak kullanılır (Şekil 2). Sistemin bu gösterimi, en az 500 nM teofilin görsel tespiti için kolorimetrik bir çıktı üretir.

Protocol

Reaksiyon bileşenlerinin spesifik hacimleri ve konsantrasyonları dahil olmak üzere tüp hazırlama için Ek Tablo 1'e (reaksiyon kurulum tablosu) bakınız. Burada gösterilen protokol, Malzeme Tablosunda açıklandığı gibi önceden monte edilmiş bir algılama platformu kiti kullanır. Aksi belirtilmedikçe tüm bileşenler buz üzerinde tutulmalıdır.

1. Ribozimin hazırlanması

NOT: Birincil tespit bileşeni, teofilini tanıyan allosterik (aptamer regüle edilmiş) bir ribozimdir (bakınız Ek Tablo 2).

1. Ribozim bölünme ürünlerini aktive etmek için kullanılacak bir PCR tüpünde 5 U T4 polinükleotid kinaz (0.5 μL, Malzeme Tablosuna bakınız) toplayın.
   NOT: Bu bileşen ilk önce eklenir, böylece kullanıcı enzimin doğru dağılımını görebilir.
2. Her numune tüpüne (PCR tüpü) 1 μL önceden hazırlanmış 5x ribozim tamponu (bkz.
3. Özgüllüğü görsel olarak göstermek amacıyla, test numuneleri olarak her numune tüpüne 1,5 μL 2 mM teofilin (hedef) veya 2 mM kafein (kontrol) (bakınız Malzeme Tablosu) ekleyin.
   NOT: Standart bir eğri oluşturmak için, 3,125 mM analitten başlanması ve 0,001 mM'ye kadar beş kat seyreltmenin test edilmesi önerilir.
4. Her numune tüpünü 5-10 kez pipetleyerek iyice karıştırın.
5. 5 μL test çözeltisinde 240 nM'lik nihai konsantrasyon elde etmek için her numune tüpüne hedefe özgü bir aptamerik alan içeren 2 μL 600 nM RNA ekleyin (bkz. Malzeme Tablosuna bakınız), ardından pipetleme ile hızlı bir şekilde karıştırın ve arka plan sinyalini en aza indirmek için soğuk bir bloğa yerleştirin.
   NOT: Başlangıçta tüm reaksiyonları ribozim olmadan hazırlamak önemlidir, çünkü ribozim ribozim tamponu ile birleştirildiğinde kendiliğinden bölünme reaksiyonu hemen başlayacak ve önemli bir arka plan oluşturabilir.
6. Tüm reaksiyon tüpleri hazırlandıktan sonra, her bir numuneyi (5 μL) oda sıcaklığında (23 ° C) bir zamanlayıcı kullanarak tam olarak 3 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyondan sonra numune tüplerini derhal buza (4 ° C) geri getirin.

2. GQ-EXPAR

1. Her numune tüpüne 3,5 μL nickaz-polimeraz enzim karışımı ekleyin (bakınız Malzeme Tablosu) ve iyice karıştırın.
   NOT: Gerekli enzim konsantrasyonları, kombinasyonu ampirik olarak belirlenen tanıma dizilerine, enzim tiplerine ve reaksiyon sıcaklıklarına bağlıdır.
2. Karıştırılacak her numune tüpüne ve pipete şablon, nükleotitler ve reaksiyon tamponu içeren 31,5 μL EXPAR reaksiyon karışımı ekleyin (bkz.
   NOT: Bileşen konsantrasyonları, polimeraz ürünlerinin enzimlerine ve dizilerine göre optimize edilmiştir.
3. Tüm numuneler hazırlandıktan sonra, hazırlanan her numuneyi (40 μL) bir zamanlayıcı kullanarak tam olarak 5 dakika boyunca 55 ° C'de inkübe edin. Mümkünse, ısıtılmış bir kapak gereksiz olsa da, bir termosiklet üzerinde inkübe edin.
4. İnkübasyon adımından sonra numune tüplerini derhal buza (4 ° C) geri getirin.

