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Cultivo tridimensional de criptas colónicas murinas para estudiar la función de las células madre intestinales ex vivo

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DOI:

10.3791/64534

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11 de octubre de 2022

 ,  , 
1Department of Anatomy and Cell Biology, Brody School of Medicine, East Carolina University

En este artículo

Resumen

El presente protocolo describe el establecimiento de un sistema organoide colónico murino para estudiar la actividad y el funcionamiento de las células madre colónicas en un modelo knockout de claudina-7.

Resumen

El epitelio intestinal se regenera cada 5-7 días, y es controlado por la población de células madre epiteliales intestinales (IESC) ubicada en la parte inferior de la región de la cripta. Las IESC incluyen células madre activas, que se autorrenuevan y se diferencian en varios tipos de células epiteliales, y células madre quiescentes, que sirven como células madre de reserva en caso de lesión. La regeneración del epitelio intestinal está controlada por las capacidades autorrenovadoras y diferenciadoras de estos IESC activos. Además, el equilibrio de la población de células madre de la cripta y el mantenimiento del nicho de células madre son esenciales para la regeneración intestinal. El cultivo de organoides es un enfoque importante y atractivo para estudiar proteínas, moléculas de señalización y señales ambientales que regulan la supervivencia y las funciones de las células madre. Este modelo es menos costoso, consume menos tiempo y es más manipulable que los modelos animales. Los organoides también imitan el microambiente tisular, proporcionando relevancia in vivo . El presente protocolo describe el aislamiento de criptas colónicas, incrustando estas células de cripta aisladas en un sistema de matriz de gel tridimensional y cultivando células de cripta para formar organoides colónicos capaces de autoorganización, proliferación, autorrenovación y diferenciación. Este modelo permite manipular el entorno, eliminando proteínas específicas como la claudina-7, activando / desactivando las vías de señalización, etc., para estudiar cómo estos efectos influyen en el funcionamiento de las células madre del colon. Específicamente, se examinó el papel de la proteína de unión estrecha claudina-7 en la función de las células madre del colon. Claudina-7 es vital para mantener la homeostasis intestinal y la función e integridad de barrera. La eliminación de claudina-7 en ratones induce un fenotipo similar a la enfermedad inflamatoria intestinal que exhibe inflamación intestinal, hiperplasia epitelial, pérdida de peso, ulceraciones de la mucosa, desprendimiento de células epiteliales y adenomas. Anteriormente, se informó que la claudina-7 es necesaria para las funciones de las células madre epiteliales intestinales en el intestino delgado. En este protocolo, se establece un sistema de cultivo de organoides colónicos para estudiar el papel de la claudina-7 en el intestino grueso.

