Artículo de método

Expresión de transgenes en urotelio de vejiga nativa mediante transducción mediada por adenovirus

DOI:

10.3791/64584

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6 de octubre de 2022

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1Renal-Electrolyte Division, Department of Medicine, University of Pittsburgh School of Medicine

En este artículo

Resumen

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Se describen métodos para la generación de grandes cantidades de adenovirus recombinantes, que luego se pueden utilizar para transducir el urotelio nativo de roedores permitiendo la expresión de transgenes o la regulación a la baja de productos génicos endógenos.

Resumen

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Además de formar una barrera de alta resistencia, se plantea la hipótesis de que el urotelio que recubre la pelvis renal, los uréteres, la vejiga y la uretra proximal detecta y transmite información sobre su entorno a los tejidos subyacentes, promoviendo la función miccional y el comportamiento. La interrupción de la barrera urotelial, o su función sensorial/transductora, puede conducir a la enfermedad. El estudio de estos eventos complejos se ve obstaculizado por la falta de estrategias simples para alterar la expresión génica y proteica en el urotelio. Aquí se describen métodos que permiten a los investigadores generar grandes cantidades de adenovirus de alto título, que luego se pueden usar para transducir urotelio de roedores con alta eficiencia y de una manera relativamente sencilla. Tanto los ADNc como los ARN interferentes pequeños pueden expresarse mediante transducción adenoviral, y el impacto de la expresión transgénica en la función urotelial se puede evaluar de 12 h a varios días después. Estos métodos tienen una amplia aplicabilidad a estudios de biología urotelial normal y anormal utilizando modelos animales de ratón o rata.

Introducción

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El urotelio es el epitelio especializado que recubre la pelvis renal, los uréteres, la vejiga y la uretra proximal1. Comprende tres estratos: una capa de células paraguas a menudo binucleadas altamente diferenciadas y polarizadas, cuyas superficies apicales están bañadas en orina; una capa celular intermedia con una población de células binucleadas amplificadoras del tránsito que pueden dar lugar a células paraguas superficiales en respuesta a su pérdida aguda; y una sola capa de células basales, un subconjunto de las cuales funcionan como células madre que pueden regenerar la totalidad del urotelio en respuesta a una lesión crónica. Las células paraguas son las principales responsables de formar la barrera urotelial de alta resistencia, cuyos componentes incluyen una membrana apical (rica en colesterol y cerebrósidos) con baja permeabilidad al agua y los solutos, y un complejo de unión apical de alta resistencia (compuesto por uniones estrechas, uniones adherentes, desmosomas y un anillo de actomiosina asociado)1 . Tanto la superficie apical de la célula paraguas como su anillo de unión se expanden durante el llenado de la vejiga y vuelven a su estado precargado rápidamente después de vaciar 1,2,3,4,5. Además de su papel en la función de barrera, también se presume que el urotelio tiene funciones sensoriales y transductoras que le permiten detectar cambios en el medio extracelular (por ejemplo, estiramiento) y transmitir esta información a través de la liberación de mediadores (incluyendo ATP, adenosina y acetilcolina) a los tejidos subyacentes, incluidos los procesos nerviosos aferentes suburoteliales 6,7,8 . La evidencia reciente de este papel se encuentra en ratones que carecen de expresión urotelial tanto de Piezo1 como de Piezo2, lo que resulta en una función miccional alterada9. Además, las ratas que sobreexpresan la proteína formadora de poros de unión estrecha CLDN2 en la capa de células paraguas desarrollan inflamación y dolor análogos a los observados en pacientes con cistitis intersticial10. Se plantea la hipótesis de que la interrupción de la función sensorial/transductor urotelial o de barrera puede contribuir a varios trastornos de la vejiga 6,11.

Una mejor comprensión de la biología del urotelio en estados normales y de enfermedad depende de la disponibilidad de herramientas que permitan a los investigadores regular fácilmente a la baja la expresión génica endógena o permitir la expresión de transgenes en el tejido nativo. Si bien un enfoque para regular a la baja la expresión génica es generar ratones knockout uroteliales condicionales, este enfoque depende de la disponibilidad de ratones con alelos floxados, requiere mucho trabajo y puede tardar meses o años en completar12. No es sorprendente entonces, que los investigadores hayan desarrollado técnicas para transfectar o transducir el urotelio, lo que puede conducir a resultados en una escala de tiempo más corta. Los métodos publicados para la transfección incluyen el uso de lípidos catiónicos13, oligodesoxinucleótidos fosforotioados antisentido 14 o ácidos nucleicos antisentido atados a la proteína TAT del VIH que penetra en el péptido 11-mer15. Sin embargo, el enfoque de este protocolo está en el uso de la transducción mediada por adenovirus, una metodología bien estudiada que es eficiente en la entrega de genes a una amplia gama de células, se ha probado en numerosos ensayos clínicos y, más recientemente, se utilizó para administrar el ADNc que codifica la proteína de la cápside COVID-19 a los receptores de una variante de la vacuna COVID-1916, 17. Para una descripción más completa del ciclo de vida de los adenovirus, los vectores adenovirales y las aplicaciones clínicas de los adenovirus, se dirige al lector a la referencia17.

