Method Article

Desarrollo y evaluación de un modelo de rata de defectos de cartílago de espesor total

DOI:

10.3791/64475

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May 19th, 2023

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1The First Affiliated Hospital, Zhejiang Chinese Medical University, 2Fuyang Orthopaedics and Traumatology Affiliated Hospital, Zhejiang Chinese Medical University, 3College of Pharmaceutical Science, Zhejiang Chinese Medical University, 4Affiliated Zhejiang Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 5Xianju County Hospital of Chinese Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo establece un modelo de defectos de cartílago de espesor total (FTCD) mediante la perforación de orificios en el surco troclear femoral de ratas y la medición del comportamiento del dolor posterior y los cambios histopatológicos.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los defectos del cartílago de la articulación de la rodilla causados por un traumatismo son una lesión común de las articulaciones deportivas en la clínica, y estos defectos provocan dolor en las articulaciones, deterioro del movimiento y, finalmente, osteoartritis de rodilla (kOA). Sin embargo, existe poco tratamiento eficaz para los defectos del cartílago o incluso para el kOA. Los modelos animales son importantes para el desarrollo de fármacos terapéuticos, pero los modelos existentes para los defectos del cartílago no son satisfactorios. Este trabajo estableció un modelo de defectos de cartílago de espesor total (FTCD) mediante la perforación de orificios en el surco troclear femoral de ratas, y el comportamiento del dolor posterior y los cambios histopatológicos se utilizaron como experimentos de lectura. Después de la cirugía, el umbral de retirada mecánica disminuyó, se perdieron condrocitos en el sitio lesionado, se aumentó la expresión de MMP13 de la metaloproteinasa de matriz y disminuyó la expresión de colágeno tipo II, lo que es consistente con los cambios patológicos observados en los defectos del cartílago humano. Esta metodología es fácil y sencilla de realizar y permite la observación macroscópica inmediatamente después de la lesión. Además, este modelo puede imitar con éxito los defectos clínicos del cartílago, proporcionando así una plataforma para estudiar el proceso patológico de los defectos del cartílago y desarrollar los fármacos terapéuticos correspondientes.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El cartílago articular es un tejido muy diferenciado y denso formado por condrocitos y matriz extracelular1. La capa superficial del cartílago articular es una forma de cartílago hialino, que tiene una superficie lisa, baja fricción, buena resistencia y elasticidad, y excelente tolerancia al estrés mecánico2. La matriz extracelular está compuesta por proteoglicanos de colágeno y agua, y el colágeno tipo II es el principal componente estructural del colágeno, ya que representa alrededor del 90% del colágeno total3. Como no existen vasos sanguíneos ni nervios en el tejido cartilaginoso, carece de la capacidad de autorrepararse después deuna lesión. Por lo tanto, los defectos del cartílago causados por traumatismos siempre han sido una enfermedad articular intratable en las clínicas; Además, esta enfermedad articular tiende a afectar a los jóvenes, y la incidencia mundial va en aumento 5,6. La articulación de la rodilla es el sitio más común de defectos del cartílago, y los defectos aquí se acompañan de dolor articular, disfunción articular y degeneración del cartílago articular, lo que eventualmente conduce a la osteoartritis de rodilla (kOA)7. Los defectos del cartílago de la articulación de la rodilla suponen cargas económicas y fisiológicas para los pacientes y afectan gravemente a la calidad de vida de los pacientes8. Esta enfermedad supone un reto clínico importante y urgente sin soluciones inminentes. En la actualidad, la cirugía es el pilar del tratamiento de los defectos del cartílago, pero su resultado a largo plazo sigue siendo insatisfactorio9.

