Summary
A ligadura parcial do nervo ciático induz dor neuropática crônica de longa duração, caracterizada por respostas exageradas a estímulos térmicos e mecânicos. Este modelo murino de dor neuropática é comumente usado para estudar terapias inovadoras para o tratamento da dor. Este artigo descreve em detalhes o procedimento cirúrgico para melhorar a padronização e reprodutibilidade.
Abstract
O manejo da dor crônica permanece desafiador até hoje, e os tratamentos atuais estão associados a efeitos adversos, incluindo tolerância e dependência. A dor neuropática crônica resulta de lesões ou doenças no sistema somatossensorial. Para investigar potenciais terapias com efeitos colaterais reduzidos, modelos de dor em animais são o padrão-ouro em estudos pré-clínicos. Portanto, modelos bem caracterizados e bem descritos são cruciais para o desenvolvimento e validação de terapias inovadoras.
A ligadura parcial do nervo ciático (NPNs) é um procedimento que induz dor neuropática crônica em camundongos, caracterizada por hipersensibilidade mecânica e térmica, dor contínua e alterações na temperatura do membro, tornando esse modelo um ótimo ajuste para estudar a dor neuropática pré-clinicamente. O NPNp é um modelo vantajoso para o estudo da dor neuropática, pois reproduz muitos sintomas observados em humanos com dor neuropática. Além disso, o procedimento cirúrgico é relativamente rápido e simples de ser realizado. O NPNp unilateral de um membro permite a comparação entre as patas ipsilateral e contralateral, bem como a avaliação da sensibilização central.
Para induzir hipersensibilidade neuropática crônica, um fio de nylon inabsorvível 9-0 é usado para ligar o terço dorsal do nervo ciático. Este artigo descreve o procedimento cirúrgico e caracteriza o desenvolvimento de dor neuropática crônica por meio de múltiplos testes comportamentais comumente utilizados. Como uma infinidade de terapias inovadoras estão sendo investigadas para o tratamento da dor crônica, este artigo fornece conceitos cruciais para a padronização e uma descrição precisa das cirurgias necessárias para induzir dor neuropática.
Introduction
A dor crônica é um problema de saúde significativo em todo o mundo e é um dos problemas de saúde mais caros nos Estados Unidos. O tratamento da dor crônica é mais bem conduzido quando as modalidades farmacológica e não farmacológica são utilizadas de forma multidisciplinar1. O manejo da dor crônica é desafiador e, em alguns casos, não trata adequadamente a dor2. Portanto, métodos novos e complementares são necessários para melhorar o tratamento da dor crônica, e modelos animais são cruciais para investigar terapias inovadoras.
A dor neuropática crônica resulta de lesões ou doenças no sistema somatossensorial, incluindo diabetes, infecções, compressões nervosas ou doenças autoimunes3. A dor neuropática depende tanto de mecanismos de sensibilização periférica quanto central e origina-se de uma lesão dos nervos. Essa dor pode ser caracterizada por hiperalgesia e alodínia evocadas pelo toque e termicamente, dor contínua e mudanças na temperatura do membro afetado4. Para melhor entender os mecanismos e avançar novos tratamentos, vários modelos têm sido desenvolvidos em roedores para mimetizar os sintomas e as causas da dor neuropática5. Por exemplo, a dor neuropática pode ser induzida com injeções de quimioterápicos, ligadura do nervo espinhal (LN), lesão de constrição crônica (ICC) do nervo ciático, LNPp, lesão do nervo poupado, transecção do nervo ciático e trisecção do nervo ciático6. Notadamente, a ligadura do nervo ciático reproduz múltiplas características da dor neuropática observadas em humanos, como hipersensibilidade mecânica e térmica, ou alterações na temperatura do membro afetado, características da síndrome dolorosa complexa regional (SDCR)7. Assim, esse modelo é adequado para o estudo da SDCR ou de qualquer outra lesão nervosa que induza dor neuropática crônica. O modelo foi desenvolvido pela primeira vez por Seltzer em 19908, sendo amplamente utilizado em estudos de dor para investigar novos compostos analgésicos ou avaliar os efeitos cognitivos da dor crônica 9,10,11,12,13. O modelo apresenta alta reprodutibilidade, e a ligadura parcial preserva as respostas comportamentais aos estímulosperiféricos6.
Muitos dos modelos atualmente utilizados apresentam deficiências não observadas no PNLp. O modelo CCI apresenta uma variabilidade de lesão muito maior entre cada animal, dependendo do conforto do constritor, e a autotomia altera os dígitos da pata traseira, tornando o modelo inadequado para análisecomportamental6. O modelo SNL é uma cirurgia muito mais complicada e mais longa, que não só requer habilidades técnicas avançadas, mas também apresenta um alto risco de déficits motoresgraves3. Essas deficiências não são observadas no modelo pSNL. A facilidade de reprodutibilidade, a curta duração da cirurgia e o risco reduzido de déficits motores observados no pós-operatório tornam esse modelo valioso para o estudo da dor neuropática periférica 8,14. No entanto, o próprio procedimento de ligadura parcial pode ter variabilidade entre os experimentadores, resultando em menor consistência no número de fibras nervosas ligadas. Assim, apresentar os detalhes da cirurgia é fundamental para aumentar a reprodutibilidade entre os estudos.
