Summary
Le protocole décrit une lésion cérébrale traumatique légère dans un modèle murin. En particulier, un protocole étape par étape pour induire un léger traumatisme crânien fermé de la ligne médiane et la caractérisation du modèle animal est entièrement expliqué.
Abstract
Des modèles animaux hautement reproductibles de lésions cérébrales traumatiques (TCC), avec des pathologies bien définies, sont nécessaires pour tester les interventions thérapeutiques et comprendre les mécanismes de la façon dont un traumatisme crânien altère la fonction cérébrale. La disponibilité de plusieurs modèles animaux de TCC est nécessaire pour modéliser les différents aspects et sévérités du TCC observés chez les humains. Ce manuscrit décrit l’utilisation d’un traumatisme crânien fermé (CHI) médian pour développer un modèle murin de TCC léger. Le modèle est considéré comme léger parce qu’il ne produit pas de lésions cérébrales structurelles basées sur la neuroimagerie ou la perte neuronale macroscopique. Cependant, un seul impact crée suffisamment de pathologie pour que la déficience cognitive soit mesurable au moins 1 mois après la blessure. Un protocole étape par étape pour induire un CHI chez la souris à l’aide d’un impacteur électromagnétique guidé stéréotaxiquement est défini dans l’article. Les avantages du modèle CHI médian léger comprennent la reproductibilité des changements induits par les blessures avec une faible mortalité. Le modèle a été caractérisé temporellement jusqu’à 1 an après la blessure pour les changements neuroimageurs, neurochimiques, neuropathologiques et comportementaux. Le modèle est complémentaire aux modèles à crâne ouvert d’impact cortical contrôlé utilisant le même dispositif d’impacteur. Ainsi, les laboratoires peuvent modéliser à la fois un TCC diffus léger et un TCC focal modéré à sévère avec le même impacteur.
Introduction
Les lésions cérébrales traumatiques (TCC) sont causées par une force externe sur le cerveau, souvent associée à des chutes, des blessures sportives, de la violence physique ou des accidents de la route. En 2014, les Centers for Disease Control and Prevention ont déterminé que 2,53 millions d’Américains se sont rendus au service des urgences pour demander de l’aide médicale pour des accidents liés à un TCC1. Étant donné que les TCC légers (TCL) représentent la majorité des cas de TCC, au cours des dernières décennies, plusieurs modèles de TCC ont été adoptés, notamment la perte de poids, les traumatismes crâniens fermés entraînés par piston et les chocs corticaux contrôlés, les lésions par rotation, les lésions légères par percussion fluide et les modèles de blessures par souffle 2,3. L’hétérogénéité des modèles de TCLm est utile pour aborder les différentes caractéristiques associées au TCLm observées chez les personnes et pour aider à évaluer les mécanismes cellulaires et moléculaires associés aux lésions cérébrales.
Parmi les modèles couramment utilisés de traumatisme crânien fermé, l’un des premiers et des plus largement utilisés est la méthode de perte de poids, où un objet est laissé tomber d’une hauteur spécifique sur la tête de l’animal (anesthésié ou éveillé)2,4. Dans la méthode de perte de poids, la gravité de la blessure dépend de plusieurs paramètres, notamment la craniotomie pratiquée ou non, la tête fixe ou libre, ainsi que la distance et le poids de l’objet qui tombe 2,4. L’un des inconvénients de ce modèle est la grande variabilité de la gravité de la blessure et le taux de mortalité élevé associé à la dépression respiratoire 5,6. Une alternative courante consiste à administrer l’impact à l’aide d’un dispositif pneumatique ou électromagnétique, ce qui peut être fait directement sur la dure-mère exposée (impact cortical contrôlé: CCI) ou le crâne fermé (traumatisme crânien fermé: CHI). L’une des forces de la blessure entraînée par piston est sa reproductibilité élevée et sa faible mortalité. Cependant, l’ICC nécessite une craniotomie7,8, et une craniotomie elle-même induit une inflammation9. Au lieu de cela, dans le modèle CHI, il n’y a pas besoin de craniotomie. Comme déjà indiqué, chaque modèle a des limites. L’une des limites du modèle CHI décrit dans cet article est que la chirurgie est effectuée à l’aide d’un cadre stéréotaxique et que la tête de l’animal est immobilisée. Bien que l’immobilisation complète de la tête assure la reproductibilité, elle ne tient pas compte du mouvement après l’impact qui pourrait contribuer à la blessure associée à un TCL.
Ce protocole décrit une méthode de base pour effectuer un impact CHI avec un dispositif d’impact électromagnétiquedisponible dans le commerce 10 dans une souris. Ce protocole détaille les paramètres exacts impliqués pour obtenir une blessure hautement reproductible. En particulier, l’enquêteur a un contrôle précis sur les paramètres (profondeur de la blessure, temps de séjour et vitesse d’impact) pour définir précisément la gravité de la blessure. Tel que décrit, ce modèle CHI produit une lésion qui entraîne une pathologie bilatérale, à la fois diffuse et microscopique (c.-à-d. activation chronique des dommages gliaux, axonaux et vasculaires) et des phénotypes comportementaux 11,12,13,14,15. De plus, le modèle décrit est considéré comme bénin car il n’induit pas de lésions cérébrales structurelles basées sur l’IRM ou de lésions macroscopiques sur la pathologie même 1 an après la lésion16,17.