Los defectos clínicos del cartílago eventualmente conducen a kOA y, por lo tanto, los modelos animales de kOA se usan comúnmente para el estudio patológico de los defectos del cartílago y el desarrollo de fármacos. El establecimiento de modelos animales es importante para comprender el proceso fisiopatológico de reparación de defectos cartilaginosos, que pueden ser utilizados para observar la regeneración del cartílago y la alteración entre el fibrocartílago y el cartílago hialino10. Sin embargo, los modelos animales de kOA comúnmente utilizados, como los modelos quirúrgicos de transección del ligamento cruzado anterior (ACLT), desestabilización del menisco medial (DMM), ovariectomía (OVX) y Hulth, generalmente necesitan modelos a largo plazo y solo permiten evaluaciones patológicas y de dolor, lo que plantea limitaciones a la eficiencia del desarrollo de fármacos11. Además de los modelos quirúrgicos, los modelos químicos, como el monoyodoacetato (MIA) y la inyección de papaína, también resultan en defectos del cartílago, pero el grado del defecto no puede ser bien manejado y las condiciones están lejos de la realidad clínica11. La colisión es otro enfoque para modelar defectos del cartílago en animales más grandes, pero este método depende del uso de instrumentos específicos y rara vez se aplica12.

En resumen, los modelos de kOA existentes no son ideales para estudiar la patogénesis de los defectos del cartílago o desarrollar nuevos fármacos, y se necesita un modelo específico y estandarizado para los defectos del cartílago. Este estudio estableció un modelo de defectos de cartílago de espesor total (FTCD) mediante la perforación de agujeros en el surco troclear femoral en ratas. Para la evaluación del modelo se realizó observación macroscópica, pruebas de comportamiento al dolor y análisis histopatológico. A diferencia de otros modelos animales de kOA, este modelo tiene poco efecto en el estado general de las ratas. Este enfoque de modelado es accesible, se puede manejar bien y apoya la comprensión de la progresión de los defectos del cartílago a kOA y el desarrollo de terapias efectivas. Este modelo también se puede utilizar para probar terapias que previenen la kOA mediante la curación de defectos en las articulaciones preartríticas.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los experimentos con animales fueron aprobados por el Comité de Normas Médicas y Ética de la Universidad de Medicina Tradicional China de Zhejiang, que se ajusta a la legislación china sobre el uso y cuidado de animales de laboratorio. En el presente estudio, se utilizaron ratas macho Sprague-Dawley (SD) de 6 semanas de edad con un peso de 150-180 g. Los animales se obtuvieron de una fuente comercial (véase la Tabla de Materiales).

1. Establecimiento de un modelo de defectos del cartílago de espesor total en ratas

  1. Después de 1 semana de aclimatación al nuevo entorno, divida las ratas de forma aleatoria y equitativa en dos grupos (n = 8 ratas/grupo). Las ratas del grupo simulado se someterán a la cirugía simulada, mientras que las ratas del grupo modelo se someterán a la cirugía experimental que consiste en perforar agujeros en el surco troclear femoral.
    NOTA: Cada jaula debe estar cubierta con almohadillas estériles de mazorcas de maíz (consulte la Tabla de Materiales) para proteger los dedos de los pies de las ratas.
  2. Anestesiar a las ratas mediante una inyección intraperitoneal (i.p.) de pentobarbital sódico (40 mg/kg). Luego, presione suavemente los dedos de los pies de las ratas para confirmar la anestesia adecuada. Usa un ungüento veterinario en los ojos de las ratas para evitar la sequedad mientras están bajo anestesia.
    NOTA: La cirugía animal debe realizarse en un quirófano dedicado utilizando instrumentos quirúrgicos esterilizados en autoclave. Los operadores deben usar batas de laboratorio limpias, mascarillas, cubiertas para la cabeza y guantes estériles durante la cirugía. Coloque almohadillas estériles sobre el área quirúrgica y esterilice todo el equipo antes de usarlo. Proporcionar soporte térmico durante todo el procedimiento.
  3. Coloque a la rata en la mesa de operaciones en posición supina, afeite las extremidades traseras izquierda y derecha y limpie el área de la articulación de la rodilla con jabón quirúrgico, seguido de alternar una solución antiséptica de povidona yodada y alcohol tres veces en condiciones estériles. Coloque un paño estéril sobre la rata y exponga solo la articulación de la rodilla desinfectada.
  4. Haga una incisión de 1 cm con una hoja de bisturí (número 11) en el centro de la articulación de la rodilla de rata de arriba a abajo, y corte la cápsula articular y el tendón del cuádriceps femoral a lo largo del borde medial de la rótula después de la disección superficial.
    NOTA: El tendón del cuádriceps femoral se une a la rótula y al cóndilo femoral durante la flexión de la articulación de la rodilla13. El surco que se ve en la cápsula articular es el surco troclear femoral, y el cóndilo femoral distal forma los cóndilos medial y lateral.
  5. Gire la rótula hacia afuera y flexione la tibia y el peroné en un ángulo de 90° para exponer completamente la tróclea del cóndilo femoral. Utilice una broca circular de 1,6 mm de diámetro (véase la Tabla de materiales) vertical a la superficie del cartílago a 4.000 rpm durante 10 s para crear un defecto de cartílago de espesor completo en el surco troclear femoral con una profundidad de 0,1 mm.
    NOTA: Use solución salina de forma intermitente para minimizar el trauma térmico en el tejido óseo circundante durante el procedimiento de perforación.
  6. Limpie el sitio quirúrgico con bolas de algodón empapadas en una solución salina al 0.9%, reemplace la rótula, mantenga la rodilla en una posición de extensión y suture la incisión capa por capa con suturas 4-0 no absorbibles (ver Tabla de materiales).
    1. Coloque a los animales en almohadillas térmicas con decúbito esternal, vigílelos hasta que se despierten y luego devuélvalos a sus jaulas. Inyectar buprenorfina (0,05 mg/kg) por vía subcutánea cada 8 h tres veces después de la operación para aliviar el dolor.
  7. Probar el comportamiento relacionado con el dolor de todas las ratas a los 3 días, 10 días y 17 días después de la cirugía, como se describe en la sección 2.