Para induzir neuropatia crônica, uma sutura de náilon inabsorvível 9-0 é usada para ligar um terço da largura do nervo ciático. Após a cirurgia, as respostas aos estímulos térmicos e mecânicos são exageradas, iniciando-se no 1º dia de pós-operatório e durando mais de 50dias8. Aqui, as sensibilidades térmica e mecânica foram avaliadas ao longo de 28 dias usando os testes de Hargreaves, placa quente e filamento de von Frey. Todos os ensaios comportamentais demonstraram a consistência da hipersensibilidade de longa duração. Demonstrou-se que esse modelo tem efeitos dose-dependentes tanto da morfina quanto do ibuprofeno, confirmando que é adequado para estudos pré-clínicos de dor. Notavelmente, este artigo descreve as instruções para uma ferramenta de vidro artesanal única, conhecida como "gancho de vidro nervoso". Esta ferramenta é usada no lugar da pinça para manipular o nervo e evitar lesões nervosas adicionais não intencionais durante a cirurgia.
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Protocol
Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade do Arizona e estão em conformidade com as diretrizes para o uso de animais de laboratório do National Institutes of Health (publicação do NIH nº 80-23, 1966). Camundongos C57Bl6/J adultos livres de patógenos (peso no teste: 22-28 g) foram alojados em gaiolas de camundongos do biotério padrão (cinco camundongos por gaiola) em salas climatizadas em um ciclo claro/escuro de 12 h e tiveram acesso a comida e água ad libitum. Todos os experimentos comportamentais foram conduzidos por experimentadores cegos para as condições de tratamento.
1. Linha de base: a medida da sensibilidade mecânica
- Após a chegada dos ratos, deixe-os habituar-se ao biotério por 1 semana. Em seguida, habituar os animais ao manejo experimental por ≥7 dias a partir de então.
- Habituar os camundongos ao aparelho de teste de von Frey por 1 h antes do teste, colocando-os em caixas de Plexiglas transparentes, em uma tela de arame, na mesma sala da sala de teste - de preferência com o experimentador presente na sala durante a habituação.
- Estabelecer o limiar basal de retirada da pata através do método "up-and-down" usando filamentos de von Frey descritos na Tabela Suplementar S1, começando com o filamento de 3,61 (3,9 mN).
- Medir a resposta de retirada à sondagem da pata traseira médio-plantar com uma série de monofilamentos finos (von Frey) calibrados. Aplicar cada filamento perpendicularmente uma vez à superfície plantar da pata traseira ipsilateral do pSNL dos animais mantidos em gaiolas de malha metálica suspensas. Avaliar a sensibilidade mecânica pelo método "up-and-down"15: determinar o limiar de retirada aumentando ou diminuindo sequencialmente a força do estímulo, correspondente ao tamanho do filamento. Aplique sequencialmente cada filamento uma vez.
NOTA: O experimentador deve evitar estimular qualquer um dos coxins para obter resultados consistentes entre os animais. - Por exemplo, se o animal não responder ao filamento 3,61, use o filamento 4,08 mais espesso (9,8 mN) (uma resposta é notada visualmente como retirada, agitação ou lambida da pata afetada); se o animal respondeu pela primeira vez, utilizar o filamento 3,22 (1,6 mN) mais fino. Continue a usar filamentos cada vez mais espessos ou decrescentes, dependendo se o animal teve respostas subsequentes positivas ou negativas, respectivamente. Relate respostas negativas e positivas na ficha técnica apresentada na Tabela Suplementar S1. Teste a mesma pata 4x com filamentos diferentes após a primeira resposta positiva.
- Medir a resposta de retirada à sondagem da pata traseira médio-plantar com uma série de monofilamentos finos (von Frey) calibrados. Aplicar cada filamento perpendicularmente uma vez à superfície plantar da pata traseira ipsilateral do pSNL dos animais mantidos em gaiolas de malha metálica suspensas. Avaliar a sensibilidade mecânica pelo método "up-and-down"15: determinar o limiar de retirada aumentando ou diminuindo sequencialmente a força do estímulo, correspondente ao tamanho do filamento. Aplique sequencialmente cada filamento uma vez.
2. Linha de base: a medida da sensibilidade térmica usando o teste de Hargreaves
- Após a chegada dos ratos, deixe-os habituar-se ao biotério por 1 semana. Em seguida, habituar os animais ao manejo experimental por ≥7 dias a partir de então.
- Habituar os ratos ao aparelho de teste Hargreaves por 1 h antes do teste, colocando-os em caixas de Plexiglas transparentes, na mesma sala da sala de teste - de preferência com o experimentador presente na sala durante a habituação.
NOTA: O teste de Hargreaves requer que o animal fique parado por alguns segundos. Com ratos, a habituação é a chave para um experimento bem-sucedido. Assim, se os ratos permanecerem muito ativos após 1 h de habituação, permita que eles se aclimatem por mais tempo, conforme necessário.- Determinar as latências de retirada da pata conforme descrito por Hargreaves et al.16. Aclimate os ratos dentro dos compartimentos de Plexiglas em uma placa de plexiglass transparente.
- Focalize uma fonte de calor radiante (lâmpada de projetor de alta intensidade) na superfície plantar da pata traseira ipsilateral ao pSNL. Ajustar a intensidade da fonte de calor para obter uma linha de base de latência de retirada da pata de aproximadamente 10 s. Em seguida, mantenha a intensidade constante pelo restante do experimento.