3. Renk geliştirme

1. Her numune tüpüne 2 μL Hemin çözeltisi (25 uM, Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve iyice karıştırın.
2. Her numune tüpüne ticari olarak temin edilebilen TMB çözeltisinden 58 μL ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve iyice karıştırın.
3. Renk geliştirme reaksiyonunu (100 μL) oda sıcaklığında en az 3 dakika ve 30 dakikaya kadar inkübe edin.
   NOT: (İsteğe bağlı) 20 μL 2 M sülfürik asit eklenerek renk gelişimi durdurulabilir.
4. Numuneleri gözle kalitatif olarak okuyun veya renk geliştirme reaksiyonları sülfürik asit kullanılarak durdurulursa 450 nm'de bir absorbans plakası okuyucusu kullanarak sonuçları ölçün.

Representative Results

Şekil 1'de gösterilen tespit platformu, aptamerik hedef tanımayı kısa bir süre içinde numune preparatları (hedef ve hedef olmayan, Şekil 2) arasında görsel olarak farklı farklılıklara dönüştürür. Soukup ve ^ark.5 tarafından tanımlanan allosterik bir ribozim, kontrol ve negatif numuneler üzerindeki hedefe yanıt veren daha az gürültülü bir dizi oluşturmak için başlangıç noktası olarak hizmet etti. Optimize edilmiş yapı, 30 dakika içinde 500 nM teofilin kadar azını tanıyabildi (Şekil 3) - hedefe maruz kalan numune preparatları 3. adımda mavi bir renk üretirken, hedef içermeyen numuneler renksiz kalır. Gerekirse, bu sonuçlar önce adım 3.4'te açıklandığı gibi renk geliştirme reaksiyonunu durdurarak ve daha sonra mevcut hedefin başlangıç konsantrasyonunu ölçmek için elde edilen ürünün 450 nm'de emilimini okuyarak ölçülebilir. Bu işlemin tipik sonuçları, ilk numunede bulunan hedefin konsantrasyonunu nicel olarak tahmin etmek için doğrusal olmayan bir regresyona takılabilen Tablo 1'de sunulmuştur (Şekil 4).

Resim 1: GQ-EXPAR sistemi. Algılama ve sinyal yükseltme sisteminin mekanizmaları. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Aptamer hedefi ve karşı hedef. Özgüllüğün bir gösterimi olarak teofilin (hedef) ve kafeinin (karşı hedef kontrolü) moleküler yapısı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: GQ-EXPAR görsel sonuçları. 3 dakika ve 30 dakikalık renk gelişiminden sonra çeşitli teofilin konsantrasyonlarını tespit etmek için sistemin temsili sonuçları. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Temsili teofilin standart eğrisi. Sistem sinyalinin standart eğrisi, 30 dakikalık renk gelişiminden sonra A450'de ölçülmüştür. Ham veriler Tablo 1, N = 3'te sunulmuştur. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayın.

[Teofilin] (mM)	Deneme 1 (A450)	Deneme 2 (A450)	Deneme 3 (A450)	Ortalama (A450)
3.125	0.342	0.318	0.39	0,350 ± 0,0299
0.625	0.321	0.303	0.317	0,314 ± 0,00772
0.125	0.263	0.264	0.287	0,271 ± 0,0111
0.025	0.221	0.215	0.234	0,223 ± 0,00793
0.005	0.168	0.167	0.184	0,173 ± 0,00779
0.001	0.134	0.115	0.138	0,129 ± 0,0100
0	0.107	0.104	0.117	0,109 ± 0,00556
Ribozyme yok	0.095	0.088	0.129	0,104 ± 0,0179

Tablo 1: Temsili teofilin standart eğrisi ham verileri. 30 dakikalık renk gelişiminden sonra çeşitli teofilin konsantrasyonlarını tespit etmek için sistemin sonuçları. No-ribozim örnekleri de değerlendirildi, N = 3.

