Una técnica de alto rendimiento basada en citometría de flujo para el cribado de fármacos inhibidores de integrinas

Summary

Este protocolo describe un método de cribado de alto rendimiento basado en citometría de flujo para identificar fármacos de moléculas pequeñas que inhiben la activación de la integrina β2 en neutrófilos humanos.

Abstract

Este protocolo tiene como objetivo establecer un método para identificar pequeños antagonistas moleculares de la activación de integrinas β2, utilizando anticuerpos que informan de cambios conformacionales y citometría de flujo de alto rendimiento. El método también puede servir como guía para otros métodos de cribado de alto rendimiento basados en anticuerpos. Las integrinas β2 son moléculas de adhesión específicas de los leucocitos que son cruciales en las respuestas inmunitarias. Los neutrófilos dependen de la activación de la integrina para salir del torrente sanguíneo, no solo para combatir infecciones, sino también para estar involucrados en múltiples enfermedades inflamatorias. El control de la activación de la integrina β2 presenta un enfoque viable para el tratamiento de las enfermedades inflamatorias asociadas a los neutrófilos. En este protocolo, se utiliza un anticuerpo monoclonal, mAb24, que se une específicamente a la pieza principal de alta afinidad de las integrinas β2, para cuantificar la activación de las integrinas β2 en neutrófilos humanos primarios aislados. La N-formilmetionil-leucil-fenilalanina (fMLP) se utiliza como estímulo para activar las integrinas β2 de los neutrófilos. En este estudio se utilizó un citómetro de flujo de alto rendimiento capaz de procesar automáticamente muestras de placas de 384 pocillos. Los efectos de 320 sustancias químicas sobre la inhibición de la integrina β2 se evalúan en 3 h. A través de este enfoque, se pueden identificar moléculas que se dirigen directamente a las integrinas β2 o moléculas diana en la vía de señalización de activación de la integración iniciada por el receptor acoplado a la proteína G de adentro hacia afuera.

Introduction

Muchas enfermedades inflamatorias se caracterizan por la infiltración de neutrófilos en el sitio de la hinchazón o lesión¹. Para infiltrarse en estos tejidos, los neutrófilos deben completar la cascada de reclutamiento de neutrófilos, que implica la detención del endotelio, la extravasación a través de la pared del vaso y el reclutamiento en el tejido². Los neutrófilos circulantes necesitan la activación de la integrina β2 para completar esta cascada, especialmente para la fase de detención. Por lo tanto, los fármacos inhibidores de integrinas que reducen la adhesión, la extravasación y el reclutamiento de neutrófilos pueden tratar eficazmente las enfermedades inflamatorias ^3,4.

Las integrinas β2 han sido atacadas para enfermedades inflamatorias anteriormente. El efalizumab, un anticuerpo monoclonal dirigido directamente a la integrina αLβ2, se desarrolló para tratar la psoriasis⁵. Sin embargo, el efalizumab fue retirado debido a su efecto secundario letal: leucoencefalopatía multifocal progresiva resultante de la reactivación del virus JC ^6,7. Las nuevas terapias antiinflamatorias basadas en integrinas deben considerar el mantenimiento de las funciones antiinfecciosas de los leucocitos para minimizar los efectos secundarios. Los efectos secundarios del efalizumab podrían deberse a la circulación prolongada de anticuerpos monoclonales en el torrente sanguíneo, lo que podría inhibir las funciones inmunitarias a largo plazo⁸. Un estudio reciente muestra que efalizumab media la reticulación αLβ2 y la internalización no deseada de las integrinas α4, proporcionando una explicación alternativa para los efectos secundarios⁹. Por lo tanto, los antagonistas de moléculas pequeñas de corta duración podrían evitar este problema.