- Aguarde que um detector de movimento interrompa automaticamente o estímulo e o temporizador quando a pata for retirada. Use um ponto de corte máximo de 33,5 s para evitar danos teciduais.
OBS: O ponto de corte é determinado com base em experimentos e artigos anteriores para evitar danos adicionais à pele11,17,18. Com a intensidade utilizada neste estudo, 33,5 é o ponto de corte, correspondendo a uma intensidade de estímulo de 30 (50 W) utilizando o aparelho de Hargreaves. O comportamento observado é reflexo, não voluntário. - Estabelecer as latências basais de retirada da pata utilizando o aparelho de Hargreaves e visando a superfície plantar da pata traseira ipsilateral do pSNL. Iniciar a estimulação térmica e registrar a latência de retirada. Para evitar afetar a temperatura do estímulo térmico, limpe qualquer urina durante os ensaios.
3. Linha de base: a medida da sensibilidade térmica usando o teste da placa quente
- Habituar os animais à sala de ensaio durante 1 h antes dos ensaios.
NOTA: Como a temperatura ambiente é importante e pode afetar as respostas ao teste de placa quente, certifique-se de que a temperatura da sala esteja consistentemente em torno de 22 °C durante o período de habituação e durante o período de teste. - Ajuste a placa quente para 52 °C, pois foi demonstrado que essa temperatura provoca idealmente uma resposta térmica aversiva19.
- Coloque o animal na câmara de ensaio e inicie um cronómetro.
- Observe comportamentos nocifensivos (i.e., retirada da pata, lambedura, agitação). Como a cirurgia de NPNp afeta o membro pélvico, desconsidere quaisquer comportamentos observados nos membros anteriores (especialmente lamber o membro anterior).
- Pare o cronômetro assim que o comportamento nocifensivo for observado.
- Retire o animal da câmara e registre a latência para esse comportamento.
NOTA: Retire os animais da câmara após um máximo de 30 s para evitar danos nos tecidos. Além disso, é importante ressaltar que o comportamento observado é um comportamento reflexo, não voluntário. - Limpar a câmara de teste com etanol 70% entre os animais para reduzir o impacto comportamental dos odores. Para não afetar a temperatura do estímulo térmico, limpe o aparelho de qualquer urina entre cada animal testado.
- Para confirmar os resultados, grave vídeos dos animais na câmara de placa quente durante os testes para revisão após os animais terem sido testados.
NOTA: Usando a revisão de vídeo para quantificar latências, o experimentador pode observar repetidamente o teste e analisar de perto comportamentos nocifensivos que podem ter sido perdidos durante a observação em tempo real.
4. Preparo pré-operatório
NOTA: Certifique-se de que as gaiolas limpas estão disponíveis para recuperar os ratos após a cirurgia. Limpar a área cirúrgica com etanol 70%, desinfetar as mãos com etanol 70%, usar luvas estéreis, usar equipamentos de proteção individual (EPIs) adequados (jaleco, rede de cabelo, sapatilhas) e praticar técnicas estéreis durante toda a cirurgia.
- Preparar os instrumentos (Figura Suplementar S1) e recursos adicionais (gaze) a serem utilizados na cirurgia, autoclavando-os previamente.
- Induzir anestesia com isoflurano volátil e ajustar conforme necessário para manter o plano cirúrgico. Certifique-se de que o oxigênio esteja em uma taxa de fluxo adequada.
- Para garantir que o animal esteja anestesiado, aperte os dedos da pata traseira com uma pinça para garantir a ausência do reflexo da pata e verifique o reflexo de piscar da córnea antes de aplicar pomada oftálmica lubrificante.
OBS: Os analgésicos não podem ser oferecidos neste estudo, pois podem alterar a via da dor que se pretende analisar ou mesmo neutralizar e invalidar o comportamento que está sendo mensurado de acordo com os objetivos da pesquisa da dor20,21,22. - Ao escolher de que lado realizar a cirurgia (à esquerda é demonstrado aqui), raspe a pata traseira do animal ao redor da região da coxa, inferiormente em direção à patela, superiormente em direção ao quadril e acima do fêmur. Limpe 3x com clorexidina em uma direção com três gazes separadas, alternadas com soro fisiológico estéril quente.
OBS: Daqui para frente, certifique-se de que todos os animais tenham a cirurgia realizada do mesmo lado para manter a consistência. - Deslize a perna através de uma fenda feita em um drape estéril de 10 cm x 10 cm para criar um campo estéril ao redor da perna de escolha.
5. Procedimento cirúrgico
- Com tesoura cirúrgica fina (Figura Suplementar S1F), confeccione-se um pequeno corte de 2 mm da pele na linha média da face lateral da coxa. Deslize a tesoura sob a pele em um movimento circular para romper a fáscia e criar uma folga, ampliando o espaço da incisão.
- Usando pinça de amarração (Figura Suplementar S1H), crie uma incisão afiada verticalmente em um ângulo de 90° nos músculos da coxa, com 1 cm de profundidade.
- Insira a tesoura fina pequena (Figura Suplementar S1G) na mesma incisão, também em um ângulo de 90°, e espalhe-as suavemente para separar os músculos. Continue a fazer isso até que o nervo ciático seja visualizado.