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Protocol
Les expériences effectuées ont été approuvées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université du Kentucky, et les lignes directrices ARRIVE et Guide for the Care and Use of Laboratory Animals ont été suivies au cours de l’étude.
1. Installation chirurgicale
REMARQUE: Les souris sont logées en groupes de 4-5 / cage, l’humidité dans la salle de logement est maintenue à 43%-47%, et la température est maintenue à 22-23 ° C. Les souris ont un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau et sont exposées à un cycle lumière/obscurité de 12 h / 12 h (7 h / 19 h).
- Utilisez une zone chirurgicale désignée, telle qu’une cagoule ou une salle d’intervention chirurgicale dédiée, pour effectuer la chirurgie des animaux.
- Assurez-vous que la zone chirurgicale comprend un coussin chauffant, une monture stéréotaxique équipée d’un impacteur électromagnétique et un masque d’anesthésie conçu pour administrer du gaz isoflurane (voir la figure 1A).
- Assurez-vous que le chirurgien ou le personnel impliqué dans la chirurgie porte une blouse de laboratoire propre, un masque facial, des gants et un capuchon chirurgical.
- Utilisez des outils chirurgicaux stériles, des applicateurs stériles à embout de coton et des compresses de gaze. Utilisez un stérilisateur à billes chaudes pour stériliser les instruments entre les souris pendant la journée de la chirurgie.
- Utilisez une chambre d’induction d’anesthésie pour préparer la souris à la chirurgie dans une zone préopératoire.
- Utilisez des coussins chauffants pour maintenir la température de l’animal, nettoyez les cages de détention postopératoires de la souris et des minuteries pour enregistrer le réflexe de redressement de la souris après la chirurgie.
2. Procédure préopératoire
- Préparer l’appareil de support de tête (voir la figure 1B).
- Retirez l’arête de l’extrémité laminée d’une ampoule de pipette en latex de 1 mL (extrémité gonflable) (voir la figure 1C).
- Fixez l’ampoule au tube à l’aide d’un parafilm (voir la figure 1C).
- Connectez le tube à une seringue de 10 ml à l’aide d’un robinet d’arrêt. Remplissez la seringue avec de l’eau (voir Figure 1C).
REMARQUE: L’ampoule de pipette en latex de 1 ml sera placée sous la tête de la souris pour déplacer la force d’impact loin des oreilles. Essayez d’éliminer autant d’air que possible de l’ampoule avant de l’utiliser afin que l’ampoule soit remplie principalement d’eau et non d’air.
- Configuration de l’impacteur.
- Sélectionnez l’embout de la sonde de 5 mm, vissez-la au piston en bas au centre de l’actionneur (à l’intérieur du plus grand cylindre) et serrez doucement la sonde sans appliquer de force excessive. Serrez de nouveau l’embout entre les impacts (voir la figure 1B).
- Avant d’allumer l’élément de frappe, assurez-vous que l’interrupteur Extend/Retract est positionné en position centrale Off. Ensuite, connectez le câble de l’actionneur à la prise située sur le panneau avant du boîtier de commande de l’élément de frappe et le câble du capteur à la prise située sur le panneau avant. Ensuite, mettez l’interrupteur d’alimentation sur le panneau arrière (voir Figure 1D).
REMARQUE: L’interrupteur à bascule Extend/Retract doit rester en position centrale Off lorsqu’il n’est pas utilisé. - Réglez la vitesse d’impact en faisant pivoter le gros bouton situé sur le côté gauche du boîtier de commande jusqu’à ce qu’une vitesse d’impact de 5,0 ± 0,2 m/s apparaisse à l’écran (voir Figure 1D).
- Réglez le compteur d’arrêt sur 100 ms en tournant les cadrans jusqu’à ce que l’arrêt indique 0,01 (voir Figure 1D).
REMARQUE: Le temps de contact est le moment du contact avant la rétraction automatique. - Placez l’actionneur de l’élément de frappe sur un sac de glace pour empêcher la bouteille en plastique de se dilater, ce qui verrouille la bouteille en place, empêchant le mouvement de la bouteille et la livraison d’impacts futurs (voir la figure 1E).
- Préparez la souris pour la chirurgie.
- Inspectez visuellement la souris avant la chirurgie et éliminez-la de l’étude si l’une des conditions suivantes est observée: mauvais état du pelage, léthargie ou mauvais poids (<20 g) pour une souris de 4 mois.
- Anesthésiez la souris avec 4% -5% d’isoflurane dans 100% d’oxygène à l’aide d’une chambre d’induction placée sur un coussin chauffant pendant 1-2 min.
- Rasez la fourrure du site opératoire à l’aide d’une tondeuse à cheveux électrique.
- Nettoyez la tête avec des tampons de préparation à l’alcool stériles et appliquez un anesthésique topique sur le cuir chevelu rasé au moins 15 minutes avant le début de la chirurgie.