Aquí se presenta un método de alto rendimiento para cribar antagonistas de integrinas β2 de moléculas pequeñas utilizando neutrófilos humanos. La activación de la integrina β2 requiere cambios conformacionales del ectodominio de la integrina para acceder y aumentar su afinidad de unión a su ligando. En el modelo canónico de navaja, el ectodominio de integrina doblada-cerrada primero se extiende a una conformación extendida-cerrada y luego abre su casco a una conformación extendida-abierta completamente activada^10,11,12,13. También existe una vía alternativa que parte de la curva-cerrada a la curva-abierta y extendida-abierta, eventualmente 14,15,16,17,18,19. El anticuerpo conformacional específico mAb24 se une a un epítopo en el dominio humano similar a β2-I cuando la cabeza del ectodominio está abierta^20,21,22,23.

En este caso, se utiliza mAb24-APC para determinar si las integrinas β2 están activadas. Para activar los neutrófilos y la integrina, se utiliza como estímulo en este protocolo la N-formilmetionil-leucil-fenilalanina (fMLP), un péptido quimiotáctico corto derivado de bacterias que puede activar las integrinas β2 de los neutrófilos²⁴. Cuando fMLP se une a Fpr1 en los neutrófilos, se activan cascadas de señalización aguas abajo que involucran proteínas G, fosfolipasa Cβ y fosfoinositida 3-quinasa γ. Estos eventos de señalización finalmente resultan en la activación de la integrina a través de la vía de señalización de adentro hacia afuera^18,25. Además de los antagonistas de moléculas pequeñas que se unen directamente a las integrinas β2 y evitan los cambios conformacionales de la activación de las integrinas²⁶, con este método también se detectarían compuestos que pueden inhibir los componentes de la vía de señalización de activación de la integrina β2 de adentro hacia afuera. Los citómetros de flujo automatizados permiten un cribado de alto rendimiento. La identificación de nuevos antagonistas no solo puede profundizar nuestra comprensión de la fisiología de las integrinas, sino que también puede proporcionar información traslacional sobre la terapia antiinflamatoria basada en integrinas.

Protocol

Se obtuvieron muestras de sangre entera heparinizadas de donantes humanos sanos no identificados después de obtener el consentimiento informado, según lo aprobado por la Junta de Revisión Institucional de UConn Health, siguiendo los principios de la Declaración de Helsinki. Se obtuvo el consentimiento informado de todos los donantes. Los criterios de inclusión/exclusión para este estudio se desarrollaron cuidadosamente para garantizar la idoneidad de los participantes y minimizar los riesgos potenciales. Los participantes elegibles tenían entre 18 y 65 años, eran de cualquier etnia, hablaban inglés con fluidez y eran capaces de dar su consentimiento informado. Entre los participantes excluidos se encontraban aquellos que no podían dar su consentimiento informado por sí mismos, como los que requerían un representante legalmente autorizado, las personas menores de 18 años o mayores de 65 años, las personas encarceladas y las mujeres embarazadas. Además, los participantes tenían que estar libres del uso de medicamentos antiinflamatorios y de afecciones inflamatorias. Las infecciones actuales o las afecciones inflamatorias crónicas o agudas en curso también fueron criterios de exclusión. Por último, las personas con antecedentes actuales o recientes de infección por COVID-19 no fueron elegibles para el estudio. Estos criterios se diseñaron para garantizar la seguridad y la idoneidad de los participantes y, al mismo tiempo, minimizar los posibles factores de confusión que podrían afectar los resultados del estudio.

