Para la observación de los trastornos murinos del conducto biliar neonatal, se requiere un conducto biliar intacto y una preparación eficiente. Por lo tanto, se desarrolló con éxito un nuevo enfoque para aislar todo el sistema de vías biliares extrahepáticas en neonatos murinos mientras se mantenía la integridad del conducto biliar.
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Artículo de método
Disección extrahepática de las vías biliares y la vesícula biliar en neonatos de ratón de nueve días de edad
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Resumen
Resumen
La disección de los conductos biliares neonatales murinos se ha descrito como difícil. El objetivo principal del procedimiento operativo estándar descrito es el aislamiento del conducto biliar extrahepático (EBD) en neonatos de ratón sin dañar el conducto biliar durante la preparación. Debido a su preparación excepcionalmente cercana en comparación con la línea celular de colangocitos y la recolección de todo el sistema de conductos biliares extrahepáticos (EBDS), el enfoque descrito es extremadamente útil en la investigación de modelos animales de trastornos del conducto biliar en recién nacidos, como la atresia biliar. Después de la eutanasia, se accedió a la cavidad peritoneal y se extrajeron el sistema de conductos biliares, el duodeno y el hígado con la única resección en bloque (EbR). La muestra extraída se coloca en una estera de espuma, y el EBD se disecciona de las células contaminantes de forma atraumática sin el contacto necesario. La disección de todo el EBDS es una ventaja significativa de este método. Se debe tener precaución debido al pequeño tamaño y cantidad de tejido del conducto biliar. Usando la técnica descrita, no hay daño a los colangiocitos. Además, la pureza de la técnica es reproducible (n = 10). Por lo tanto, se pueden recolectar muestras óptimamente comparables. Además, no se daña el tejido del conducto biliar, ya que se puede evitar cualquier contacto con el sistema de conductos biliares durante la preparación, dejando el líquido biliar dentro de la vesícula biliar. Lo más importante es que, mientras se realizaba la disección final de la vesícula biliar y el conducto biliar, se utilizaron microinstrumentos atraumáticos solo ligeramente laterales del conducto biliar sin apretarlo. Esta es la clave para una muestra limpia e intacta, y esencial para una mayor investigación histológica o el aislamiento de colangiocitos. En resumen, la innovadora técnica de disección descrita permite a los operadores especialmente inexpertos con el equipo necesario aislar el EBDS de la manera más limpia posible.
Introducción
La génesis y progresión de colangiopatías como la atresia biliar, la colangitis esclerosante primaria (CEP) y la colangitis biliar primaria (CBP) son desconocidas o incompletas 1,2. La comprensión limitada del origen y la progresión de esas enfermedades conduce a una escasez de opciones terapéuticas3. El obstáculo más difícil en el estudio de los trastornos neonatales del conducto biliar es obtener una comprensión molecular de la fisiopatología. Una de las claves esenciales para una mejor comprensión de la patología molecular es la mejor observación posible del tejido afectado. Para evi....
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Protocolo
Tras la aprobación ética (N045/2021), se observaron neonatos machos y hembras de ratones C57BL/6 hasta los 9 días de edad. Los animales nacieron y fueron proporcionados con fines experimentales por la instalación de animales del Centro Médico Universitario de Hamburgo-Eppendorf, Hamburgo, Alemania. Los neonatos fueron alojados en una jaula junto con sus animales parentales. Las condiciones ambientales se controlaron en temperatura (20-24 °C), ciclo de luz-oscuridad de 12:12 h y humedad relativa de 40%-70%.
1. Preparación experimental
- Prepare el equipo requerido para la operación quirúrgica, incluyendo tijeras, fór....
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Resultados
La Figura 1A muestra el EBDS de un neonato murino, que fue diseccionado con la técnica descrita. Microscópicamente, no hay más tejido hepático visible. El tejido hepático se ha eliminado durante los pasos finales de aislamiento del protocolo y podría distinguirse fácilmente del tejido del conducto biliar en cuanto a color y consistencia. La Figura 1B muestra la muestra aislada en comparación con una escala milimétrica. La longitud de la EBD (medida desde la vesí.......
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Discusión
Este artículo informó y discutió la creación y validación de un nuevo enfoque quirúrgico para eliminar el EBDS de ratones neonatales sacrificados. Los hallazgos microscópicos e histológicos revelan que el enfoque detecta rápidamente las EBD y las disecciona cerca de los márgenes del conducto, incluso en ratones neonatos. Solo se requieren instrumentos quirúrgicos y un microscopio con un aumento de 20x para el protocolo descrito. Además, el enfoque permite el aislamiento de todo el EBDS. La técnica es altamente eficiente,.......