Introducción

El cultivo de organoides intestinales es un sistema tridimensional (3D) ex vivo en el que las células madre se aíslan de las criptas intestinales del tejido primario y se colocan en una matriz de gel 1,2. Estas células madre son capaces de autorrenovación, autoorganización y funcionalidad de órganos2. Los organoides imitan el microambiente tisular y son más similares a los modelos in vivo que a los modelos de cultivo celular in vitro bidimensionales (2D), aunque menos manipulables que las células 3,4. Este modelo elimina los obstáculos encontrados en los modelos 2D, como la falta de adherencias adecuadas célula-célula, interacciones célula-matriz y poblaciones homogéneas, y también reduce las limitaciones de los modelos animales, incluidos los altos costos y los largos períodos de tiempo5. Los organoides intestinales, también conocidos como colonoides para aquellos cultivados a partir de células madre derivadas de criptas colónicas, son esencialmente miniórganos que contienen un epitelio que incluye todos los tipos de células que estarían presentes in vivo, así como un lumen. Este modelo permite la manipulación del sistema para estudiar muchos aspectos del intestino, como el nicho de células madre, la fisiología intestinal, la fisiopatología y la morfogénesis intestinal 3,5,6. También proporciona un gran modelo para el descubrimiento de fármacos, estudiando trastornos intestinales humanos como la enfermedad inflamatoria intestinal (EII) y el cáncer colorrectal, el desarrollo de tratamientos personalizados específicos para el paciente y el estudio de la regeneración de tejidos 4,7,8,9. Además, el sistema organoide también puede ser utilizado para estudiar la comunicación celular, el metabolismo de los fármacos, la viabilidad, la proliferación y la respuesta a estímulos 7,8. Si bien los modelos animales pueden usarse para probar terapias potenciales para afecciones patológicas intestinales, son bastante limitados, ya que estudiar múltiples medicamentos a la vez plantea un desafío. Hay más variables de confusión in vivo, y el costo y el tiempo asociados son altos y largos, respectivamente. Por otro lado, el sistema de cultivo de organoides permite el cribado de muchas terapias a la vez en un período de tiempo más corto y también permite el tratamiento personalizado mediante el uso del cultivo de organoides derivado del paciente 4,8. La capacidad de los organoides colónicos para imitar la organización tisular, el microambiente y la funcionalidad también los convierte en un excelente modelo para estudiar la regeneración y la reparación de tejidos9. Nuestro laboratorio ha establecido un sistema de cultivo de organoides del intestino delgado para estudiar el efecto de la claudina-7 en las funciones de las células madre del intestino delgado10. En este estudio, se establece un sistema de cultivo de organoides del intestino grande para estudiar la capacidad o falta de capacidad de las células madre para autorrenovarse, diferenciarse y proliferar en un modelo de knockout condicional de claudina-7 (cKO).

La claudina-7 es una proteína de unión estrecha (TJ) muy importante que se expresa altamente en el intestino y es esencial para mantener la función e integridad de TJ11. Los ratones cKO sufren de un fenotipo similar a la EII, exhibiendo inflamación severa, ulceraciones, desprendimiento de células epiteliales, adenomas y aumento de los niveles de citoquinas11,12. Si bien es ampliamente aceptado que las claudinas son vitales para la función de barrera epitelial, están surgiendo nuevos roles para las claudinas; Están involucrados en la proliferación, migración, progresión del cáncer y función de las células madre 10,12,13,14,15,16,17. Actualmente se desconoce cómo la claudina-7 afecta el nicho de células madre y la función de las células madre del colon. Como el intestino se renueva rápidamente aproximadamente cada 5-7 días, el mantenimiento del nicho de células madre y el funcionamiento adecuado de las células madre activas es vital18. Aquí, se establece un sistema para examinar los posibles efectos reguladores de la claudina-7 en el nicho de células madre del colon.

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Protocolo

Todos los experimentos y procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Carolina del Este (ECU) y se llevaron a cabo de conformidad con las pautas de los Institutos Nacionales de Salud y ECU sobre el cuidado y uso de animales de laboratorio. Se generaron ratones knockout de claudina-7 específicos intestinales inducibles cruzando ratones transgénicos C57BL6 claudina-7-flox con ratones Villin-CreERT219. En este estudio se utilizaron ratones machos y hembras de 3 meses de edad.

1. Preparación del reactivo/equipo

  1. Enfríe los siguientes reactivos/equipos antes de comenzar sus experimentos asociados: solución salina tamponada con fosfato (PBS) para lavar el tejido del colon durante el aislamiento de la cripta; un balancín/rotador (colocar en nevera a 4 °C) para incubación con medios de disociación epitelial.
    1. Retire la matriz de gel (ver Tabla de materiales) a -20 °C y descongele en hielo antes de chapar.
    2. Enfríe previamente la centrífuga a 4 °C antes de girar las criptas para el chapado.
    3. Enfríe el tampón de citrato de sodio al 0,1% (consulte la Tabla de materiales) y manténgalo en hielo antes de la detección de muerte celular in situ .
  2. Calentar los siguientes reactivos antes de comenzar sus experimentos asociados: una placa de cultivo de 96 pocillos durante 24 h antes del recubrimiento; Medios L-WRN (consulte la Tabla de materiales) antes de agregarlos a las criptas plateadas y antes de cada cambio de medios.
    1. Calentar el baño maría a 94 °C antes de teñir.