- Localize o nervo ciático, que pode parecer brilhante e fino, correndo paralelamente à coxa vertical, na direção do quadril ao joelho. Retire a tesoura e a pinça de amarração do corpo antes de prosseguir.
- Use a pinça extrafina (Figura Suplementar S1D) e o gancho de vidro do nervo (Figura Suplementar S1E) para isolar o nervo por baixo. Liberte cuidadosamente o nervo dos tecidos conjuntivos circundantes em um local próximo ao trocanter do fêmur, que está mais próximo do quadril e mais distante do joelho.
- Deixe o nervo descansar sobre a haste de vidro e certifique-se de que a extremidade da haste impede que o nervo se desloque.
- Colocar um nó cirúrgico para amarrar 1/3 da largura do nervo ciático com fio de náilon 9-0, antes de este se dividir nos ramos fibular comum, tibial e sural3.
NOTA: A ramificação ocorre quando o nervo ciático percorre o joelho, afastando-se do quadril. Como esses três ramos do nervo têm três inervações diferentes, é imperativo colocar o nó cirúrgico antes da ramificação para garantir os mesmos déficits nervosos em todas as cirurgias com animais. - Tome cuidado para segurar os fios perto do nó ao puxar os fios com força, de modo a não puxar o nervo com força excessiva para evitar deslizar o nervo para fora da haste de vidro e evitar mais lesões por estiramento.
- Deslize cuidadosamente o nervo para fora da haste de vidro assim que o nó estiver completo e coloque-o de volta no local original no nível abaixo dos músculos separados.
- Sutura da incisão muscular com fio absorvível poliglicólico 5-0. Separadamente, sutura da pele com fio de polipropileno 6-0 inabsorvível.
- Registre o tempo de parada da cirurgia e da anestesia. Deixe o rato acordar, sozinho numa gaiola de recuperação, antes de o devolver a uma nova gaiola limpa.
OBS: Durante toda a cirurgia, pinça os dedos dos pés do animal para confirmar a manutenção adequada da anestesia e monitore sua respiração e perfusão corporal (vermelho, rosa, pálido). Se a respiração for significativamente reduzida ou o animal parecer pálido, considere reduzir o fluxo de anestesia ou aumentar o fluxo de oxigênio e ter uma seringa cheia de soro fisiológico pronta para injetar por via subcutânea para reidratar o animal. Em todos os momentos, o animal deve ter uma fonte de calor colocada abaixo dele para manter o calor corporal.
6. Procedimento de cirurgia simulada para animais controle
- Seguir os passos 5.1-5.11 do procedimento cirúrgico; Exclua as etapas 5.4-5.9.
7. Testes comportamentais pós-cirúrgicos
NOTA: Certifique-se de que o experimentador está cego para qualquer tratamento. A dor neuropática crônica se desenvolverá ao longo de 2 semanas após a cirurgia, após as quais testes comportamentais podem ser realizados após a administração de compostos de interesse.
- Use o teste de von Frey, Hargreaves ou placa quente para avaliar a hipersensibilidade térmica e mecânica e sua potencial reversão.
- Remover qualquer animal do estudo se ele atender aos critérios de desfecho descritos pelo comitê institucional de cuidados e uso de animais.
- Eutanasiar os animais seguindo os procedimentos descritos pelo comitê institucional de cuidados e uso de animais ao final dos testes comportamentais.
8. Análise dos dados
- von Frey:
- Analise os dados usando o método não paramétrico de Dixon, conforme descrito por Chaplan ecols.23, e expresse os dados como o limiar médio de retirada.
- Na página principal do software referenciado (ver Tabela de Materiais), selecione todos os filamentos que foram utilizados para o estudo (2,44, 2,83, 3,22, 3,61, 4,08, 4,31 e 4,56). No painel do grupo , selecione o filamento correspondente à última simulação. Na caixa em branco , relate as respostas positivas (X) e negativas (o). Anote os limiares informados na caixa à esquerda do padrão de respostas observado.
NOTA: Um exemplo de padrão e quantificação é apresentado na Figura Suplementar S2.
- Na página principal do software referenciado (ver Tabela de Materiais), selecione todos os filamentos que foram utilizados para o estudo (2,44, 2,83, 3,22, 3,61, 4,08, 4,31 e 4,56). No painel do grupo , selecione o filamento correspondente à última simulação. Na caixa em branco , relate as respostas positivas (X) e negativas (o). Anote os limiares informados na caixa à esquerda do padrão de respostas observado.
- Analise os dados usando o método não paramétrico de Dixon, conforme descrito por Chaplan ecols.23, e expresse os dados como o limiar médio de retirada.
- Hargreaves e chapa quente:
- Reporte as latências em uma planilha para posterior análise estatística.
- Plotar os resultados como a média das sensibilidades (limiares ou latências) em função do tempo.
9. Instruções sobre como fazer o gancho de vidro do nervo
OBS: Pratique a segurança contra incêndio durante todo esse processo. Use proteção adequada, como luvas ou óculos resistentes ao calor, conforme necessário.
- Ligue o queimador de Bunsen.