Ek Tablo 1: GQ-EXPAR kurulumu. GQ-EXPAR reaktif hacimlerinin özeti ve protokolde açıklandığı gibi ekleme sırası. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Tablo 2: GQ-EXPAR oligonükleotid dizileri. DNA ve RNA moleküllerinin dizilimleri algılama reaksiyonlarında kullanılır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Discussion

Burada sunulan yöntem, allosterik bir ribozimde başlangıçta düzensiz bir ikincil yapı ile cis-yarık çekiç kafası ribozimini aktive etmek için hedefin aptamerik alana bağlanması yoluyla sağlanan ek stabilite arasındaki geçişten yararlanır. Ribozimin stabilitesi, hedefin yokluğunda katalitik aktiviteyi en aza indirgemek için ayarlanırken, hedef bağlamanın aktif yapıyı restore etmesine izin verdi. Ek olarak, EXPAR ve renk gelişimini kolaylaştırmak için gerekli çoklu enzimlerin tamponlarını dengelemek için özen gösterilmelidir. Son olarak, bunun 3 aşamalı bir sistem olduğu göz önüne alındığında, inkübasyon sürelerinin ve sıcaklıkların reaksiyon bileşenlerinin konsantrasyonları ile birlikte kombinasyonu, gürültüyü en aza indirirken sinyali en üst düzeye çıkarmanın küçük bir zorluk olmadığı anlamına geliyordu.

Ribozimin hazırlanması sırasında (adım 1), aptamerik alana hedef bağlanma, kendiliğinden ayrılan ribozimin yapısını stabilize eder. Buna rağmen, ribozim, bir hedefin yokluğunda bile, ribozim tamponuna bir kez sokulduktan sonra yarılabilecektir. Bu nedenle, arka plan sinyalini en aza indirmek için, reaksiyonları tanımlanmış inkübasyona hazır olana kadar buz üzerinde tutmak hayati önem taşır. Hedefin aptamerik alana başarılı bir şekilde bağlanması ve bunun sonucunda ortaya çıkan bölünme olayı, Şekil 1, aşama 1'de gösterildiği gibi iki bölünme ürünü üretir: Kök I'in kısa bir segmenti ve terminal siklik fosfat⁸ ile yeni maruz kalan bir Kök III segmenti. Numune karışımında bulunan T4 polinükleotid kinaz, döngüsel fosfatı, aşama 2'deki amplifikasyon reaksiyonu için bir astar görevi gören Kök III bölünme ürününden uzaklaştırır. Bu sistemde kullanılan reaktiflerin konsantrasyonları ve hacimleri, arka plan sinyalini spesifik yanıt^4'e karşı değerlendirmek için yapılan deneylere dayanarak optimize edilmiştir ve hangi nokta değişiklikleri yapılırsa yapılsın başlayarak optimize edilmesi gerekecektir. Ek olarak, standart bir eğri oluşturmak için en yüksek konsantrasyon olarak 3.125 mM teofilin önerilmektedir, çünkü bu numuneden kaynaklanan renk gelişimi 450 nm'de mümkün olan maksimum emilime yakındır (Şekil 4). GQ-EXPAR sisteminin bu hazırlığı için standart eğriyi belirlemek için sıradan en küçük karelerle doğrusal olmayan bir regresyon kullanılır.

2. adımda gerçekleştirilen GQ-EXPAR, iki DNA şablonu kullanır: biri Kök III bölünme ürünü tarafından astarlanan ve G-dörtlü üreten ve diğeri G-dörtlü tarafından astarlanan ve G-dörtlü üreten. İlk reaksiyon ikincisinden daha önemlidir, çünkü Stem III bölünme ürününü G-dörtlülerine çevirmek kolorimetrik bir çıktı üretmek için gereklidir, G-dörtlü kendi kendine amplifikasyon zaten mevcut olan sinyali arttırır. Bst 2.0 DNA polimeraz, izotermal amplifikasyonu gerçekleştirir ve iplikçik-yer değiştirme aktivitesine sahipken, Nt. BstNBI nickaz, Bst 2.0'ın daha önce üretilen ürünün yerini almasına ve daha fazla G-dörtlü amplikon üretmesine izin vermek için G-dörtlü diziliminden önce ayrılır. Tampon ayrıca amplifikasyon ürününün aktif G-dörtlü formuna katlanmasını sağlayan K ⁺ 'yı da sağlar. Farklı nikazların bağlanma ve kesme için farklı tanıma dizileri vardır ve spesifik enzimler farklı kesme verimliliklerine sahip olacaktır; Tanıma/takma ad verme sitesindeki sırayı değiştirmek, nickazda bir değişiklik yapılmasını ve 2. adımın yeniden optimize edilmesini gerektirecektir.