2. Aislamiento de la cripta colónica murina

  1. Prepare los medios necesarios siguiendo los pasos a continuación.
    NOTA: Los volúmenes de medios se calculan aquí para el tejido colónico de dos ratones.
    1. Preparar medios de disociación epitelial: 30 mL de 1x PBS + 400 μL de 0,5 M EDTA + 50 μL de 10 mM Y-27632 diclorhidrato (ver Tabla de Materiales). Mantener en hielo hasta su uso.
    2. Preparar medios de disociación de criptas: 10 mL de 1x PBS + 10 μL de 10 mM Y-27632 diclorhidrato. Mantener en hielo hasta su uso.
    3. Suplemento de medios L-WRN: 50 ml de medios L-WRN + 47,5 ml de DMEM glucosa alta con L-glutamina + 500 μL de L-glutamina + 500 μL de pennicilina/estreptomicina + 1.000 μL de suplemento B-27 (50x) + 500 μL de suplemento N2 (100x) + 50 μL de solución tampón HEPES (1 M) (ver Tabla de materiales).
    4. Filtrar el medio L-WRN completo (suplementado) y la alícuota para su almacenamiento a -20 °C durante un máximo de 3 meses.
      NOTA: El medio descongelado es estable a 4 °C durante un máximo de 2 semanas.
  2. Realice el aislamiento de la cripta.
    1. Para la anestesia general, agregue 1 ml de isoflurano al algodón y colóquelo dentro de un casete de plástico dentro de una cámara de anestesia de 0.09 pies cúbicos (consulte la Tabla de materiales). Coloque el ratón en la cámara de anestesia hasta que la respiración se detenga (aproximadamente 3-5 min) y luego realice la luxación cervical20.
    2. Haga una incisión de aproximadamente 2 pulgadas por la línea media del ratón, fijando la piel de la espalda para exponer el abdomen. Aislar el colon cortando justo debajo del ciego desde el lado proximal y por encima del recto desde el lado distal21.
    3. Con fórceps, retire el tejido adiposo adherido al colon. Empuje suavemente las heces hacia afuera utilizando el extremo plano de los fórceps y corte el tejido abierto longitudinalmente.
    4. Lave el pañuelo de papel 10-15 veces con PBS frío 1x usando fórceps para "girar" el tejido alrededor de PBS entre lavados.
    5. Con tijeras limpias y afiladas, corte el tejido en trozos pequeños, de aproximadamente 3-5 mm de tamaño.
    6. Repita el proceso para el segundo ratón y combine las piezas de tejido en un tubo de 50 ml que contenga medios de disociación epitelial fría (paso 2.1.1).
    7. Incubar las piezas de tejido del colon en medios de disociación epitelial durante 90 min a 4 °C con un balanceo suave.
    8. Permita que los fragmentos de tejido se hundan hasta el fondo del tubo, luego deseche cuidadosamente los medios de disociación epitelial sin interrumpir el tejido. Repita este proceso al lavar el pañuelo 10-15 veces con PBS frío 1x. Deseche la mayor cantidad posible de PBS durante el lavado final.
    9. Añadir los medios de disociación de cripta (paso 2.1.2) al tubo de 50 ml que contiene trozos de tejido del colon y agitar continuamente durante 5-10 minutos con la mano.
      NOTA: Los medios deben volverse turbios de las criptas disociadas.
    10. Bajo la campana de cultivo celular, filtre el tejido y el medio con un filtro de células de nylon de 70 μm (consulte la Tabla de materiales) en un tubo fresco de 50 ml.
    11. Centrifugar a 200 x g durante 10 min a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante sin alterar el pellet que contiene la cripta.
      NOTA: Dependiendo del equipo, se pueden transferir los medios deformados a un tubo de 15 ml para centrifugar.
    12. Resuspender el pellet en ~3-4 mL de PBS frío 1x.
    13. Pipetear 10 μL de las criptas aisladas en una línea en un portaobjetos de microscopio. Bajo el microscopio, cuente el número de criptas largas y completas para estimar la concentración de criptas por 10 μL.
    14. Calcule el volumen apropiado de criptas para girar hacia abajo con el fin de colocar 10 criptas / μL en una placa de 96 pocillos.