- Segure uma extremidade da haste de vidro (A) ao fogo em uma das mãos. À medida que essa haste de vidro derrete, use outra haste de vidro (B) na outra mão para guiar e puxar o vidro derretido na haste A. Retire a haste de vidro A do fogo e deixe a extremidade da porção derretida rolar naturalmente para dentro para formar uma pequena forma de esfera. Use a haste de vidro B para guiar esta forma.
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Representative Results
A dor neuropática crônica foi induzida pela ligadura parcial do nervo ciático de camundongos machos C57Bl6/J (Figura 1A). A sensibilidade mecânica foi avaliada utilizando-se filamentos de von Frey e o método "up-and-down". A sensibilidade térmica ao calor foi avaliada pelos testes de Hargreaves e placa quente. Todos os dados foram analisados com ANOVA two-way para medidas repetidas com correção de Geisser-Greenhouse para comparar o efeito da cirurgia de NPNp em animais simulados ao longo do tempo ou os efeitos de diferentes doses de morfina e ibuprofeno.
Camundongos submetidos à cirurgia de NPNp demonstraram limiares mais baixos para estímulos mecânicos em comparação com animais simulados ao longo de 28 dias (Figura 1B). Resultados semelhantes foram obtidos com a avaliação de hipersensibilidade térmica; as latências de retirada da pata após exposição ao estímulo térmico radiante foram aumentadas nos animais do pSNL (Figura 1C), assim como as latências de retirada quando os animais foram colocados em uma placa de 52 °C (Figura 1D).
Após o estabelecimento da dor neuropática crônica, 14 dias após a cirurgia, avaliamos os efeitos antinociceptivos de diferentes doses de morfina ou ibuprofeno. Os camundongos foram injetados intraperitonealmente com solução salina ou duas doses diferentes de morfina (1 e 5 mg/kg). Ambos os grupos injetados com morfina apresentaram reversão da hipersensibilidade induzida pela NPN, que durou de 1 (1 mg/kg) a 2 h (5 mg/kg) (Figura 2A). A hipersensibilidade mecânica retornou aos valores basais 4 h após a injeção de morfina. Quando duas doses diferentes de ibuprofeno (10 e 30 mg/kg) foram administradas intraperitonealmente aos camundongos, os resultados demonstraram menor hipersensibilidade mecânica em comparação aos camundongos injetados com solução salina (Figura 2B). Os efeitos antinociceptivos do ibuprofeno duraram até 2 h. Em geral, os resultados demonstraram que a cirurgia do NPNp induz dor neuropática crônica de longa duração. Além disso, pudemos demonstrar que esse modelo é sensível a diferentes doses de analgésicos.
Figura 1: Hipersensibilidade térmica e mecânica de longa duração em camundongos devido à ligadura parcial do nervo ciático. A sensibilidade térmica ao calor (teste de Hargreaves e placa quente) e mecânica aos filamentos de von Frey foram avaliadas para examinar a indução e persistência da hipersensibilidade em um modelo de dor neuropática crônica (NPNp). Os valores basais foram medidos antes da ligadura do nervo ciático, e a hipersensibilidade foi avaliada ao longo de 28 dias após a cirurgia. (A) A ilustração representa a ligadura parcial do nervo ciático. (B) Os limiares de retirada mecânica foram comparados entre camundongos sham e pSNL em cada momento. A ANOVA two-way para medidas repetidas com correção de Geisser-Greenhouse revelou efeito significativo do pSNL (F(1, 10) = 222,3, p < 0,0001, n = 5-7 por condição). O teste de comparações múltiplas de Sidak demonstrou um aumento significativo da hipersensibilidade entre os dias 1 e 28 (p < 0,05). (C) As latências de retirada térmica, medidas pelo teste de Hargreaves, foram comparadas entre camundongos sham e pSNL. A ANOVA two-way para medidas repetidas com correção de Geisser-Greenhouse revelou efeito significativo do pSNL (F(1 , 8) = 113,8; p < 0,0001, n = 4-6 por condição). O teste de comparações múltiplas de Sidak demonstrou aumento significativo da hipersensibilidade nos dias 2 e 14 (p < 0,05). (D) As latências de retirada térmica, medidas pelo teste da placa quente, foram comparadas entre camundongos sham e pSNL. A ANOVA bidirecional comum revelou um efeito significativo do pSNL (F(1, 32) = 19,10, p = 0,0001, n = 4-6 por condição). O teste de comparações múltiplas de Sidak demonstrou um aumento significativo da sensibilidade ao calor em 4 semanas após a cirurgia de NPNp (p = 0,0026). Os dados são apresentados como média ± S.E.M. Abreviaturas: NPNp = ligadura parcial do nervo ciático; BL = linha de base. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Reversão dose-dependente da hipersensibilidade mecânica induzida pelo pSNL por injeção intraperitoneal de morfina ou ibuprofeno. A hipersensibilidade mecânica (usando filamentos de von Frey) foi avaliada para examinar os potenciais efeitos antinociceptivos da morfina ou ibuprofeno em um modelo de camundongo de pSNL. Os valores basais (pré-NPNp) foram adquiridos antes da ligadura do nervo isquiático. Após o estabelecimento da dor neuropática crônica, no dia 14 os animais foram submetidos à base uma segunda vez para garantir a hipersensibilidade induzida pelo pSNL (pós-NPNp). Em seguida, duas doses de morfina (1/5 mg/kg) ou ibuprofeno (10/30 mg/kg) foram injetadas por via intraperitoneal. A potencial reversão da hipersensibilidade mecânica foi avaliada ao longo de 4 h após as injeções. (A) Os limiares de retirada mecânica foram comparados entre a condição salina e as duas doses de morfina. A ANOVA two-way para medidas repetidas com correção de Geisser-Greenhouse revelou efeito significativo de 1 mg/kg de morfina (F(1, 11) = 11,16, p = 0,0066, n = 6-7 por condição) e efeito significativo de 5 mg/kg de morfina (F(1, 10) = 21,78, p = 0,0009, n = 6 por condição). O teste de comparações múltiplas de Sidak demonstrou uma diminuição significativa da hipersensibilidade mecânica 1 h após a injeção para ambas as doses, mas apenas um efeito significativo para a condição de 5 mg/kg em 2 h (*p < 0,05). (B) Os limiares de retirada mecânica foram comparados entre a condição salina e as duas doses de ibuprofeno. A ANOVA two-way para medidas repetidas com correção de Geisser-Greenhouse revelou um efeito significativo de 10 mg/kg de iburofeno (F(1, 11) = 7,788, p = 0,0176, n = 6-7 por condição) e um efeito significativo de 30 mg/kg de ibuprofeno (F(1, 10) = 18,79 , p = 0,0015, n = 6 por condição). O teste de comparações múltiplas de Sidak demonstrou uma diminuição significativa da hipersensibilidade mecânica 1 e 2 h após a injeção para ambas as doses (*p < 0,05). Os dados são apresentados como média ± S.E.M. Abreviaturas: NPNp = ligadura parcial do nervo ciático; IP = intraperitoneal. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura Suplementar S1: Ferramentas cirúrgicas. As duas figuras ilustram as diferentes ferramentas utilizadas para a cirurgia. (A) Porta-agulhas Castroviejo fino; (B) porta-agulhas Castroviejo; (C) Pinça Micro Adson; (D) pinça Graefe extra fina; (E) gancho de vidro nervoso; (F) tesoura fina (11,5 cm); (G) tesoura fina (9 cm); (H) pinça de amarração; (I) fórceps de íris. Clique aqui para baixar este arquivo.
Figura suplementar S2: Padrão representativo das respostas de retirada da pata medidas pelo teste do filamento de von Frey. Para esta tentativa, o camundongo não respondeu às três primeiras estimulações, mas retirou a pata na quarta estimulação com o filamento 4,56. Após resposta positiva (x), utilizou-se um filamento mais fino (4,31), seguido de filamentos de tamanhos menores até que o camundongo não respondesse a outro filamento (neste caso, 4,08). O experimentador deve diminuir o tamanho dos filamentos, um a um, até a ausência de resposta (o). Após a ausência de resposta, o experimentador utilizou um filamento mais espesso até obter uma resposta positiva e diminuir seu tamanho após a resposta positiva (obtida aqui com o filamento 4,31). Quatro estímulos foram realizados após a primeira resposta positiva; o padrão cronológico de cada estimulação é anotado com números em vermelho no painel A. Neste caso, os filamentos de 2,44 a 3,22 nunca foram utilizados, pois o animal não apresentou resposta positiva com o filamento 3,61. (B) O padrão de respostas foi então preenchido no software Allodynia, relatado na mesma ordem em que os filamentos foram aplicados (000xx0x0), na caixa destacada em branco. O limiar resultante foi então calculado pelo software (2,60839). Clique aqui para baixar este arquivo.
Tabela Suplementar S1: Ficha de coleta de dados para o teste de von Frey. Esta tabela permite que os experimentadores preencham padrões de respostas ao usar filamentos de von Frey. Clique aqui para baixar este arquivo.
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Discussion
O tratamento da dor crônica muitas vezes requer medicação de longo prazo, tornando o tratamento da dor desafiador. Assim, os modelos pré-clínicos são uma ferramenta essencial para avaliar os potenciais benefícios de terapias inovadoras baseadas em abordagens farmacológicas ou não farmacológicas. Os inúmeros modelos de dor crônica neuropática trazem desafios devido ao aumento da variabilidade nas técnicas cirúrgicas entre diferentes pesquisadores, levando à redução da reprodutibilidade. Assim, é essencial caracterizar os potenciais efeitos antinociceptivos de novas terapias em múltiplos modelos bem caracterizados e padronizados.
Este relato demonstra que a ligadura parcial do nervo ciático resulta no desenvolvimento de dor neuropática crônica de longa duração em camundongos usando métodos relativamente baratos. O pSNL exagera as respostas a estímulos térmicos e mecânicos, e o modelo responde à administração de analgésicos comumente usados de forma dose-dependente. Portanto, o modelo pSNL parece ser um modelo conveniente e sensível para avaliar os potenciais benefícios de novos fármacos. As principais características da dor neuropática são hiperalgesia e alodínia. Este relato demonstra como a alodínia mecânica e a hiperalgesia térmica são afetadas. Entretanto, a hiperalgesia mecânica não foi mensurada. Há uma grande área cinzenta de sobreposição entre alodínia e hiperalgesia. Ambas as sensações se enquadram na hipersensibilidade geral a um estímulo sensorial24. Assim, a sensação estimulada pode ser percebida como outra sensação, como calor como dor fria ou tato como sensação de queimação. Portanto, hiperalgesia e alodínia são muitas vezes difíceis de distinguir, especialmente em modelos de dor animal.