- Remettez la souris dans une cage de rétention propre avant la chirurgie. Commencez la chirurgie après au moins 15 minutes d’application d’anesthésique topique (temps d’induction).
REMARQUE: Le temps d’anesthésie peut varier en fonction de l’anesthésique utilisé dans la procédure.
- Vérifiez une fois de plus que le cadre stéréotaxique, l’élément de frappe et l’affichage stéréotaxique numérique (voir Figure 1F) sont prêts à être utilisés.
- Remettre la souris dans la chambre d’induction de l’isoflurane avec 4% -5% d’isoflurane dans 100% d’oxygène pendant environ 3 min.
- Fixez la souris dans la scène principale.
3. Intervention chirurgicale
- Fixez la souris dans le cadre stéréotaxique à l’aide de barres d’oreille coniques légères en résine acétalique, d’une barre de morsure et d’un masque d’anesthésie de souris (voir Figure 1G,H). Le gaz isoflurane est livré à 2 % à 3 % dans l’air ambiant à raison de 100 à 200 mL/min. Surveillez attentivement la respiration de la souris pour assurer la profondeur de l’anesthésie et ajuster le niveau de gaz au besoin.
- Appliquez un lubrifiant stérile pour les yeux sur les yeux pour éviter le dessèchement de la cornée.
- Stérilisez le cuir chevelu avec des tampons de povidone iodée et des tampons d’alcool stériles trois fois.
- Assurez-vous que la souris est profondément anesthésiée en vérifiant l’absence de réponse de pincement des orteils.
- Faites une incision du cuir chevelu médian d’environ 1 cm entre les yeux et le cou à l’aide d’un scalpel, exposant le crâne (voir la figure 1I).
- Laissez le crâne sécher pendant 1-2 min.
- Identifier le bregma (le point d’intersection des sutures coronales et sagittales) et lambda (l’intersection des sutures sagittales et lambdoïdes) (voir Figure 1J).
REMARQUE: Un atlas du cerveau de souris pourrait être utilisé comme référence. - Placez l’appareil de soutien de la tête sous la tête et gonflez le bulbe avec de l’eau jusqu’à ce qu’il appuie contre le bas de la tête de la souris mais ne soulève pas la tête loin de la barre de morsure.
REMARQUE: Cette étape est essentielle pour réduire les problèmes d’oreille possibles du CHI. Tout animal dont l’oreille est endommagée par les barres d’oreille, entraînant un roulement ou un saignement, doit être éliminé de l’étude et euthanasié. - Déplacez l’élément de frappe au-dessus de la tête de l’animal.
- Étendez l’élément de frappe en plaçant l’interrupteur à bascule Étendre/Retirer (sur le boîtier de commande de l’élément de frappe) sur Étendre.
REMARQUE: Assurez-vous de vérifier que la pointe est complètement étendue en tirant vers le bas sur la pointe. - Alignez l’élément de frappe jusqu’à ce qu’il soit centré sur le bregma (voir la figure 1K).
- Réinitialisez les coordonnées numériques stéréotaxiques x et y dans le lecteur stéréotaxique à 0 (sur la commande de l’écran tactile)
- Alignez la sonde sur le lieu d’impact en déplaçant la sonde du bregma vers les coordonnées cibles : médiale-latérale = 0,0 mm, antérieure-postérieure = −1,6 mm.
- Fixez le capteur de contact à l’oreille de l’animal.
- Abaissez lentement la pointe de la sonde avec la sonde étendue jusqu’au premier contact avec la surface. Arrêtez-vous au bip.
- Réinitialisez les coordonnées z stéréotaxiques numériques dans le lecteur stéréotaxique sur 0.
- Inspectez soigneusement si la pointe est au ras du crâne (plans médial-latéral et antéro-postérieur).
REMARQUE: Le positionnement de la pointe de la sonde est l’étape la plus cruciale de ce processus pour prévenir les fractures du crâne et les dommages à l’oreille. - Rétractez l’élément de frappe en plaçant l’interrupteur à bascule sur le boîtier de commande en position de retrait. La pointe se retire et n’a plus de contact avec la tête de l’animal jusqu’au moment de l’impact.
- Réglez la profondeur d’impact en ajustant la profondeur dorso-ventrale à −1,2 mm.
REMARQUE : La profondeur de l’impact influe sur la gravité de la blessure. La profondeur doit être titrée pour différents âges, poids et souches de souris à la gravité de blessure souhaitée. Il peut être nécessaire d’ajuster ou de réajuster la profondeur au fil du temps pour maintenir une gravité constante des blessures. La gravité peut être évaluée neuropathologiquement: microglie et astrocytes (IHC), et comportementale: le labyrinthe aquatique du bras radial et le test d’évitement actif. - Surveillez attentivement la respiration de la souris pour assurer la profondeur de l’anesthésie et ajustez le niveau de gaz au besoin.
REMARQUE : Souvent, le pourcentage de gaz isoflurane doit être abaissé ou coupé pendant 10 à 20 s avant l’impact. Surveillez attentivement que la respiration s’accélère légèrement. Si la respiration est trop lente au moment de l’impact, l’animal peut mourir dans les 60 premières secondes après l’impact de l’apnée. Cela peut être évité en ajustant la profondeur de l’anesthésie dans les secondes précédant l’impact. - Induisez l’impact en appuyant sur l’interrupteur à bascule droit pour l’impact. La pointe de la sonde descend à la vitesse affichée, puis reste vers le bas pendant le temps de séjour défini et se rétracte.