1. Preparación de reactivos

1. Medio de neutrófilos: Prepare el medio de neutrófilos añadiendo un 2% de albúmina sérica humana a RPMI-1640 sin rojo de fenol (ver Tabla de materiales).
2. Solución fMLP: Prepare la solución fMLP diluyéndola 100 veces a partir de la solución de almacenamiento de dimetilsulfóxido (DMSO) de fMLP de 10 mM (consulte la Tabla de materiales) con RPMI 1640 sin rojo de fenol, lo que da como resultado una solución de fMLP de 100 μM.
3. Solución de anticuerpos: Diluir 120 μL de anticuerpo monoclonal conjugado con aloficocianina (APC) mAb24 (mAb24-APC) (ver Tabla de Materiales), que informa de la conformación de alta afinidad de la integrina β2, en 10 mL de medio neutrófilo, creando una solución de mAb24-APC de 1,2 μg/mL.
4. Biblioteca de compuestos: Diluya la biblioteca de compuestos inicial con una concentración de 10 mM a 1 mM agregando 5 μL de la biblioteca de 10 mM (consulte la Tabla de materiales) a 45 μL de DMSO en placas de 384 pocillos utilizando el manipulador de líquidos. Posteriormente, transfiera 5 μL por pocillo de la biblioteca de compuestos de 1 mM a una placa vacía de 384 pocillos utilizando el manipulador de líquidos.
5. Como se ilustra en la Figura 1, cuatro columnas ( 1, 2, 23, 24) contenían solo DMSO pero no compuestos, que sirvieron como controles positivos y negativos en el cribado. Diluya aún más cada pocillo agregando 45 μL de RPMI-1640 sin rojo de fenol, lo que da como resultado una concentración final de 100 μM para todos los compuestos.

2. Aislamiento de neutrófilos de sangre humana

1. Con una pipeta serológica, coloque cuidadosamente 4 ml de sangre sobre 8 ml de un medio de gradiente de densidad disponible comercialmente (véase la tabla de materiales) en un tubo de centrífuga de 15 ml (Figura 2A).
2. Centrifugar la sangre a 550 × g durante 30-50 min a 20 °C. Desacelerar el rotor gradualmente (factor de desaceleración de 1).
   NOTA: La separación exitosa de los neutrófilos (banda 2 en la Figura 2B) de los glóbulos rojos puede variar entre los donantes. Para la mayoría de los donantes, una centrifugación de 30 minutos es suficiente. Sin embargo, para algunos donantes, es posible que se requieran 10-30 minutos adicionales de centrifugación si la separación no tiene éxito (Figura 2C).
3. Retire con cuidado el plasma (el líquido amarillo en la parte superior) y las células mononucleares (la banda turbia superior; PBMC en la Figura 2B) utilizando una pipeta de 1 mL.
4. Recoja los neutrófilos de la banda turbia inferior (banda de neutrófilos en la Figura 2B) y aproximadamente 3-4 ml por debajo del líquido transparente en un tubo de centrífuga de 15 ml que contenga 10 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS). Mezcle suavemente la suspensión de neutrófilos invirtiéndola 2-3 veces.
5. Centrifugar la suspensión a 400 × g durante 10 min a 20 °C y, a continuación, retirar con cuidado el sobrenadante por decantación.
6. Resuspender suavemente el pellet con 5 ml de PBS y centrifugarlo a 300 × g durante 5 min a 20 °C.
7. Retire el sobrenadante por decantación y elimine con cuidado cualquier sobrenadante residual alrededor de la boca del tubo y en la pared del tubo mediante succión al vacío. Vuelva a suspender el gránulo en 1 mL de medio neutrófilo.
8. Cuente el número de células con un hemocitómetro. Típicamente, se obtuvieron de 1 a 4 × 10⁷ neutrófilos a partir de 8 mL de sangre humana.
   NOTA: Puede haber contaminación de glóbulos rojos en la suspensión de neutrófilos. Los glóbulos rojos no afectan significativamente a la mayoría de los ensayos y pueden prevenir la activación/cebado de los neutrófilos²⁷. Los glóbulos rojos deben lisarse antes de contar para obtener una concentración precisa de neutrófilos. Añadir 10 μL de la suspensión celular a 891 μL de agua desionizada durante 10-30 s para lisar los glóbulos rojos, luego añadir 99 μL de PBS al 10× para equilibrar la presión osmótica, evitando la lisis de los neutrófilos.
9. Ajuste la densidad celular a 6.25 × 10⁵ células/mL agregando medio neutrófilo.