2. Umbral de retirada mecánica (MWT)

NOTA: El MWT de la planta posterior bilateral de ratas se midió mediante el método clásico de medición del dolor con filamento de von Frey14.

  1. Coloque la rata en una sola cámara de plástico (17 cm x 11 cm x 13 cm) sobre una plataforma de malla de alambre (consulte la Tabla de materiales) y coloque la base de malla de alambre a 50 cm por encima de una mesa. Mida el MWT después de 30 minutos de adaptación.
  2. Presione el filamento de von Frey (ver la Tabla de Materiales) perpendicularmente sobre la superficie plantar de la pata trasera de cada rata, y doble el cepillo durante unos 2 s, evitando la parte más gruesa del centro de la pata trasera.
  3. Aumente gradualmente el peso del estímulo desde los 4 g más bajos hasta que se produzca una respuesta positiva (retirada de la pata o lamido de la pata).
    NOTA: El intervalo entre cada estimulación debe ser superior a 1 min. El MWT se define como tres respuestas positivas en cinco estimulaciones; Registre el peso del estímulo en gramos.
  4. Calcule los valores medios para los grupos simulado y modelo de acuerdo con el peso mínimo del estímulo registrado en gramos.

3. Análisis histopatológico e inmunohistoquímico

  1. A los 17 y 56 días después de la cirugía, anestesiar a las ratas con 40 mg/kg de pentobarbital sódico (i.p.) y sacrificar a todas las ratas extrayendo sangre del corazón. Aísle las rodillas cortando el hueso en la parte media del fémur y la mitad de la tibia, y diseccione el tejido muscular circundante. Extirpar las articulaciones de la rodilla para su análisis histológico.
  2. Fijar las articulaciones de la rodilla en 20 mL de solución de paraformaldehído al 10% durante 48 h a temperatura ambiente, y luego descalcificarlas con 20 mL de solución de EDTA al 10% en un agitador orbital durante 8 semanas a 4 °C. Cambie la solución EDTA todos los días.
  3. Recorte la articulación de la rodilla para que se ajuste al tamaño de la caja de inclusión. Incrustar las articulaciones de la rodilla deshidratadas en parafina100% 15.
  4. Coloque las articulaciones de rodilla incrustadas en parafina en el soporte de un micrótomo, ajuste el ángulo y recorte la muestra de parafina con una cuchilla hasta que la superficie esté plana.
  5. Ajuste el grosor de las rodajas de parafina a 3 μm y aplanar las rodajas al baño maría a 40 °C.
  6. Pegue las rodajas en portaobjetos de vidrio, colóquelas en una máquina de hornear a 45 ° C (consulte la Tabla de materiales) hasta que estén secas y guárdelas a temperatura ambiente.
  7. Desparafinado y rehidratación: Desparafinar las rodajas en un horno a 60 °C durante 4 h, y luego colocar las rodajas sucesivamente en xileno al 100% (tres veces), etanol al 100% (dos veces), etanol al 95%, etanol al 80% y etanol al 75% durante 5 min cada vez.
  8. Tinción de hematoxilina y eosina (H&E)
    1. Desparafinar, rehidratar y lavar las rodajas con agua bidestilada durante 2 min.
    2. Tiñe las rodajas con hematoxilina al 0,5% (ver Tabla de materiales) durante 3 min, y lava las rodajas con agua bidestilada hasta que no queden residuos de hematoxilina en la superficie de las rebanadas.
    3. Sumerja las rodajas en alcohol de ácido clorhídrico al 1% durante 3 s y lave las rodajas con agua bidestilada durante 2 minutos.
    4. Remojar las rodajas en agua amoniacal al 1% durante 10 s y lavar las rodajas con agua bidestilada durante 2 min.