3. Chapado de cripta

  1. Centrifugar un volumen apropiado de criptas aisladas en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml a 200 x g durante 5 min a 4 °C.
  2. Retire con cuidado el sobrenadante con una pipeta de 1.000 μL sin interrumpir las criptas granuladas.
  3. Agregue 100 μL de matriz de gel (suficiente para nueve pocillos) a las criptas peletizadas y pipete cuidadosamente para evitar la introducción de burbujas de aire.
    NOTA: Consulte la sección Discusión para obtener una descripción detallada de cómo mezclar la matriz de gel y las criptas. Por lo general, 100 μL es suficiente para nueve pozos.
  4. Permita que la matriz de gel se solidifique parcialmente (~1-2 min).
  5. Placa de 10 μL de la matriz de gel mezclada con las criptas en cada pocillo de una placa de cultivo de 96 pocillos precalentada para formar una forma de cúpula.
    NOTA: Coloque la cúpula en el centro del pozo. Tenga cuidado de no permitir que la matriz de gel se extienda a los lados del pozo. Consulte la sección Discusión para obtener una descripción detallada sobre la solidificación y el recubrimiento.
  6. Deje que la matriz de gel se fije completamente durante 10-20 minutos en una incubadora a 37 °C con 5% deCO2.
  7. Preparar la solución de trabajo final de los medios L-WRN.
    1. Añadir 100 μL de pennicilina/estreptomicina a una alícuota de 10 ml de medios L-WRN (ver paso 2.1.3) (estable durante 2 semanas a 4 °C).
    2. Añadir suplementos a 900 μL de medios L-WRN con pennicilina/estreptomicina: 0,9 μL de 1 mg/ml de EGF + 0,9 μL de 10 mM Y-27632 diclorhidrato.
      NOTA: Los volúmenes se basan en nueve pozos. El diclorhidrato Y-27632 solo se agrega el día 0 (en el momento del recubrimiento).
  8. Agregue 100 μL de medio a cada pocillo. Tenga cuidado de no interrumpir la cúpula.
  9. Incubar a 37 °C con 5% deCO2 durante 24 h.

4. Creando el knockout de claudina-7 en la cultura

  1. Deje que las criptas crezcan normalmente en cultivo durante 24 h después del enchapado.
  2. En un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, añadir 2,7 μL de 1 mmol/L de 4-hidroxitamoxifeno (4OH-tamoxifeno) a 900 μL de medios L-WRN (concentración final de 3 μmol/L) + 0,9 μL de 1 mg/ml de EGF.
    NOTA: La solución madre de 4OH-tamoxifeno se prepara mezclando 4OH-tamoxifeno en polvo (ver Tabla de materiales) con 1x PBS a una concentración de 1 mmol / L.
  3. Retire los medios viejos de los pozos mediante succión al vacío.
  4. Agregue 100 μL de medios que contengan 4OH-tamoxifeno a cada pocillo y etiquételos como claudina-7 cKO/4OH-TAM.
    NOTA: DMSO debe agregarse a los pozos de control. Se deben agregar medios frescos que contienen 4OH-tamoxifeno cada 2 días.
  5. Incubar a 37 °C hasta el siguiente cambio de soporte (~2-3 días).

5. Mantenimiento organoide colónico

NOTA: Los medios deben cambiarse cada 2-3 días. Cultivo hasta 12 días.

  1. Preparar una nueva solución de trabajo final de medios L-WRN: 900 μL de medios L-WRN + 0,9 μL de 1 mg/ml de EGF.
  2. Retire los medios viejos de los pozos mediante succión al vacío. Agregue medios frescos a los pozos.
    NOTA: Tenga cuidado de no interrumpir la cúpula.
  3. Incubar a 37 °C hasta el siguiente cambio de soporte.
    NOTA: Los cultivos se pueden mantener y pasar durante el tiempo deseado para el experimento. Los cultivos para el presente estudio se mantuvieron típicamente entre 9 y 12 días, pero uno puede desear continuar más, durante 15 o 20 días.