3. Preparación de la placa de 384 pocillos

1. En un tubo de centrífuga de 1,5 ml, combine 1 ml de la solución de anticuerpos (1,2 μg/ml de mAb24-APC) con 0,2 ml de medio neutrófilo para crear una solución de mAb24-APC de 1 μg/ml. Luego, agregue 25 μL de esta mezcla a los pocillos de control negativo en una placa de 384 pocillos (los pocillos azules de la Figura 1).
2. En un tubo de centrífuga de 15 ml, mezcle 9 ml de la solución de anticuerpos con 21,6 μl de la solución de fMLP (100 μM) y 1,7784 ml de medio de neutrófilos para crear una solución que contenga 1 μg/ml de mAb24-APC y 200 nM de fMLP. A continuación, agregue 25 μL de esta mezcla a los pocillos de control positivo y de prueba en una placa de 384 pocillos (los pocillos rojo y azul de la Figura 1).
3. Transfiera 5 μL de las soluciones compuestas de 100 μM de la placa de biblioteca de compuestos a la placa de 384 pocillos utilizando una pipeta multicanal.
4. Centrifugar el líquido durante 1 min a 500 × g, a temperatura ambiente.
   NOTA: Para centrifugar placas, se requiere un rotor de cubeta oscilante y cucharones de placas.

4. Tratamiento de las células

1. Agregue 20 μL de la suspensión de neutrófilos a cada pocillo usando una pipeta de 16 canales (rango de 5-50 μL, para cada columna de la placa de 384 pocillos). Mezcle suavemente de 5 a 10 veces con la pipeta, manteniendo un intervalo de tiempo constante entre cada pipeteo.
   NOTA: Las concentraciones finales en los pocillos son las siguientes: neutrófilos 2,5 × 10⁵ células/mL (todos los pocillos); mAb24-APC 0,5 μg/mL (todos los pocillos); fMLP 100 nM (control positivo y pozos de prueba); compuestos 10 μM (pocillos de ensayo).
2. Incubar la placa en un agitador a 300 rpm, a temperatura ambiente (RT), durante 10 min.
3. Fije las celdas agregando 3 μL de paraformaldehído (PFA) al 16% a cada pocillo usando una pipeta de 16 canales (concentración final de PFA ~0.91%). Luego, incuba en hielo durante 10 min.
   NOTA: Se recomienda mantener un intervalo de tiempo constante entre las diferentes columnas al agregar neutrófilos y PFA. Esto garantiza que los neutrófilos de cada pocillo tengan el mismo tiempo de incubación con fMLP y mAb24-APC.

5. Citometría de flujo

1. Encienda el citómetro de flujo (consulte la Tabla de materiales) y asegúrese de que la computadora conectada al instrumento también esté encendida.
2. Asegúrese de que el contenedor de líquido de la vaina esté lleno y que el contenedor de desechos esté vacío y conectado correctamente al instrumento.
3. Cargue la placa de 384 pocillos en el cargador de muestras del citómetro de flujo. Asegúrese de que el pocillo A1 de la placa esté alineado con la marca A1 del cargador.
4. Abra el software y cree un nuevo experimento. Seleccione el pozo 384 y elija los fluoróforos deseados. A continuación, haga clic en Configuración de placa, arrastre para seleccionar todos los pocillos y luego haga clic en Muestra. Encienda el interruptor "Alto rendimiento" y seleccione Alto en el panel de velocidad.
   1. En el cuadro de volumen, escriba 50. Seleccione las muestras en columnas impares y luego active el interruptor "Agitación". Por último, asigne un nombre a las muestras en el panel derecho.
5. Haga clic en Trazar y puerta. Luego, haga clic en el botón Aplicar (dos flechas en un círculo lleno de verde) y, posteriormente, haga clic en el botón de reproducción (forma de triángulo). Espere unos segundos para observar algunas celdas del primer pozo y luego haga clic en el botón de pausa .
   1. Ajuste los voltajes FSC y SSC para garantizar una visualización adecuada de las celdas en la parcela. Haga clic en Adquisición y, a continuación, haga clic en el botón de reproducción (forma de triángulo) para iniciar el ensayo.
6. El citómetro de flujo muestreará secuencialmente ~ 50 μL de 1000-3000 neutrófilos de cada pocillo. Se necesitarán aproximadamente 3 h para completar toda la placa de 384 pocillos.
7. Después de completar todos los ejemplos, exporte los archivos .fcs para el siguiente paso.