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Agradecimientos
Los autores reconocen a Johanna Hagens, Pauline Schuppert, Clara Philippi, PD Dr. med Christian Tomuschat, Svenja Warnke, PD Dr. Diana Lindner, Prof. Dr. Dirk Westermann, Miriam Tomczak, Nicole Lüder, Nadine Kurzawa, Dr. rer nat. Laia Pagerols Raluy, Birgit Appl y Magdalena Trochimiuk por sus contribuciones. Hans Christian Schmidt recibió apoyo financiero de la beca Else Kröner-Fresenius-Stiftung iPRIME (2021_EKPK.10), UKE, Hamburgo.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 2-Propanol | CHEMSOLUTE | 11365000 | utilizado como agente deshidratante |
| Cánula de 30 G | B Braun/Sterican, Melsungen Alemania | 4656300 | cánula para la hidratación de la muestra |
| Ventilación de aire | C + P Mö belsysteme GmbH & Co. KG, Breidenbach, Alemania | Tec-Ononmic AZ 1200 | el uso de un respiradero ayuda a evitar la inhalación de fijadores que contienen formalina |
| Aqua ad injectabilia Braun | B Braun, Melsungen, Alemania | 2351744 | solución salina; Contenedor: Mini-Plasco connect, 20 x 10 mL, estéril |
| Pinza microquirúrgica más grande | DIADUST von Aesculap, Trossingen Deutschland | FD253R | recta, 180 mm (7"), punta de plataforma, mango redondo, ancho: 0,800 mm, recubierto de polvo de diamante, no estéril, reutilizable herramienta opcional para la observación y todas las etapas de preparación, excepto la preparación final; Piel divisoria del peritoneo |
| Cámara" SmartCAM 5" | Basler and Vision Engineering, Send, Reino Unido | EVC131A | módulo de cámara Lynx Exo opcional: tipo de sensor: CMOS, resolución 2560 x 1920 píxeles, tamaño del sensor: 1/2"; Se utiliza para la producción de vídeo y la evaluación técnica |
| Máquina de deshidratación/Citadel 2000 Procesador de tejidos | Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Alemania | 12612613 | utiliza para la deshidratación automática, programa corto (aprox. 4,8 h) |
| Esponja de deshidratación | Carl Roth, Karlsruhe, Alemania | Esponja TT56.1 | para el paso final de disección, otras esponjas/almohadillas de espuma con un tamaño de poro mínimo de 60 poros por pulgada también son adecuadas, el uso de se recomiendan dos almohadillas de espuma por casete de inclusión para cubrir la muestra desde abajo y desde arriba para evitar el deslizamiento a través de la perforación de los casetes de inclusión |
| Dulbecco´ s Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | Gibco | 14190-144 | Doesn&agudo; t contiene Calzium o Magnesio, 500 mL |
| Casetes de inclusión | Engelbrecht GmbH, Edermü nde, Alemania | 17990 | |
| Eosin | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Alemania | 41-6660-00 | de tinción, lista para usar |
| Tijeras finas CeramaCut | FST, Heidelberg Alemania | 14959-09 | Consejos: Afilado-afilado, aleación / Material: Acero inoxidable recubierto de cerámica, dentado:, Sí; Característica: CeramaCut, Forma de la punta: recta, Filo: 22 mm, Longitud: 9 cm; Incisión en la piel, incisión de la ventana peritoneal |
| Pinza de Graefe | FST, Heidelberg Alemania | 11051-10 | Longitud: 10 cm, Forma de la punta: curvada, dentada, Ancho de la punta: 0,8 mm, Dimensiones de la punta: 0,8 x 0,7 mm, Aleación / Material: Acero inoxidable |
| Hematoxilina | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Alemania | 41-5130-00 | solución de tinción, lista para usar |
| Microscopio de alta resolación | Vision Engineering, Enviar Reino Unido | EVO503 | Capaz de ampliar hasta 60x, solo se utilizaron 6x a 20x |
| Microscopio | Olympus Optical CO, Ltd., Hamburgo, Alemania | BX60F5 | |
| Cubierta de microscopio Glases | Marienfeld, Lauda-Kö nigshofen, Alemania | 101244 | 60 mm de ancho, de vidrio SCHOTT D 263 |
| Portaobjetos de microscopio | R. Langenbrinck GmbH, Emmendingen, Alemania | 03-0060 | |
| Microtomo | Leica, Nuß loch, Alemania | SM2010R | Herramienta para seccionar (2 µ m-rebanadas) |
| Jeringa Omnifix-F 1 mL | B Braun, Melsungen, Alemania | 9161406V | jeringa sin cánula |
| Parafina Sakura Finetec, Torrance, EE. UU | 4511 | Cera de parafina Tissue-Tek Tek III, sin DMSO | |
| Máquina de inclusión de parafina | MEDITE Medical GmbH, Burgdorf, Alemania | TES 99 | La máquina de incrustación utilizada en este estudio contenía los siguientes tres módulos individuales: TES 99.420, TES 99.250, TES 99.600. La muestra debe sumergirse en parafina directamente después de la deshidratación, no se debe realizar un almacenamiento intermedio en un refrigerador debido a la posible contracción y humedad en el refrigerador |
| Paraformaldehído (PFA) | Morfisto | 1176201000 | Prepare 1 mL de alícuotas en tubos cónicos Eppendorf de 2 mL para muestras de hígado y 0,5 mL de alícuotas en tubos cónicos Eppendorf de 1 mL para muestras de vías biliares extrahepáticas, 4% en PBS ph 7.4 |
| Pinzas microquirúrgicas pequeñas | EPM (Erich Pfitzer Medizintechnik), Bü tthard, Bayern, Alemania | (00)165 | Mango redondo, recto, punta de 0,3 mm, herramienta para la observación y cada paso de la preparación, especialmente útil en la preparación final |
| Regla de acero inoxidable | Agntho's AB, Lidingö, Suecia | 30085-15 | 150mm Con sistema métrico & Tijeras quirúrgicas de graduaciones de pulgadas |
| – Afilado-romo para la decapitación | FST, Heidelberg Alemania | 14001-14 | Dispositivo para la decapitación |
| Armario de calentamiento | Haraeus, Hanau, Alemania | T 6060 | Las muestras cortadas en rodajas deben mantenerse en el armario de calentamiento para asegurar la fijación de la muestra en los portaobjetos del microscopio |
Referencias
- Liwinski, T., Schramm, C. Primär sklerosierende Cholangitis. Der Internist. 59 (6), 551-559 (2018).
- Kobayashi, H., Stringer, M. D. Biliary atresia. Seminars in Neonatology. 8 (5), 383-391 (2003).
- Patman, G.
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Reimpresiones y permisos