6. Recolección e incorporación de organoides colónicos

  1. Retire los medios viejos de los pozos mediante succión al vacío.
  2. Fijar los organoides con paraformaldehído al 4% (PFA) durante 1 h a temperatura ambiente.
    NOTA: El PFA es un material tóxico. Tome precauciones al usar este reactivo.
  3. Eliminar el PFA al 4% de los pocillos mediante aspiración al vacío y añadir sacarosa al 30% durante 24 h a 4 °C.
  4. Etiquete un molde de plástico y llénelo al 90% con un compuesto de temperatura óptima de corte (OCT) (consulte la Tabla de materiales).
  5. Retire el 30% de sacarosa de los pocillos mediante succión al vacío. Agregue 10 μL de 1x PBS a cada pocillo.
  6. Con una punta de pipeta, raye suavemente el fondo del pozo para disociar la cúpula que contiene organoides.
  7. Con una pipeta, retire el PBS que contiene los organoides disociados y cargue el líquido en el molde que contiene OCT.
    NOTA: Evite introducir burbujas en el compuesto OCT.
  8. Continúe este proceso hasta que todos los organoides hayan sido retirados de todos los pozos.
  9. En un matraz Dewar de acero inoxidable, añadir gránulos de hielo seco y 2-metilbutano (suficiente para cubrir los gránulos de hielo seco) (ver Tabla de materiales).
  10. Mantenga firmemente el bloque OCT que contiene organoides por encima del 2-metilbutano para congelarse rápidamente.
  11. Almacene el bloque OCT que contiene organoides a -80 °C hasta que esté listo para seccionar (se puede almacenar hasta por 1 año).

7. Inmunofluorescencia

  1. Seccionar el bloque OCT que contiene organoides a un espesor de 5 μm utilizando un criostato (véase la Tabla de materiales) a -20 °C.
  2. Para cada sección, verifique bajo el microscopio para asegurarse de que se haya capturado un organoide. Cuando finalice la sección, guarde los portaobjetos a -80 °C hasta que estén listos para teñirse (se pueden almacenar hasta 6 meses).
  3. Calentar los portaobjetos en tampón de citrato de sodio de 10 mM durante 10 min a 94 °C.
    NOTA: El tampón se produce disolviendo citrato de sodio en agua desionizada. Ajustar el pH a 6 con ácido clorhídrico.
  4. Deje que las diapositivas se enfríen en la mesa de trabajo durante 20 minutos. Enjuagar con agua destilada durante 5 min.
  5. Ensamble los portaobjetos en una rejilla de tinción (consulte la Tabla de materiales) con Triton X-100 al 0,2% e incube con glicina a 100 mM durante 15 min.
  6. Enjuague tres veces con 1x PBS durante 5 minutos cada una. Bloquear con albúmina sérica bovina (BSA) al 5% durante 45 min a temperatura ambiente.
  7. Incubar con el anticuerpo primario22 antimurino de conejo claudina-7 (diluido en BSA al 1%) durante la noche a 4 °C. Enjuague tres veces con 1x PBS durante 10 minutos cada una.
  8. Incubar con Cy3 anticuerpo secundario anti-conejo23 (diluido en BSA al 1%) durante 1 h a temperatura ambiente. Enjuague tres veces con 1x PBS durante 10 minutos cada una.
  9. Monte las guías con un medio de montaje apropiado (consulte la Tabla de materiales) con DAPI y agregue un cubreobjetos.

8. Detección de muerte celular

  1. Fijar los organoides dentro de los pocillos con paraformaldehído al 4% durante 1 h a temperatura ambiente. Enjuague con 1x PBS durante 5 min.
  2. Incubar la placa de cultivo en hielo con Triton X-100 al 0,1% en tampón de citrato de sodio al 0,1% frío durante 2 min. Enjuague dos veces con 1x PBS durante 5 minutos cada una.
  3. Preparar la reacción TUNEL24,25 utilizando TMR Red, un kit de detección de muerte celular in situ(ver Tabla de materiales). Añadir 50 μL de reactivos de reacción TUNEL a cada pocillo.
  4. Incubar en atmósfera humidificada durante 1 h a 37 °C en la oscuridad.
    NOTA: Todos los pasos restantes deben completarse en la oscuridad.
  5. Enjuague tres veces con 1x PBS durante 5 minutos cada una. Incubar con 1:2.500 Hoechst (diluido en 1x PBS, ver Tabla de materiales) durante 3 min.
  6. Enjuague tres veces con 1x PBS durante 5 minutos cada una. Utilice el filtro TRITC para visualizar imágenes en un microscopio fluorescente (consulte la Tabla de materiales).