6. Análisis de datos

1. Abra el software de análisis de datos de citometría de flujo (consulte Tabla de materiales). Seleccione y arrastre la carpeta que contiene todos los archivos .fcs a la ventana del software y, a continuación, suéltela para importar los datos al software.
2. Haga doble clic en una muestra, compuerta de neutrófilos individuales basados en FSC y SSC^28,29,30 en la ventana emergente^, como se muestra en la Figura 3. Seleccione las filas cerradas y arrástrelas a la carpeta, luego suéltelas para aplicar la compuerta a todas las muestras de esa carpeta.
3. Calcule y exporte la intensidad media de fluorescencia (MFI) de APC de los neutrófilos de cada pocillo utilizando la función de editor de tablas del software. Haga clic en Agregar columna en la pestaña Editar . Seleccione Mediana en la pestaña Estadística , elija los neutrófilos de la población controlada y seleccione APC como parámetro. Haga clic en el botón Aceptar .
4. Regrese a la pestaña "Editor de tablas", seleccione Todas las muestras en la pestaña "Grupo" y presione el botón Crear tabla . Aparecerá una nueva ventana que muestra la tabla creada. Guárdalo como un archivo de texto, CSV o Excel.
5. Abra la tabla exportada, calcule el valor medio y la desviación estándar del IMF de APC para las muestras de control positivas y negativas (Figura 4).
6. Calcula el factor Z' (Z') de la placa usando la ecuación:
   Z' = 1 - 3(σ p + σ n)/(μ_p - μ_n),
   donde σ p y σ n son las desviaciones típicas de los controles positivos y negativos, respectivamente, y μ_p y μ_n son las medias de los controles positivos y negativos, respectivamente³¹.
   NOTA: El factor Z' indica la separación de las distribuciones de control positivo y negativo. Una Z' de 0 significa que no hay separación, mientras que una Z' de 0,5 indica una separación igual. Como se mencionó en un estudio anterior³¹, Z' > 0,5 indica un excelente ensayo para el cribado de compuestos. Una Z' en el rango de 0,5 a 0 es aceptable, pero es posible que solo identifique aciertos fuertes en el ensayo, lo que requerirá una validación adicional en ensayos secundarios.
7. Considerar los compuestos como "aciertos" para el cribado cuando la IMF de APC de los neutrófilos tratados con compuestos es inferior a tres veces la desviación estándar de la IMF de control positivo restado de la IMF de control positivo (P = 0,0013, representada por la línea punteada de la Figura 4).

Results

Los datos de un cribado representativo de placas de 384 pocillos (Figura 4) revelaron que los controles negativos tenían un IMF de mAb24-APC de 3236 ± 110, mientras que los controles positivos tenían un MFI de mAb24-APC de 7588 ± 858. El factor Z' para esta placa es de aproximadamente 0,33, que está dentro de un rango aceptable^{de 31}. Sin embargo, Z' requiere una validación adicional en ensayos secundarios.

Para normalizar los datos, todos los valores se escalaron para asignar un valor máximo de 1 a la media positiva y un valor mínimo de 0 a la media negativa. El factor Z' se someterá a una validación más rigurosa en ensayos secundarios. El punto de corte para esta placa se establece en 0,41, lo que significa que las muestras con un MFI relativo inferior a 0,41 se considerarán como aciertos que inhiben la activación de la integrina β2 inducida por fMLP en neutrófilos humanos. No se identificaron impactos de esta placa.

Para confirmar la efectividad del protocolo, se utilizaron Nexinhib20, que inhibe la activación de la integrina β2 antagonizando la función de Rac-1, y lifitegrast, que antagoniza directamente la integrina αLβ2^32,33. Sin embargo, los tiempos de incubación se ajustaron a una hora para Nexinhib20 y media hora para lifitegrast. Los datos resultantes de estos experimentos se normalizaron utilizando el mismo método de escalado descrito anteriormente. Estos puntos de datos se combinaron con los resultados de la placa y se analizaron colectivamente (Figura 4).