    5. Tiñe las rodajas con eosina (consulta la Tabla de materiales) durante 1 minuto y lávalas con agua bidestilada hasta que no queden residuos de eosina en la superficie de las rodajas.
    6. Sumerja las rodajas en etanol al 95%, etanol al 100% y xileno al 100% (tres veces) sucesivamente durante 1 minuto cada vez.
    7. Agregue una gota de resina neutra (consulte la Tabla de materiales) a cada rebanada y séllela con un cubreobjetos.
  9. Tinción con Safranina O/Fast Freen (SO)
    1. Desparafinar, rehidratar y lavar las rodajas con agua bidestilada durante 2 min.
    2. Tiñe las rodajas con 0,05% de Fast Green (consulta la Tabla de Materiales) durante 3 min, y lava las rodajas con agua bidestilada hasta que no queden residuos de Fast Green en la superficie de las rodajas.
    3. Sumerja las rodajas en una solución de ácido acético al 1% durante 10 s y lave las rodajas con agua bidestilada durante 2 minutos.
    4. Tiñe las rodajas con 2,5% de SO (ver Tabla de Materiales) durante 2 min, y luego lava las rodajas con agua bidestilada hasta que no queden residuos de SO en la superficie de las rebanadas.
    5. Sumerja las rodajas en etanol al 95%, etanol al 100% y xileno al 100% (tres veces) sucesivamente durante 1 minuto cada vez.
    6. Añade una gota de resina neutra a cada rodaja y séllala con un cubreobjetos.
  10. Tinción con azul de toluidina (TB)
    1. Desparafinar, rehidratar y lavar las rodajas con agua bidestilada durante 2 min.
    2. Sumerja las rodajas en una solución de TB al 1% (consulte la Tabla de materiales) durante 2 minutos y lave las rodajas con agua bidestilada hasta que no queden residuos de azul de toluidina en la superficie de las rodajas.
    3. Sumerja las rodajas en etanol al 95%, etanol al 100% y xileno al 100% (tres veces) sucesivamente durante 1 minuto cada vez.
    4. Añade una gota de resina neutra a cada rodaja y séllala con un cubreobjetos.
  11. Tinción de Masson
    1. Desparafinar, rehidratar y lavar las rodajas con agua bidestilada durante 2 min.
    2. Añadir la solución de Bouin (ver la Tabla de Materiales) gota a gota a las rodajas, teñirlas a 37 °C durante 2 h y lavarlas con agua bidestilada hasta que desaparezca el color amarillo de la superficie de las rodajas.
    3. Tiñe las rodajas con azul celestita (consulta la Tabla de materiales) durante 3 minutos y lava las rodajas con agua bidestilada hasta que no queden residuos de azul celestita en la superficie de las rodajas.
    4. Tiñe las rodajas con hematoxilina durante 3 minutos y lávalas con agua bidestilada hasta que no queden residuos de hematoxilina en la superficie de las rebanadas.
    5. Sumerja las rodajas en etanol ácido durante 5 s y lave las rodajas con agua bidestilada durante 2 min.
    6. Tiñe las rodajas con fucsina de Ponceau (ver la Tabla de Materiales) durante 10 min, y lava las rodajas con agua bidestilada hasta que no queden residuos de fucsina de Ponceau en la superficie de las rebanadas.
    7. Sumerja las rodajas en ácido fosfomolíbdico (consulte la Tabla de materiales) durante 10 minutos, luego sumérjalas en una solución de tuberculosis durante 5 minutos y lave las rodajas con agua bidestilada hasta que no queden residuos de tuberculosis en la superficie de las rodajas.
    8. Sumerge las rodajas en una solución ácida débil durante 2 minutos y lávalas con agua bidestilada durante 2 minutos.
    9. Sumerja las rodajas en etanol al 95%, etanol al 100% y xileno al 100% (tres veces) sucesivamente durante 1 minuto cada vez.