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Resultados

Con el fin de examinar los efectos reguladores de la claudina-7 en las células madre del colon, se aislaron criptas colónicas del tejido murino del colon como se describió anteriormente y se muestra en la Figura 1A. Una vez que las criptas se aislaron del tejido primario, se colocaron en una matriz 3D en una placa de 96 pocillos para crecer durante 11 días (Figura 1). Las criptas sanas normales cerrarán la luz y se convertirán en esferoides para el día 2 y event...

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Discusión

El cultivo de organoides es un excelente modelo para estudiar la función de las células madre, la fisiología intestinal, el descubrimiento de fármacos, las enfermedades intestinales humanas y la regeneración y reparación de tejidos 7,8,9,10,11,26. Si bien tiene muchas ventajas, puede ser difícil de establecer. Se debe tener c...

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

Este estudio fue financiado por NIH DK103166.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0.09 pies cúbicos desecador de vacío que ahorra espacio United States Plastic Corp78564cámara de anestesia
0,5 M EDTA pH 8.0InvitrogenAM9261
1,5 mL tubos de microcentrífugaThermoFisher69715
15 mL tubos de centrífuga cónicosFisher Scientific14-959-53A
1x Dulbecco' s Solución salina tamponada con fosfatoGibco14190-144
2-metilbutanoSigma277258
4% paraformaldehídoThermoFisherJ61899.
4-hidroxitamoxifeno (4OH-TAM)Sigma579002
tubos de centrífuga cónicos de 50 mLFisher Scientific14-432-22
70 µ m colador de células de nylonCorning352350
placa de cultivo de 96 pocillosGreiner Bio-One655180
B-27 Suplemento (50x)Gibco12587-010
Albúmina sérica bovinaFisher ScientificBP1605-100
Claudin-7 anticuerpo anti-conejo murinoImmuno-Biological Laboratories 18875
Cubreobjetos (24 x 50-1,5)Fisher Scientific12544E
Cryomoldsvwr25608-916
Cultrex RCF BME, Tipo 2R& D Systems3533-005-02de gel
Cy3 anticuerpo anti-conejoJackson Immunoresearch111-165-003
Matraz Dewar ThomasScientific1173F61
DMEM Alta glucosa con L-glutaminaATCC30-2002
EVOS FLoid Sistema de imagenThermoFisher4477136
Fluoro-Gel II con DAPIElectron Ciencias de la Microscopía17985-50
GlutaMAX (100x)Gibco35050-061
GlycineJT Baker4059-02
HEPES (1 M) Solución tampónGibco15630-080
HoechstThermoFisher62249
Kit de detección de muerte celular in situ, TMR RedRoche12156792910
IsofluranoPivetal07-893-8440
L-WRN MediaEscuela de Medicina de Harvard Derivación y cultivo de organoides gastrointestinales CoreN/A
Kit quirúrgico para ratonesKent Scientific CorporationINSMOUSEKIT
Murine EGFPeproTech315-09-500UG
N2 Suplemento (100x)Gibco17502-048
Temperatura óptima de corte (OCT) compuesto Agar ScientificAGR1180
Penicilina-EstreptomicinaGibco15140-122
Sequenza Rackvwr10129-584
Citrato de sodioFisher ScientificS-279
SacarosaSigmaS9378
Triton X-100SigmaX100
Filtro de vacío (0.22 µ m; acetato de celulosa)Corning430769
Y-27632 diclorhidratoTocris Bioscience1254
AK matriz

Referencias

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