Figura 1: Disposición de la placa para el cribado compuesto. Diagrama esquemático que ilustra la disposición de los compuestos de cribado y los controles en una placa de 384 pocillos. Los pocillos de control negativo se representan en azul (columnas 1 y 23) y los pocillos de control positivo se muestran en rojo (columnas 2 y 24). Los pozos de prueba están representados en color beige (columnas 3 a 22). Las flechas indican la secuencia de lectura de la placa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Separación de neutrófilos utilizando medio de gradiente de densidad. Fotos representativas que demuestran la separación exitosa y no exitosa de neutrófilos utilizando un medio de gradiente de densidad. (A) Inicialmente, se colocan 4 ml de sangre en capas sobre 8 ml de medio de gradiente de densidad. (B) Después de la centrifugación, deben verse dos bandas turbias: la banda superior que contiene principalmente células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y la banda inferior que contiene principalmente neutrófilos con algunos glóbulos rojos (RBC). La mayoría de los glóbulos rojos se peletizan en la parte inferior. (C) Una separación fallida en la que los glóbulos rojos no se peletizan y no se observa la banda de neutrófilos. Se requeriría una centrifugación adicional (10-30 min) para separar la banda de neutrófilos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Activación de neutrófilos mediante gráficos FSC/SSC. Gráficos representativos de dispersión directa (FSC) y dispersión lateral (SSC) que ilustran la estrategia de compuerta para identificar neutrófilos. (A) Los neutrófilos se clasifican en función del área de dispersión directa (FSC-A) y dispersión lateral (SSC-A) registrada por el citómetro de flujo. (B) Las celdas individuales se limitan aún más en función de la anchura (FSC-W) y la altura (FSC-H) de la dispersión directa, y (C) la anchura (SSC-W) y la altura (SSC-H) de la dispersión lateral. La escala de colores representa la densidad de celdas, pasando de rojo a amarillo, verde y azul a medida que disminuye la densidad. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Resultados de la detección en una placa representativa de 384 pocillos. Los resultados de la detección provienen de una placa representativa de 384 pocillos, que demuestra un factor Z' de 0,3. Los controles negativos y positivos se indican con puntos azules y rojos, respectivamente. Las muestras de prueba tratadas con varios compuestos se representan como puntos beige. La línea discontinua representa el límite de la intensidad media de fluorescencia (MFI) para identificar los resultados. Ninguno de los compuestos ensayados se identificó como antagonista de las integrinas β2, ya que todos los compuestos ensayados mostraron valores de IMF por encima de la línea de corte. Los resultados de experimentos independientes que probaron antagonistas de integrinas β2 conocidos con tiempos de incubación variables (Nexinhib20 durante 1 h, lifitegrast durante media hora) se agrupan para su presentación en esta figura. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

El inicio y la terminación de la estimulación y tinción de neutrófilos están determinados por la adición de neutrófilos y el fijador PFA. Por lo tanto, es fundamental garantizar el mismo intervalo de tiempo entre el pipeteo de neutrófilos o PFA en cada columna. Esto asegura que el tiempo de estimulación y tinción de los neutrófilos de cada pocillo permanezca constante. Debido a la corta vida útil de los neutrófilos, todo el experimento, desde la recolección de sangre de los donantes hasta la realización de la citometría de flujo, debe llevarse a cabo el mismo día. Los neutrófilos son muy sensibles a los cambios de temperatura y pueden activarse cuando se exponen a aumentos rápidos de temperatura, como la transición de 4 °C a temperatura ambiente o de temperatura ambiente a 37 °C. Además, según nuestra experiencia previa, la activación de la integrina β2 de neutrófilos inducida por fMLP no se produce cuando las células se almacenan en hielo o a 4 °C (datos no mostrados). Por lo tanto, antes de la fijación, la sangre entera y los neutrófilos deben mantenerse a temperatura ambiente o a 20 °C (durante la etapa de centrifugación de aislamiento). No coloque sangre entera ni neutrófilos en hielo.