O modelo pSNL tem sido usado em múltiplos estudos de dor crônica para avaliar o efeito de compostos analgésicos, os mecanismos subjacentes da dor crônica ou mesmo o impacto cognitivo da dor neuropática de longa duração. A persistência da hipersensibilidade mecânica até 70 dias permite o estudo dos efeitos a longo prazo de novas drogas25. É importante ressaltar que o período ideal para o teste comportamental abrange a primeira, segunda e terceira semanas após a cirurgia, uma vez estabelecida a dor crônica8,11,26,27. Para avaliar a potência e eficácia de um fármaco ou de uma terapia não farmacológica, tratamentos de controle positivo, como morfina ou ibuprofeno, devem ser considerados, dependendo do desenho experimental. Diferentemente do teste tail-flick, o teste da placa quente aplica um estímulo na pata que integra as vias supraespinais19. O teste da placa quente tem sido amplamente utilizado para caracterizar propriedades antinociceptivas de fármacos em modelos de dor neuropática crônica em estudos recentes 19,28,29,30,31,32,33.
Esse modelo foi utilizado para caracterizar novos tratamentos não opioides e identificar uma nova via de dor envolvendo o receptor de neurotensina tipo 211,13. Também foi utilizado para demonstrar o envolvimento das modulações glicinérgicas na dor crônica12 e o desenvolvimento de novas terapias e vias na intersecção do sono e da dor10. No entanto, até o momento, nenhum artigo apresentou uma explicação detalhada da cirurgia complementada com um vídeo descritivo.
Uma crítica comum ao PNNN e modelos similares é a confiabilidade da consistência do grau de dano causado pela lesão nervosa neuropática entre animais6. Este artigo descreve um procedimento para derreter e moldar manualmente uma haste de vidro para criar um gancho de vidro nervoso especial para resolver esse problema. A maioria das cirurgias com animais usa fórceps para captar nervos finos ou vasos. A ferramenta de gancho de vidro do nervo permite um método mais seguro e menos propenso a lesões para lidar com o nervo. Embora o objetivo deste modelo seja criar lesão nervosa, é prudente evitar danos adicionais ao nervo além daquele causado pela sutura colocada através de um terço da largura do nervo ciático. O gancho de vidro do nervo é uma superfície lisa e não prejudicial para o nervo descansar; Além disso, a bola/gancho na extremidade permite facilidade de captação e estabilização. Além disso, ao suturar o nervo, a técnica descrita acima (protocolo seção nota 5.7) recomenda segurar os fios profundamente dentro da cavidade corporal, mais próxima de onde o nó aparecerá. Isso evita o puxão no final das suturas e promove a aplicação de tensão na sutura mais próxima do nervo ao apertar o nó. Esta técnica evita lesões adicionais por estiramento se o nervo for inadvertidamente arrancado do gancho de vidro do nervo, em direção ao exterior da cavidade, no processo de amarrar o nó com mais força. Uma vantagem adicional é o uso de tesouras finas para fazer o corte inicial. Isso permite um local de incisão muito menor e, portanto, uma cicatrização mais rápida, ao contrário dos cortes maiores feitos com lâminas de bisturi.
Os métodos relatados neste artigo também têm algumas limitações. O desenvolvimento da dor crônica no modelo pSNL é afetado pelo sexo dos animais34. Portanto, é essencial que as pesquisas incluam ambos os sexos em suas análises. O objetivo deste relato foi enfocar um procedimento cirúrgico e não caracterizou dimorfismo sexual do modelo de dor. Vale ressaltar que as medidas de sensibilidade térmica em camundongos utilizando o teste de Hargreaves são desafiadoras; Os animais são obrigados a ficar parados em um pequeno recinto por alguns segundos enquanto o estímulo é aplicado. Assim, habituar os camundongos ao recinto de Plexiglass é um fator chave na obtenção de resultados bem-sucedidos. A mensuração da dor evocada também requer treinamento cuidadoso do experimentador. Recomenda-se tanto testes comportamentais evocados quanto espontâneos para avaliar a sensibilidade térmica, mecânica e funcionalidade do membro. Além disso, neste estudo, morfina e ibuprofeno foram usados como controles positivos para efeito antinociceptivo. Esses dois fármacos foram escolhidos por serem comumente utilizados como controles positivos em múltiplos modelos de dor e permitirem uma melhor comparação entre os diferentes modelos. No entanto, é importante mencionar que pregabalina e gabapentina são frequentemente prescritas para o tratamento da dor neuropática, e estudos com foco no tratamento da dor neuropática devem incluir esses fármacos como controles positivos.
Este relato descreve com precisão uma cirurgia comumente utilizada para o estudo da dor neuropática crônica. Permitir que pesquisadores e estagiários se beneficiem de uma descrição visual desse modelo de camundongo facilitará o desenvolvimento de projetos de pesquisa com foco na compreensão dos mecanismos da dor crônica ou visando à caracterização de terapias inovadoras. Além disso, o uso de múltiplos modelos de dor é essencial para melhorar a reprodutibilidade, e este relato facilitará a implementação do modelo pSNL em novos laboratórios.
