Cultivo tridimensional de criptas colónicas murinas para estudiar la función de las células madre intestinales ex vivo

Amna N. Naser; Qun Lu; Yan-Hua Chen

doi:10.3791/64534

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Artículo de método

Cultivo tridimensional de criptas colónicas murinas para estudiar la función de las células madre intestinales ex vivo

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DOI:

10.3791/64534

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11 de octubre de 2022

Amna N. Naser¹ , Qun Lu¹ , Yan-Hua Chen¹

¹Department of Anatomy and Cell Biology, Brody School of Medicine, East Carolina University

En este artículo

Resumen

El presente protocolo describe el establecimiento de un sistema organoide colónico murino para estudiar la actividad y el funcionamiento de las células madre colónicas en un modelo knockout de claudina-7.

Resumen

El epitelio intestinal se regenera cada 5-7 días, y es controlado por la población de células madre epiteliales intestinales (IESC) ubicada en la parte inferior de la región de la cripta. Las IESC incluyen células madre activas, que se autorrenuevan y se diferencian en varios tipos de células epiteliales, y células madre quiescentes, que sirven como células madre de reserva en caso de lesión. La regeneración del epitelio intestinal está controlada por las capacidades autorrenovadoras y diferenciadoras de estos IESC activos. Además, el equilibrio de la población de células madre de la cripta y el mantenimiento del nicho de células madre son esenciales para la regeneración intestinal. El cultivo de organoides es un enfoque importante y atractivo para estudiar proteínas, moléculas de señalización y señales ambientales que regulan la supervivencia y las funciones de las células madre. Este modelo es menos costoso, consume menos tiempo y es más manipulable que los modelos animales. Los organoides también imitan el microambiente tisular, proporcionando relevancia in vivo . El presente protocolo describe el aislamiento de criptas colónicas, incrustando estas células de cripta aisladas en un sistema de matriz de gel tridimensional y cultivando células de cripta para formar organoides colónicos capaces de autoorganización, proliferación, autorrenovación y diferenciación. Este modelo permite manipular el entorno, eliminando proteínas específicas como la claudina-7, activando / desactivando las vías de señalización, etc., para estudiar cómo estos efectos influyen en el funcionamiento de las células madre del colon. Específicamente, se examinó el papel de la proteína de unión estrecha claudina-7 en la función de las células madre del colon. Claudina-7 es vital para mantener la homeostasis intestinal y la función e integridad de barrera. La eliminación de claudina-7 en ratones induce un fenotipo similar a la enfermedad inflamatoria intestinal que exhibe inflamación intestinal, hiperplasia epitelial, pérdida de peso, ulceraciones de la mucosa, desprendimiento de células epiteliales y adenomas. Anteriormente, se informó que la claudina-7 es necesaria para las funciones de las células madre epiteliales intestinales en el intestino delgado. En este protocolo, se establece un sistema de cultivo de organoides colónicos para estudiar el papel de la claudina-7 en el intestino grueso.

Introducción

El cultivo de organoides intestinales es un sistema tridimensional (3D) ex vivo en el que las células madre se aíslan de las criptas intestinales del tejido primario y se colocan en una matriz de gel ^1,2. Estas células madre son capaces de autorrenovación, autoorganización y funcionalidad de órganos². Los organoides imitan el microambiente tisular y son más similares a los modelos in vivo que a los modelos de cultivo celular in vitro bidimensionales (2D), aunque menos manipulables que las células ^3,4. ....