La tinción de mAb24 en controles negativos debería producir resultados muy bajos. Si se observa un alto nivel de tinción de mAb24 en un experimento, compruebe lo siguiente: (1) si hubo un cambio significativo de temperatura durante el experimento antes de la fijación; (2) si había contaminación por fMLP o endotoxinas en el medio neutrófilo; (3) si la manipulación de la muestra fue demasiado agresiva, como la generación de burbujas durante el pipeteo y la mezcla.

El protocolo actual emplea mAb24 para informar de la apertura del cabezal de la integrina β2. Teóricamente, KIM127, un anticuerpo monoclonal que informa de la extensión de las integrinas β2 34,35^, puede utilizarse junto con mAb24 para evaluar de forma exhaustiva la conformación de las integrinas β2. Sin embargo, la relación señal-ruido de la tinción con KIM127 (1,5 a 2 veces) no es tan favorable como la de mAb24 (5 a 10 veces), que normalmente no proporciona un factor Z' satisfactorio en el ensayo en placa de 384 pocillos. En el ensayo en placa de 96 pocillos, las muestras se pueden lavar antes de realizar la citometría de flujo, lo que reduce las señales de fondo derivadas de anticuerpos solubles. Por lo tanto, el ensayo basado en KIM127 se puede realizar en el ensayo de placa de 96 pocillos, que tiene un rendimiento más bajo en comparación con el ensayo de placa de 384 pocillos.

Dado que este método utiliza la intensidad de la fluorescencia como lectura para evaluar el efecto inhibidor de la integrina de los fármacos, algunos fármacos fluorescentes pueden interferir con los resultados. Además, los fármacos tóxicos que inducen la muerte de los neutrófilos dentro del período de estimulación de 10 minutos también parecerán informar de la inhibición de la integrina. Los fármacos que inhiben la degranulación de los neutrófilos suprimirán la expresión general de la integrina β2. Estos inhibidores de la degranulación también se identificarán en nuestro cribado. Por lo tanto, es necesario un cribado secundario con otros controles para confirmar los efectos inhibidores de los resultados. Se hace referencia a las pantallas secundarias como un medio para validar y determinar el mecanismo de acción de los aciertos. Además de repetir las pruebas de mAb24, se evaluará la expresión total de CD18 en la superficie celular utilizando un anticuerpo anti-CD18 pan-humano. El nivel de integrina β2 activada, medido por mAb24, se normalizará por la expresión total de CD18. Esto nos permitirá determinar si el mecanismo de acción del agente implica antagonizar la activación de integrinas y/o inhibir la expresión de CD18 en la superficie celular. También se debe realizar un ensayo de viabilidad en el cribado secundario para excluir cualquier efecto tóxico de los golpes.

Este protocolo tiene limitaciones. En primer lugar, mAb24 es capaz de detectar el dominio β2 tipo I solo en los casos en que la integrina se encuentra en un estado de alta afinidad. Por lo tanto, no puede identificar antagonistas alostéricos similares a α/β I, como el lifitegrast, a través de la disminución de la unión de mAb24. Lifitegrast induce más unión a mAb24³² y muestra un valor de MFI anormalmente aumentado con mAb24 (Figura 4). Para estos valores anormales, es posible que se necesiten otros ensayos para verificar si estos resultados son antagonistas alostéricos similares a los de α/β I, como el lifitegrast. En segundo lugar, el factor Z' para este ensayo no es óptimo y podría mejorarse mediante el uso de pipeteo y agitación automáticos. Desafortunadamente, nuestro laboratorio carece del equipo necesario para probar esta hipótesis. La duplicación o triplicación de los ensayos será útil para identificar falsos positivos y negativos en caso de que el factor Z' no pueda mejorarse aún más con los métodos anteriores. Además, puede ser beneficioso extender el tiempo de incubación para identificar más golpes, como se observó con el conocido inhibidor de la activación de la integrina β2 Nexinhib20, que requiere una hora de incubación para producir efectos inhibidores. Este estudio se centró en la identificación de agentes de acción rápida. Los investigadores deben tener en cuenta que pueden modificar el tiempo de incubación para adaptarlo a sus necesidades específicas.