REMARQUE: Les souris simulées reçoivent une manipulation identique à celle des souris CHI, mais l’impact n’est pas livré. - Démarrez la minuterie immédiatement après l’impact CHI pour enregistrer les temps de redressement (temps de retour de la position latérale à la position couchée) ou démarrez la minuterie lorsque la souris est retirée du cadre stéréotaxique pour les souris simulées. Le temps moyen du réflexe de redressement est de 5 à 15 min.
REMARQUE: Les temps de réflexe de redressement peuvent varier en fonction de la souche et de l’âge de la souris. - Évaluez les souris pour les fractures visibles du crâne, les hémorragies et l’apnée. Exclure de l’étude les souris présentant une fracture du crâne déprimée ou une hémorragie visible.
REMARQUE: Il existe des niveaux gradués de fractures du crâne. Les animaux présentant des fractures du crâne décomprimé, où l’os exerce une pression observable dans le tissu cérébral, sont euthanasiés (CO2 d’abord, et décapitation utilisée comme méthode secondaire). Si la pointe de l’élément de frappe est réglée correctement, ces types de fractures du crâne sont extrêmement rares. Si une fracture du crâne se produit, la présentation la plus courante est une petite goutte de sang sur le crâne et une légère rugosité tactile du crâne, souvent le long de la suture reliant l’extrémité postérieure de l’os nasal. Ces souris sont notées comme une fracture possible du crâne dans les dossiers, mais ne sont normalement pas exclues de l’étude. - Retirez l’animal du cadre stéréotaxique.
- Fermez le cuir chevelu en agrafant la peau ensemble.
REMARQUE: Des sutures résorbables ou non résorbables peuvent être utilisées pour fermer le cuir chevelu comme alternative aux agrafes. - Appliquez une pommade antibiotique triple avec un applicateur stérile à embout de coton sur l’incision fermée.
- Remettez la souris dans une cage de rétention propre pour la récupérer. La moitié de la cage de récupération se trouve sur un coussin chauffant (réglage bas), ce qui permet de s’éloigner de la chaleur lorsqu’il est éveillé et de maintenir la température de l’animal lorsqu’il est inconscient (voir la figure 1L).
REMARQUE: La souris est placée sur le côté dans la cage de récupération. Pour éviter la suffocation, placez l’animal dans une cage de récupération sans litière ou sur un mouchoir si la litière est dans la cage. - Remettez l’interrupteur bascule Extend/Retract sur la position Centre/Arrêt .
REMARQUE: Le courant continuera à fonctionner si l’interrupteur est laissé en position d’extension ou de réaction, ce qui provoque le gonflement du piston. L’impacteur ne sera alors pas fonctionnel tant que le piston ne refroidira pas. - Retirez l’élément de frappe de son support et placez-le délicatement sur le sac de glace.
REMARQUE: Garder l’impacteur sur un sac de glace aide à réduire le gonflement potentiel de l’impacteur. - Surveillez l’animal jusqu’à ce que le réflexe de redressement se produise et documentez le temps écoulé jusqu’au redressement (voir la figure 1M).
REMARQUE: Le réflexe de redressement est défini comme le moment où la souris revient à une position couchée. La cage doit être laissée intacte; La souris pourrait avoir raison si la cage est touchée, déplacée ou exposée à des bruits. - Remettez les souris dans leur cage d’origine lorsqu’elles sont éveillées et alertes. Habituellement, dans les 1 heure suivant la blessure, les animaux sont pleinement conscients et se déplacent. Ajoutez également de la nourriture humide au fond de la cage.
4. Soins post-opératoires
- Surveillez les animaux pendant 5 jours après la chirurgie.
- Notez leur poids et tout changement physique / comportemental comme la fréquence respiratoire (fonction respiratoire qualitative), la démarche, l’état du corps et du pelage, manger, boire, défécation et uriner.
- Observez la souris pour tout signe d’inconfort et la plaie chirurgicale pour l’enflure, les exsudats ou les bords rouges, l’ordhiscence. Contactez un vétérinaire si l’animal présente des signes de douleur et d’inconfort (vocalisations, ne bouge pas, hypothermie, ne boit pas et ne mange pas).
- Retirez les agrafes 7 à 10 jours après la chirurgie sous anesthésie et sur un coussin chauffant.
REMARQUE: Si des sutures non résorbables sont utilisées, elles doivent être retirées 7 à 10 jours après la chirurgie sous anesthésie.
5. Nettoyage
- Nettoyez et stérilisez la zone chirurgicale et les outils.
- Nettoyez l’embout de la sonde après chaque utilisation et à la fin de la journée avec des tampons de préparation à l’alcool.