3. adımda, G-dörtlüleri, özellikle hemin⁷ ile ilişkili olduğunda, peroksidaz aktivitesine sahip DNAzymler olarak işlev görebilir. Peroksitin indirgenmesi, görselleştirme veya nicelleştirme için tespit edilebilir bir sinyal üretmek üzere TMB gibi substratın oksidasyonu ile birleştirilir.

Bu sistemdeki temel sınırlama, allosterik ribozimin üretebileceği gürültüdür. Aktif, kendi kendini parçalayan yapı, hedefin yokluğunda (bu durumda, teofilin) kararlı olmasa da, RNA farklı konfigürasyonları örnekleme fırsatına sahiptir ve yanlışlıkla aktif konfigürasyon^4'e erişebilir. Bu, aşama 2 ve aşama 3'te bulunan sinyalin amplifikasyonu ile birleştiğinde, yanlış pozitif bir sinyal üretebilir. Bu nedenle, RNA, tampon ve enzim miktarlarının optimizasyonu yoluyla sistemin aktivitesini mümkün olduğunca azaltmak, ayrıca hedef aracılı olmayan RNA bölünme olaylarının üretimini sınırlamak için inkübasyon sürelerini ve sıcaklıklarını en aza indirmek hayati önem taşımaktadır.

Bir GQ-EXPAR iş akışını optimize etmenin zorluğuna rağmen, sistem kurulduktan sonra oldukça çok yönlü olabilir. Çeşitli aptamer kontrollü allosterik ribozimler zaten tanımlanmıştır⁹ ve istenen işlevsellik için optimize edilebilir⁵. Aptamers¹⁰ tarafından modüle edilen allosterik DNAzyme'lerin geliştirilmesinde de ilerleme kaydedilmiş ve bu platforma entegre edilebilecek kimyasallar genişletilmiştir. Sistemin hedef tanıma şeklini değiştirmek için bu seçenekler değerlendirilmemiştir ve gelecekteki çalışmaların odak noktası olacaktır. Ek olarak, sistemin temel bileşenleri, polimeraz için daha düşük inkübasyon sıcaklıkları veya nickaz için farklı tanıma dizileri gibi farklı aktivite gereksinimlerine sahip eşdeğer malzemelerle değiştirilebilir. Bu sistemin esnekliği ve modülerliği, çok çeşitli girişlere uyum sağlamasına izin verir.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine dihydrochloride (TMB) solution with H2O2, "MaxSignal TMB Microwell Substrate Solution"	PerkinElmer	FOOD-1806-1000	Color development reagent. Minimize exposure to light and atmosphere. Previously BIOO Scientific catalog number 1806. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-2.
5’- TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TTC CCT CCC TCC CTC CCA GA-Biotin-3’	Integrated DNA Technologies (IDT)	Custom	Optimized QtQ47 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by G-quadruplex. This is used for the "exponential" part of EXPAR, to rapidly increase the amount of DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
5’-GGG AAC UAU ACA ACC UAG GGC GAC CCU GAU GAG CCU UAU ACC AGC CGA AAG GCC CUU GGC AGA CGU UGA AAC GGU GAA AGC CGU AGG UUG CCC UAG GUU GUA UAG UU-3’	Integrated DNA Technologies (IDT)	Custom	Theophylline-recognizing allosteric ribozyme sequence (self-cleaving ribozyme regulated by RNA aptamer domain for theophylline) modified from Soukup et al. Soukup, G. A., Emilsson, G. A., and Breaker, R. R. (2000) Altering molecular recognition of RNA aptamers by allosteric selection, Journal of molecular biology 298, 623-632. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-3.
5’-TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TAC GGC TTT CAC CGT TTC AAC G-Biotin-3’	Integrated DNA Technologies (IDT)	Custom	Optimized P3tQ49 DNA template for EXPAR to produce G-quadruplex, primed by P3 cleavage product. This is used in Step 2 to translate the cleavage product into DNAzyme used for Step 3 color development. Template includes a 3'-biotin to prevent unintended extension by Bst 2.0 DNA polymerase during EXPAR. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