    10. Añade una gota de resina neutra a cada rodaja y séllala con un cubreobjetos.
  12. Observar todos los cortes bajo un microscopio en un entorno doble ciego para determinar el grado de degeneración del cartílago articular de acuerdo con el sistema de puntuación de Mankin16.
  13. Inmunohistoquímica
    1. Desparafinar y rehidratar las rodajas de forma rutinaria, y lavar las rodajas con PBS durante 2 min.
    2. Sumergir las rodajas en una solución de citrato sódico y colocarlas en un horno a 60 °C durante 4 h para reparar el antígeno. Lave las rodajas con PBS tres veces durante 3 minutos cada una.
    3. Sumerja las rodajas en una solución de Triton X-100 al 0,3 % durante 10 minutos y lave las rodajas dos veces con PBS durante 3 minutos cada vez.
    4. Bloquear la actividad de la peroxidasa endógena añadiendo una solución deH2O2al 3% en metanol a temperatura ambiente durante 30 min. Lave las rodajas dos veces con PBS durante 3 minutos cada vez.
    5. Incubar las secciones con suero de cabra al 5% en PBS durante 30 min a temperatura ambiente para bloquear cualquier unión inespecífica. Lave las rodajas dos veces con PBS durante 3 minutos cada vez.
    6. Añadir 100 μL de anticuerpos primarios diluidos en PBS (anti-col1, 1:50; anti-col3, 1:50; anti-col2, 1:100; y anti-MMP13, 1:100; ver la Tabla de Materiales) a cada rebanada, e incubarlas durante la noche a 4 °C. Lave las rodajas dos veces con PBS durante 3 minutos cada vez.
    7. Incubar cada rebanada con 100 μL de anticuerpo secundario diluido en PBS (1:100) (anti-conejo de cabra o anti-ratón de cabra, ver la Tabla de Materiales) a temperatura ambiente durante 20 min. Lave las rodajas dos veces con PBS durante 3 minutos cada vez.
    8. Añadir 100 μL de solución de trabajo 3,3'-diaminobenzidina (DAB, ver la Tabla de Materiales) a cada rebanada.
    9. Observar y registrar el tiempo de aparición de un color marrón bajo un microscopio; La reacción cromogénica hace que los sitios del epítopo sean marrones17. Trate el resto de las muestras con el mismo tiempo de reacción registrado.
    10. Después de que las rodajas se doren, lávelas dos veces con agua destilada doble durante 3 minutos cada vez.
    11. Vuelva a teñir las rodajas con hematoxilina durante 1 minuto y lave las rodajas con agua bidestilada durante 2 minutos.
    12. Sumerja las rodajas en ácido clorhídrico durante 3 s y lave las rodajas con agua bidestilada durante 2 min.
    13. Remojar las rodajas en agua amoniacal al 1% durante 10 s y lavar las rodajas con agua bidestilada durante 2 min.
    14. Sumerja las rodajas en etanol al 95%, etanol al 100% y xileno al 100% (tres veces) sucesivamente durante 1 minuto cada vez.
    15. Añade una gota de resina neutra a cada rodaja y séllala con un cubreobjetos.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En este trabajo, se estableció un modelo de FTCD en ratas mediante la perforación de orificios en el surco troclear femoral y la detección del comportamiento del dolor y los cambios histopatológicos posteriores. Como se muestra en la Figura 1, 3 días después del modelado, en comparación con el grupo simulado, el MWT de las ratas en el grupo modelo se redujo significativamente, lo que sugiere hiperalgesia causada por el FTCD. A los 17 días después del modelado, el umbral de retirada mecánica ...