NOTE: L’impacteur est étalonné en usine et est déclaré stable dans le temps et l’utilisation. Aucun étalonnage de routine n’est nécessaire. Cependant, l’élément de frappe et le cadre stéréotaxique doivent être inspectés régulièrement. En outre, les périmètres des paramètres du modèle, tels que le temps de réflexe de redressement, la mortalité et la neuropathologie, doivent être surveillés pour évaluer la dérive expérimentale possible.
6. Critères d’exclusion
- Exclure les animaux avant la chirurgie avec un mauvais état de santé, comme un faible poids <20 g pour une souris de 4 mois, la léthargie et un mauvais état du pelage.
- Exclure les animaux présentant des complications pendant la chirurgie, comme une fracture du crâne déprimée, une hémorragie visible liée à la chirurgie ou un saignement d’oreille.
- Exclure les animaux de l’étude présentant les symptômes postopératoires suivants : incapacité à manger et/ou à bouger normalement, vocalisations inhabituelles, perte de poids ou incapacité de la plaie à guérir normalement après la chirurgie.
REMARQUE : Ce modèle pourrait être utilisé comme modèle répétitif de TCC léger. Si les souris reçoivent la deuxième chirurgie à 24 heures d’intervalle de la première, les agrafes ou la suture pourraient être retirées et la même incision pourrait être utilisée pour exposer le crâne. Une nouvelle incision doit être faite si un délai plus long s’écoule entre les chirurgies.
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Representative Results
Cet appareil d’impact électromagnétique stéréotaxique est polyvalent. Il est utilisé à la fois pour un impact cortical contrôlé par le crâne ouvert (CCI) ou une chirurgie de traumatisme crânien fermé (CHI). De plus, la gravité de la blessure peut être modulée en modifiant les paramètres de la blessure tels que la vitesse d’impact, le temps de séjour, la profondeur de l’impact, la pointe de l’impacteur et la cible de blessure. On décrit ici une chirurgie CHI utilisant un impacteur à pointe en acier de 5,0 mm. Cette blessure est considérée comme bénigne car il n’y a pas de lésions cérébrales structurelles. Le taux de mortalité chez les souris adultes est inférieur à 0,9%11,14 et augmente légèrement pour atteindre ~2,5% chez les souris plus âgées (>8 mois)11. La mortalité survient pendant les 2 premières minutes en raison de l’apnée, qui peut être largement évitée en surveillant attentivement la profondeur de l’anesthésie dans les secondes précédant l’impact.
L’avantage de ce modèle CHI est que l’impact produit une pathologie diffuse bilatérale sans avoir besoin d’exposer la surface durale corticale (craniotomie). Une autre caractéristique qui en fait un modèle de TCC efficace est que moins de 1% des souris sont exclues de l’étude en raison de fractures du crâne ou de problèmes d’oreille après l’intervention chirurgicale. Il est important de noter que le modèle produit des troubles neuropathologiques et comportementaux avec un seul impact, ce qui réduit la complexité expérimentale associée aux modèles répétitifs de CHI légers15. Par exemple, un modèle temporel reproductible de microglies et de changements morphologiques astrocytaires est identifié11 (Figure 2A,B). Lors de la validation du modèle, il est recommandé d’utiliser les plages de départ des coordonnées antéro-postérieures de −1,5 mm ± 0,2 mm et la profondeur d’impact de 1,0 ± 0,2 mm. Les coordonnées peuvent devoir être ajustées en fonction de l’âge et de la souche des souris, ainsi que de la marque et du modèle de l’équipement utilisé. Une fois les paramètres validés, ils doivent être maintenus constants pour une expérience. Pour la validation, la caractérisation neuropathologique de la microglie et des astrocytes 3 jours après la lésion est recommandée. La coloration immunohistochimique (IHC) a été réalisée selon les méthodes de Bachstetter et coll.18. Plus précisément, des sections coronales flottantes de 30 μm ont été colorées pour l’activation gliale avec un anti-GFAP de lapin (1:10 000) et pour les astrocytes à l’aide d’un anti-IBA1 de lapin (1:10 000). Une IgG anti-lapin conjuguée HRP (1:200) a été utilisée pour détecter à la fois GFAP et IBA-1. Un logiciel de quantification a été utilisé pour quantifier la coloration dans chaque région considérée. De plus, 1 jour après la blessure, des marqueurs de lésion axonale ont été trouvés dans le néocortex, et des changements dans le métabolisme mitochondrial ont été trouvés 28 jours après CHI16 (données non présentées).