5x Ribozyme Buffer	Aptagen, LLC	N/A	5x composition: 600 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM MgCl2, 25 mM DTT. Used in Step 1. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-4.
Apta-beaconTM (GQ-EXPAR, TMB) Demonstration Kit	Aptagen, LLC	GQ-EXPAR-TMB	The demo kit showcases the specificity of the colorimetric assay by detecting difficult small molecule targets, theophylline versus caffeine, which only differ by a single methyl group.
Bst 2.0 DNA polymerase	New England Biolabs	M0537S	Isothermal amplification polymerase with strand-displacement activity. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 9.375 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1.
Buffer 3.1	New England Biolabs	B6003SVIAL	Combined with 2 uL of 10X Isothermal Amplification Buffer and 27.5 uL of nuclease-free water to produce 1.11X EXPAR Buffer in EXPAR Mix. This product replaces the previously-used B7203SVIAL that was part of the initial system development (same composition except non-recombinant BSA). Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
Caffeine	Sigma-Aldrich	C0750-100G	Aptamer counter-target (control), prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-1.
dNTPs	New England Biolabs	N0447S	Part of the EXPAR reaction mixture. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
EXPAR reaction mixture	Aptagen, LLC	N/A	0.44 mM dNTPs, 0.38 μM P3tQ49, 0.38 μM QtQ47, 44.44 mM Tris-HCl (pH 8.4), 63.5 mM NaCl, 31.5 mM KCl, 6.35 mM MgCl2, 1.27 mM MgSO4, 6.35 mM (NH4)2SO4, 63.5 μg/ml BSA, 0.0635 % Tween 20. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
Hemin	Sigma-Aldrich	H9039	Resuspended in DMF to a final concentration of 25 uM. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 3-1.
Isothermal Amplification Buffer	New England Biolabs	B0537SVIAL	Combined with 2 uL of 10x Buffer 3.1 and 27.5 µL of nuclease-free water to produce 1.11x EXPAR Buffer in EXPAR Mix. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-2.
MgCl2	Amresco (VWR)	E525-500ML	Hammerhead ribozyme cofactor, necessary for self-cleavage. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-3.
MJ PTC-100 Thermocycler	MJ Research, Inc.	PTC-100	Thermocycler to control incubation temperatures. Any thermocycler or hot block can be used.
N, N-Dimethylformamide (DMF)	Sigma-Aldrich	227056-100ML	Used to resuspend hemin and maximize shelf life in freezer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 3-1.
Nickase-polymerase Mix	Aptagen, LLC	N/A	Nt.BstNBI (9.375 units/μL) and Bst 2.0 DNA polymerase (0.5 units/μL). Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 2-1.
Nt.BstNBI	New England Biolabs	R0607S	Nicking enzyme to allow continued isothermal amplification. Part of the Nickase-Polymerase Mix, prepared at 0.5 U/uL. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 2-1.
T4 Kinase Buffer	New England Biolabs	B0201SVIAL	Buffer for enzyme necessary to remove cyclic phosphate. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4.
T4 polynucleotide kinase	New England Biolabs	M0201S	Removes cyclic phosphate post-cleavage to allow cleavage product to prime isothermal amplification reaction. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as PCR Tubes.
Tecan GENios FL	Tecan	Genios-FL TWT	Plate reader to measure absorbance signal from Step 3 results.
Theophylline	Sigma-Aldrich	T1633-50G	Aptamer target, prepared with nuclease-free water. Supplied in Apta-beacon Demonstration Kit as Tube 1-2.
Tris-HCl	American Bioanalytical	AB14043-01000	Aptamer binding buffer. Part of Apta-beacon Demonstration Kit Tube 1-4.