Hasta donde sabemos, este es el primer método de cribado de alto rendimiento para los antagonistas de las integrinas β2. Este enfoque podría utilizarse para identificar compuestos de moléculas pequeñas que se unen directamente a las integrinas β2 y prevenir los cambios conformacionales que conducen a estados de integrina de afinidad intermedia/alta, similares a los antagonistas sin propiedades "agonísticas" descritos recientemente para las integrinas αIIbβ3 y α4β1²⁶. Los neutrófilos son críticos en muchas enfermedades inflamatorias, como la lesión por isquemia-reperfusión miocárdica 36, la sepsis³⁷ y las enfermedades autoinmunes^38,39. Los fármacos de moléculas pequeñas pueden ofrecer más flexibilidad en el tratamiento de estas enfermedades en comparación con los fármacos basados en anticuerpos. Los resultados de nuestra pantalla podrían proporcionar tratamientos potenciales para enfermedades inflamatorias.

El método actual es un cribado de alto rendimiento basado en anticuerpos fluorescentes. Dado que los anticuerpos reporteros de activación también están disponibles para β1 40,41,42,43,44, αIIbβ3 45,46 y αL integrinas 47,48,49,50^, este método puede extenderse a la identificación de antagonistas para otras^integrinas. Un anticuerpo conformacionalmente sensible como HUTS-21, que se une al dominio híbrido β1 51,52,53, se ha utilizado en un cribado de alto rendimiento para identificar antagonistas alostéricos muy tardíos del antígeno-4 (VLA-4^, integrina α4β1) ⁵⁴. El presente método de cribado también puede modificarse y ampliarse para encontrar fármacos que inhiban o promuevan la expresión de otros receptores de superficie, como los compuestos que aumentan la expresión superficial del regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) en las células de la fibrosis quística (FQ). En la FQ, las mutaciones múltiples conducen a un mal plegamiento de CFTR, lo que resulta en la ausencia de expresión de CFTR en la membrana celular⁵⁵. Se ha demostrado que los fármacos de moléculas pequeñas restauran la expresión de CFTR⁵⁶. Para las modificaciones del protocolo, es necesario aumentar el tiempo de incubación de los fármacos a varias horas para permitir que se produzcan cambios en la expresión de las proteínas.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pipetas de 16 canales	Thermo	4661090N	Instrument
Placa de 384 pocillos	Greiner	784201	Materiales APC
anti-humano CD11a/CD18 (LFA-1) Clon de anticuerpos: m24	BioLegend	363410	Reactivos
Bravo  Plataforma automatizada de manejo de líquidos	Agilent	16050-102	384 manipulador de líquidos multicanal
Centrífuga	Eppendorf	Modelo 5810R	Instrumento
FlowJo	Becton, Dickinson & Empresa	NA	Software
Solución de Albúmina de Suero Humano (25%)	GeminiBio	800-120	Reactivos
Lifitegrast	Thermofisher	50-208-2121	Reactivos
Nexinhib20	Tocris	6089	Reactivos
N-Formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)	Sigma	F3506	Reactivos
Solución de paraformaldehído al 16%	Ciencias de la Microscopía Electrónica	15710	Reactivos
Cubos de placas	Eppendorf	UL155	Accesorio
Agitador de placas	Fisher	88-861-023	Instrument
PolymorphPrep	PROGEN	1895 (1114683 anterior)	Reactivos
Placas de compuestos de Prestwick Chemical Library (10 mM)	Prestwick Chemical Libraries	Ver19_384	1520 moléculas pequeñas, 98% comercializado medicamentos aprobados (FDA, EMA, JAN y otras agencias aprobados)
RPMI 1640 Medio, sin rojo fenol	Reactivos Gibco	11-835-030
Rotor de cucharón oscilante	Eppendorf	A-4-62	Rotor
ZE5 Analizador de células	Bio-Rad Laboratories	modelo ZE5	Instrumento