Les critères d’évaluation secondaires pour valider le modèle seraient les tests comportementaux. Des déficits reproductibles induits par le CHI dans le labyrinthe d’eau du bras radial (RAWM)12 et des comportements d’évitement actif13 ont été constatés (Figure 3). Les souris ont été testées dans un RAWM à 8 bras, un test d’apprentissage spécial, comme décrit dans Macheda et al.12. Brièvement, les souris ont été testées dans un total de 28 essais sur un protocole de 4 jours et ont eu 60 s pour localiser la plate-forme positionnée dans le bras cible. Le nombre total d’essais par jour était de sept ; Les jours 1 et 2 ont été considérés comme des jours de formation et les jours 3 et 4 comme des jours de test. Pendant les journées d’entraînement, les souris ont été entraînées à localiser la plate-forme, alternant entre des essais visibles et cachés; Pendant les jours de test, la plate-forme a été cachée pendant tous les essais. Les expériences ont été enregistrées à l’aide d’une caméra et un système de suivi a été utilisé pour l’analyse du comportement (nombre d’erreurs, distance totale et latence). Les souris ont été testées 2 semaines après la blessure. Bien qu’il n’y ait eu aucun effet sexuel, les souris CHI ont commis plus d’erreurs pour effectuer la tâche avec succès et atteindre la plate-forme (Figure 3A). En outre, des troubles de la mémoire ont également été détectés dans un test RAWM à 6 bras11,14,15,16. L’évitement actif, un test associatif basé sur l’apprentissage, a été utilisé pour mesurer les déficits cognitifs associés à ce modèle léger de CHI. Les souris ont été testées selon un protocole de 5 jours et exposées à 50 essais/jour13. Les souris ont été entraînées à éviter un léger choc au pied (stimulus inconditionné, US) en y associant un stimulus conditionné (CS, lumière). Au fil du temps, les souris ont appris à éviter les États-Unis lorsque le CS a été présenté. Les souris CHI avaient une fonction cognitive altérée dans l’évitement actif par rapport aux souris simulées (Figure 3B). Les souris femelles simulées ont appris significativement plus rapidement que les mâles, mais le sexe n’a pas joué de rôle chez les souris CHI13. Le comportement a été enregistré à l’aide d’un logiciel d’évitement actif/passif. Un déficit reproductible de la fonction motrice au-delà de la première semaine après la blessure n’a pas été détecté11.
Dans ce modèle de TCC léger, aucune lésion structurelle macroscopique au cerveau n’a été trouvée, et un seul impact a induit une activation gliale bilatérale et des changements dans la morphologie de la microglie. De plus, les déficits cognitifs sont associés à ce modèle de TCC.
Figure 1 : Étape 1 : Configuration de la zone chirurgicale. (A) Un exemple de la zone chirurgicale et des outils nécessaires pour effectuer la chirurgie CHI (sac de glace pour l’élément de frappe, cadre stéréotaxique équipé de l’élément de frappe, boîtier de commande de l’impacteur et outils chirurgicaux) est présenté. (B) Vue rapprochée de l’extrémité de la sonde en acier, de la barre de morsure et de l’appareil de support de tête en acier de 5 mm, qui illustre le positionnement nécessaire pour l’impact médian. (C) L’appareil de support de tête est fabriqué à partir d’une ampoule de pipette en latex de 1 mL fixée au tube par un parafilm. Une seringue de 10 ml est remplie d’eau pour gonfler l’ampoule, avec un robinet d’arrêt pour maintenir l’ampoule gonflée une fois en position. (D) Boîtier de commande de l’élément de frappe: (1) un grand bouton pour régler la vitesse d’impact, (2) un compteur d’arrêt, (3) un interrupteur à bascule de longueur/rétractation, (4) un interrupteur à bascule qui, lorsqu’il est poussé vers le bas, délivre l’impact. (E) Lorsqu’il n’est pas utilisé, l’élément de frappe est maintenu sur une banquise pour éviter la surchauffe et les éventuels dysfonctionnements. (F) Un affichage stéréotaxique numérique est utilisé pour établir les coordonnées x (antéro-postérieure), y (médiale-latérale) et z (dorso-ventrale). Étape 2: Intervention chirurgicale. (G,H) La souris anesthésiée et rasée est fixée dans le cadre stéréotaxique, (I) une incision médiane est faite pour exposer le (J) bregma, (K) qui est utilisé pendant la chirurgie pour aligner l’impacteur. Étape 3: Récupération. (L) La souris est retirée du cadre stéréotaxique. Une fois que le cuir chevelu est fermé par agrafage ou suture de la peau ensemble, il est placé dans une cage de récupération propre sur le côté. (M) La souris est surveillée jusqu’à ce qu’elle se retourne et que le réflexe de redressement se produise. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Les schémas temporels des changements morphologiques des astrocytes (GFAP) et des microglies (IBA1) après un CHI. (A) La coloration GFAP à faible grossissement montre l’augmentation régionale de la coloration observée dans le cortex du groupe CHI. L’aspect morphologique des astrocytes est montré dans les encarts de grossissement supérieur, qui ont été prélevés dans les sections du cerveau moyen et dans les mêmes régions du cortex. (B) La coloration IBA1-positive dans le cortex 1 jour, 7 jours et 2 mois après la blessure montre des changements dans la morphologie de la microglie dans le néocortex après le CHI (n = 7-14, 50/50 mâle/femelle). Les souris (fond CD-1/129) étaient âgées de 8 mois au moment de la chirurgie. Cette figure a été adaptée de 11 et reproduite avec permission. Barre d’échelle = 1 mm, 50 μm et 100 μm comme indiqué sur la figure. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Déficits de mémoire induits par le CHI dans le RAWM et évitement actif. (A) 2 semaines après la blessure, les souris CHI et simulées ont pu apprendre la tâche RAWM, mais les souris CHI ont fait plus d’erreurs que les souris simulées (*** p < 0,0005); simulacre (n = 20/20 homme/femme); CHI (n = 20/20 hommes/femmes). Les souris (C57BL/6J) étaient âgées de 3 à 4 mois au moment de la chirurgie. (B) 4 semaines après la blessure, les souris CHI et les souris opérées par simulacre ont pu apprendre la tâche d’évitement actif, mais les souris CHI ont évité moins de chocs au pied que les souris simulées (*** p = 0,0005; **** p < 0,0001); simulacre (n = 10/10 homme/femme); CHI (n = 9/10 mâle/femelle). Les souris (C57BL/6J) étaient âgées de 3 à 5 mois au moment de la chirurgie. Les données sont présentées sous forme de MEB ± moyenne. (A) Cette figure a été adaptée de 12 et reproduite avec permission. (B) Cette figure a été adaptée de 13 et reproduite avec permission. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Plusieurs étapes sont nécessaires pour recréer un modèle de blessure cohérent à l’aide du modèle décrit. Tout d’abord, il est essentiel de fixer correctement l’animal dans le cadre stéréotaxique. La tête de l’animal ne doit pas pouvoir bouger latéralement et le crâne doit être complètement plat avec bregma et lambda lisant les mêmes coordonnées. Placer correctement les barres auriculaires est l’aspect le plus difficile de cette chirurgie, et cela ne peut être appris qu’avec de la pratique. Si le crâne n’est pas de niveau, la tête doit être ajustée avant d’induire CHI. Ne pas ajuster le positionnement de la tête entraînera une fracture du crâne. Pour évaluer que le crâne est plat, il faut regarder l’écart entre le crâne et la pointe de l’impact sous tous les angles autour de la pointe. Les souris présentant des fractures du crâne déprimées devraient être exclues des expériences, car elles ont une réponse inflammatoire beaucoup plus forte et une blessure plus grave que les souris qui n’ont pas subi de fractures du crâne19. De plus, les souris souffrant de fractures du crâne présentent des résultats plus graves en matière de TCC, tels qu’une dépression respiratoire post-traumatique, une blessure secondaire au rebond et éventuellement la mort20.
Dans cette étude, la tête de l’animal était sécurisée avec des barres d’oreille. En particulier, il est recommandé d’utiliser uniquement des barres auriculaires en résine acétal spécifiques à la souris avec une pointe effilée, et non de grandes barres d’oreille de rat. Il est possible d’utiliser des barres d’oreille à pointe en caoutchouc non perforantes, mais ces barres d’oreille comprimeront le crâne, altérant la biomécanique du CHI, et sont moins reproductibles. En outre, il existe une limitation à l’utilisation de barres d’oreille, car elles ne permettent aucune force de rotation. Néanmoins, la plus grande reproductibilité des barres auriculaires l’emporte sur le nombre limité de forces de rotation qui peuvent être générées si la tête n’est pas fixée.
Cependant, la fixation de la tête avec des barres d’oreille peut également causer des blessures à l’oreille à l’impact si les forces d’impact sont toutes placées au niveau des oreilles. Un dispositif de support de tête placé sous la tête pour déplacer les forces loin des oreilles a été développé. Après avoir testé plusieurs objets ressemblant à des oreillers, celui qui fonctionnait le mieux était l’ampoule de pipette en latex de 1 ml remplie d’eau. L’ampoule de pipette sous la tête de l’animal peut être élargie une fois que l’animal est dans le cadre stéréotaxique, ce qui lui permet d’avoir un ajustement serré et de fournir un soutien complet sous la tête. Lorsqu’il est placé correctement, il ne devrait pas y avoir de saignement des oreilles ou d’indications comportementales de dommages à l’oreille (roulement / inclinaison de la tête) après la blessure.
Certaines versions du modèle CHI utilisent une sonde à pointe en caoutchouc 21,22 ou un casque métallique 23,24 pour réduire l’apparition de fractures du crâne. Tant que la pointe de l’impacteur de 5 mm est au ras du crâne, il n’est pas nécessaire d’utiliser l’un d’entre eux. Il peut être tentant pour les nouveaux utilisateurs qui n’ont pas une grande expérience de la chirurgie stéréotaxique d’induire la blessure avec la pointe qui ne rentre pas avec le crâne dans le plan médial-latéral. Si le crâne n’est pas de niveau dans le plan médial-latéral, c’est parce que les barres d’oreille ne sont pas placées correctement. La seule solution à ce problème consiste à retirer l’animal de l’impacteur et à affecter la souris à une blessure simulée. Si la pointe n’est pas affleurante sur le plan antéro-postérieur, la hauteur de la barre de morsure doit être ajustée et la pointe réalignée avec le bregma. De plus, l’utilisation d’un impacteur de 5 mm avec une pointe plate réduit les risques de fractures du crâne19 par rapport aux extrémités d’impacteur de plus petits diamètres. D’autres facteurs importants à considérer sont l’âge et le poids du sujet, ainsi que l’épaisseur du crâne25 et les souches des souris26.