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Disclosures
Os autores não têm conflitos de interesse a declarar. Nenhum dos autores do manuscrito recebeu qualquer remuneração ou qualquer reembolso ou honorários de qualquer outra forma. Os autores não são afiliados a nenhum fornecedor ou empresa farmacêutica associada a este estudo.
Acknowledgments
Esta pesquisa foi apoiada pelo Centro Nacional de Saúde Complementar e Integrativa [R01AT009716, 2017] (M.M.I.), pelo Centro Abrangente de Dor Crônica e Dependência-Universidade do Arizona (M.M.I.) e pelo Programa de Treinamento de Cientistas Médicos (MSTP) da Universidade do Arizona, Faculdade de Medicina, Tucson.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5/0, FS-2, 30" Undyed PGA Braided Polyglycolic Acid Synthetic Absorbable Suture | CP Medical | 421A | https://cpmedical.com/suturesearch/product/421a-visorb-50-fs-2-30/ |
| 6/0, P-1, 18" Blue Polypropylene Monofilament Non-Absorbable Suture | CP Medical | 8697P | https://cpmedical.com/suturesearch/product/8697p-polypro-60-p-1-18/ |
| 9/0 (0.3 metric) Nylon Black Monofilament Suture | Crestpoint Ophthalmics | MANI 1407 | https://crestpointophthalmics.com/mani-1407-suture-trape-spatula-nylon-black-mono-box-of-12.html |
| Allodynia Software | National Instruments, LabView 2015 | Quantification of mean withdrawal thresholds (Von Frey data) | |
| C57Bl6/J mice | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME | 000664 | https://www.jax.org/strain/000664 |
| Castroviejo needle holder | Fine Science Tools | 12565-14 | https://www.finescience.com/en-US/Products/Wound-Closure/Needle-Holders/Castroviejo-Needle-Holder/12565-14 |
| Cold Hot Plate Test | Bioseb | BIO-CHP | https://www.bioseb.com/en/pain-thermal-allodynia-hyperalgesia/563-cold-hot-plate-test.html |
| Elevated metal mesh stand for Von Frey | Bioseb | BIO-STD2-EVF | https://www.bioseb.com/en/pain-mechanical-allodynia-hyperalgesia/1689-elevated-metal-mesh-stand-30-cm-height-to-fit-up-to-2-pvf-cages.html |
| Extra fine Graefe forceps | Fine Science Tools | 11152-10 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-curved-medium-point-general-purpose-forceps/16100110 |
| Fine Castroviejo needle holder | Simovision/Geuder | 17565 | https://simovision.com/assets/Uploads/Brochure-Geuder-Ophthalmic-Surgical-Instruments-EN2.pdf |
| Fine scissors (11.5 cm) | Fine Science Tools | 14558-11 | https://www.finescience.com/en-US/Products/Scissors/Standard-Scissors/Fine-Scissors-Tungsten-Carbide-ToughCut%C2%AE/14558-11 |
| Fine scissors (9 cm) | Fine Science Tools | 14558-09 | https://www.finescience.com/en-US/Products/Scissors/Standard-Scissors/Fine-Scissors-Tungsten-Carbide-ToughCut%C2%AE/14558-09 |
| Iris forceps | Fine Science Tools | 11064-07 | https://www.finescience.com/en-US/Products/Forceps-Hemostats/Fine-Forceps/Iris-Forceps/11064-07 |
| Micro Adson forceps | Fine Science Tools | 392487 | https://www.fishersci.com/shop/products/micro-adson-tissue-forceps-1x2-teeth-german-steel/13820072#?keyword=adson%20forceps |
| Modular holder cages for rats and mice | Bioseb | BIO-PVF | https://www.bioseb.com/en/pain-mechanical-allodynia-hyperalgesia/1206-modular-holder-cages-for-rats-and-mice.html |
| Moretti/Effetre #240 Light Cobalt Blue glass rods 4 mm | Ebay | N/A | https://www.ebay.com/itm/402389491328?hash=item5db0485e80:g:agYAAOS w9CtfnIVJ&amdata=enc %3AAQAHAAAAwCoqvgWRo NTe5Vq8PWOgfE4ygWeW4tL k81J1AFu%2Fkcbsk6pxYtJi6 digE5TL9SzlgMzYUMNDr%2B dku2%2B%2FEvB1qXqFmebE 020SGs9LPDXLL5w21un7jrM0 9xfWYvIzBYQYh6FRWyUJngC uuA9Bkjb9lxtZoYlg5y6PyFR2P 34xFk5xaNC5ib65M1%2Fr%2F 4w2Iw45QqsSyXH2cuUKRom0 AGBoBaIr%2BbJw1VnlMjGuc9dtx 4fbPbqoBNSWjj3RbZPOPTYS8Q %3D%3D%7Ctkp%3ABk9SR4q6- 6LfYA |
| Plantar Test for Thermal Stimulation - Hargreaves Apparatus | Ugo Basile | 37570 | https://ugobasile.com/products/categories/pain-and-inflammation/plantar-test-for-thermal-stimulation |
| Touch-Test Sensory Evaluators, Set of 20 Monofilaments | North Coast Medical | NC12775-99 | https://www.ncmedical.com/products/touch-test-sensory-evaluators_1278.html |
| Tying forceps | Duckworth & Kent | 2-504ER8 | https://duckworth-and-kent.com/product/tying-forceps-9/ |
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