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio describe un modelo animal para imitar defectos clínicos del cartílago mediante la perforación de agujeros en el surco troclear femoral de ratas (Figura suplementaria 1). Después de la lesión del cartílago, la excitabilidad o capacidad de respuesta de los nociceptores periféricos aumenta, lo que puede resultar en una disminución en el umbral del dolor y la mejora de la capacidad de respuesta a la estimulación18. En estudios preclínicos, el modelado de ...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este estudio contó con el apoyo de la Fundación de Ciencias Naturales de Zhejiang (subvención número LQ20H270009), la Fundación de Ciencias Naturales de China (subvención números 82074464 y 82104890), la Fundación de Ciencias Médicas Tradicionales Chinas de Zhejiang (subvenciones números 2020ZA039, 2020ZA096 y 2022ZB137) y el Proyecto de Ciencia y Tecnología de la Salud Médica de la Comisión Provincial de Salud de Zhejiang (subvención número 2016KYA196).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
3, 3'-diaminobenzidina  Hangzhou Zhengbo Biotecnología Co., Ltd.ZLI-9019El colorante para la tinción de IHC
Anticuerpo Anti-Colágeno IIINovusNB600-594Anticuerpo primario para IHC
Anti-Colágeno IIanticuerpo Abcam (UK)34712Anticuerpo primario para IHC
Anticuerpo Anti-Colágeno INovusNB600-408Anticuerpo primario para IHC
Solución de BouinShanghai Yuanye Technology Co., Ltd.R20381El tinte para la tinción de azul
CelestitaShanghai Yuanye Technology Co., Ltd.R20381El colorante para la tinción de Masson
Acolchados de mazorca de maíz  Xiaohe Tecnología Co., Ltd Ropa de cama para animales 
EosinaSigma-Aldrich861006El colorante para la tinción de HE
Fast Green FCFSigma-AldrichF7252El colorante para la tinción de SO
Anticuerpo anti-ratón de cabraZSGQ-BIO (Pekín, China)PV-9002Anticuerpo secundario para IHC
Anticuerpo anti-conejo de cabraZSGQ-BIO (Pekín, China)PV-9001Anticuerpo secundario para IHC
HematoxilinaSigma-AldrichH3163El tinte para la tinción HE
MassonShanghai Yuanye Technology Co., Ltd.R20381El colorante para la tinción de Masson
MicrodrillRwd Life Science Co., Ltd78001Equipo para cirugía
MMP13Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, EE. UU.)69926Anticuerpo primario para IHC
Centro modular de inclusión de tejidosThermo Fisher Scientific (EE. UU.)EC 350Producir bloques de parafina
Resina neutraHangzhou Zhengbo Biotecnología Co., Ltd.ZLI-9555Sello para IHC
Sutura no absorbibleHangzhou Huawei Medical Supplies Co., Ltd.4-0Equipo para cirugía
Pentobarbital sódico Hangzhou Zhengbo Biotecnología Co., Ltd.WBBTN5Ganimal anestesiado
 Shanghai Yuanye Tecnología Co., Ltd.R20381El tinte para la tinción de Masson
Ponceau fucsin, Shanghai Yuanye Technology Co., Ltd.R20381El colorante para la tinción de Masson
Microtomos rotativos y deslizantesThermo Fisher Scientific (USA)HM325Secciones precisas de parafina
Safranin-OSigma-AldrichS2255El colorante para la tinción
de SO Hoja de bisturí ShanghaiLianhui Medical Supplies Co., Ltd.11Equipo para cirugía
Solución de citrato de sodio (20x)Hangzhou Haoke Biotechnology Co., Ltd.HK1222Recuperación de antígeno para
ratas IHC Sprague Dawley (SD)  Shanghai Slake Animal Experimental Co., Ltd.SDAnimal de experimentación
Tissue-Tek VIP 5 JrSakura (Japón)Procesador de infiltración al vacío
Azul de toluidinaSigma-Aldrich89640El colorante para la tinción de tuberculosis
Filamento Von FreyUGO Basile (Italia) 37450-275Equipo para
la plataforma de malla de alambre del ensayo MWT Shanghai Yuyan Instruments Co., Ltd.Equipos para el ensayo MWT
de Masson Ácido fosfomolíbdico

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