Chez les personnes, un traumatisme crânien léger n’est pas associé à la mort dans les premières minutes suivant la blessure. Chez les animaux, même une blessure légère peut entraîner la mort. Cependant, dans ce modèle, la mortalité est presque toujours associée à des complications chirurgicales, et non à la blessure seule. La raison la plus courante pour laquelle une souris mourrait après l’impact est la profondeur de l’anesthésie. Cela pourrait se produire si la chirurgie a pris plus de temps que prévu ou si le gaz isoflurane était à une concentration plus élevée que nécessaire pour cet animal. Si la respiration de l’animal est lente ou laborieuse, cela pourrait être un signe que la profondeur de l’anesthésie devrait être réduite avant l’impact. Si la respiration de l’animal est lente ou laborieuse au moment de l’impact, l’animal souffrira probablement d’apnée et pourrait mourir.
Il existe de nombreux modèles de TCC léger. Chacun a des forces et des faiblesses, et ce modèle n’est pas différent. Comme indiqué, voici décrit un modèle à succès unique de TBI, mais le modèle a été utilisé pour provoquer un TBIrépétitif 15. Les étapes décrites dans ce protocole peuvent être répétées pour induire une blessure répétitive du TCC. Lors de l’évaluation des différents modèles de TCC, il est important de déterminer si le modèle présente la pathologie souhaitée que l’on tente de modéliser. Il faut également tenir compte de la reproductibilité du modèle. Il est fortement recommandé que le point de départ de l’utilisation de ce modèle ou de tout autre modèle de TCC soit de valider et de caractériser de manière indépendante que le modèle fonctionne comme indiqué précédemment.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu en partie par les National Institutes of Health sous les numéros d’attribution R01NS120882, RF1NS119165 et R01NS103785 et le numéro de récompense AZ190017 du ministère de la Défense. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas les opinions officielles des National Institutes of Health ou du ministère de la Défense.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 9 mm Autoclip Applier | Braintree scientific | ACS- APL | Surgery |
| 9 mm Autoclip Remover | Braintree scientific | ACS- RMV | Surgery |
| 9 mm Autoclip, Case of 1,000 clips | Braintree scientific | ACS- CS | Surgery (Staples) |
| Aperio ImageScope software | Leica BioSystems | NA | IHC |
| BladeFLASK Blade Remover | Fisher Scientific | 22-444-275 | Surgery |
| Cotton tip applicator | VWR | 89031-270 | Surgery |
| Digitial mouse stereotaxic frame | Stoelting | 51730D | Surgery |
| Dumont #7 Forceps | Roboz | RS-5047 | Surgery |
| Ear bars | Stoelting | 51649 | Surgery |
| EthoVision XT 11.0 | Noldus Information Technology | NA | RAWM |
| Fiber-Lite | Dolan-Jeffer Industries | UN16103-DG | Surgery |
| Fisherbrand Bulb for Small Pipets | Fisher Scientific | 03-448-21 | Head support apparatus |
| Gemini Avoidance System | San Diego Instruments | NA | Active avoidance |
| Heating Pad | Sunbeam | 732500000U | Surgery prep |
| HRP conjugated goat anti-rabbit IgG | Jackson Immuno Research laboratories | 111-065-144 | IHC |
| Induction chamber | Kent Scientific | VetFlo-0530XS | Surgery prep |
| Isoflurane, USP | Covetrus | NDC: 11695-6777-2 | Surgery |
| Mouse gas anesthesia head holder | Stoelting | 51609M | Surgery |
| Neuropactor Stereotaxic Impactor | Neuroscience Tools | n/a | Surgery: Formally distributed by Lecia as impact one |
| NexGen Mouse 500 | Allentown | n/a | Post-surgery, holding cage |
| Parafilm | Bemis | PM992 | Head support apparatus |
| Peanut - Professional Hair Clipper | Whal | 8655-200 | Surgery prep |
| Povidone-Iodine Solution USP, 10% (w/v), 1% (w/v) available Iodine, for laboratory | Ricca | 3955-16 | Surgery |
| Puralube Vet Oinment,petrolatum ophthalmic ointment, Sterile ocular lubricant | Dechra | 17033-211-38 | Surgery |
| Rabbit anti-GFAP | Dako | Z0334 | IHC |
| Rabbit anti-IBA1 | Wako | 019-19741 | IHC |
| 8-arm Radial Arm Water Maze | MazeEngineers | n/a | RAWM |
| Scale | OHAUS CS series | BAL-101 | Surgery prep |
| Scalpel Handle #7 Solid 6.25" | Roboz | RS-9847 | Surgery |
| Sterile Alcohol Prep Pads (isopropyl alcohol 70% v/v) | Fisher Brand | 22-363-750 | Surgery prep |
| SumnoSuite low-flow anesthesia system | Kent Scientific | SS-01 | Surgery |
| 10 mL syringe Luer-Lok Tip | BD Bard-Parker | 302995 | Head support apparatus |
| Timers | Fisher Scientific | 6KED8 | Surgery |
| Topical anesthetic cream | L.M.X 4 | NDC 0496-0882-15 | Surgery prep |
| Triple antibiotic ointment | Major | NDC 0904-0734-31 | Post-surgery |
| Tubing | MasterFlex | 96410-16 | Head support apparatus |
| Vaporizer Single Channel Anesthesia System | Kent Scientific | VetFlo-1210S | Surgery prep |
References
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