Un hito importante en el uso de adenovirus para transducir el urotelio fue un informe de Ramesh et al. que mostró pretratamientos cortos con detergentes, incluyendo N-dodecil-β-D-maltósido (DDM) dramáticamente mejorado transducción del urotelio por un adenovirus que codifica β-galactosidasa18. Utilizando este estudio de prueba de principio como guía, la transducción mediada por adenovirus del urotelio ahora se ha utilizado para expresar una variedad de proteínas, incluidas las GTPasas de la familia Rab, los factores de intercambio guanina-nucleótido, los fragmentos motores de miosina, las claudinas asociadas a la unión estrecha formadoras de poros y ADAM17 10,19,20,21,22 . El mismo enfoque se adaptó para expresar pequeños ARN interferentes (ARNsi), cuyos efectos fueron rescatados mediante la coexpresión de variantes resistentes al ARNip del transgen22. El protocolo aquí descrito incluye métodos generales para generar grandes cantidades de adenovirus altamente concentrados, requisito para estas técnicas, así como adaptaciones de los métodos de Ramesh et al.18 para expresar transgenes en el urotelio con alta eficiencia.

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Protocolo

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Los experimentos que involucran la generación de adenovirus, que requiere certificación BSL2, se realizaron bajo la aprobación de las oficinas de Salud y Seguridad Ambiental de la Universidad de Pittsburgh y el Comité Institucional de Bioseguridad. Todos los experimentos con animales realizados, incluida la transducción adenoviral (que requiere la certificación ABSL2), se realizaron de acuerdo con las pautas / regulaciones relevantes de la Política del Servicio de Salud Pública sobre Cuidado Humanitario y Uso de Animales de Laboratorio y la Ley de Bienestar Animal, y bajo la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Pittsburgh. Se usan guantes, protección para los ojos y ropa adecuada para todos los procedimientos que involucran virus recombinantes. Cualquier residuo líquido o sólido debe eliminarse como se describe a continuación. La cama de los animales después de la transducción, y cualquier cadáver de animal resultante, deben tratarse como materiales biopeligrosos y eliminarse de acuerdo con las políticas institucionales.

1. Preparación de las existencias de adenovirus de alto título

NOTA: La transducción efectiva de vejigas de roedores depende del uso de cepas virales purificadas y concentradas, típicamente 1 x 107 a 1 x 108 partículas virales infecciosas (PIV) por μL. Esta parte del protocolo se centra en generar existencias de adenovirus de alto título a partir de preparaciones de virus existentes. Todos los pasos deben realizarse en una campana de cultivo celular utilizando reactivos y herramientas estériles. Si bien las cepas disponibles de adenovirus utilizadas hoy en día son defectuosas de replicación, la mayoría de las instituciones requieren aprobación para usar adenovirus y ADN recombinante. Esto a menudo incluye la designación de una sala de cultivo celular como una instalación aprobada por BSL2 para producir y amplificar adenovirus. Algunas consideraciones generales incluyen el uso de máscaras, protección para los ojos, guantes y vestimenta adecuada en todas las etapas de la producción y purificación del virus. Al realizar la centrifugación, se recomiendan tapas de seguridad si los tubos de centrífuga carecen de tapas ajustadas. Todos los materiales no desechables, incluidas las tapas de seguridad de centrífugas potencialmente contaminadas, las botellas y los rotores, se tratan con una solución antiviral (consulte la Tabla de materiales) y luego se enjuagan con agua o etanol al 70%. Los desechos líquidos se tratan agregando lejía a una concentración final del 10% (v / v). La eliminación de estos desechos líquidos dependerá de las políticas institucionales. Los desechos sólidos generalmente se eliminan en desechos biopeligrosos.

  1. Cultivo de células HEK293T
    1. Descongele un vial congelado de células HEK293T en un baño maría a 37 °C y utilice una pipeta de 5 ml para transferir las células a una placa de cultivo celular de 15 cm de diámetro. Con una pipeta de 25 ml, agregue lentamente 20 ml de medio de águila modificado (DMEM) de Dulbecco que contenga suero fetal bovino al 10% (v / v) y antibiótico de penicilina/estreptomicina (DMEM-FBS-PS) al plato. Incubar las células en una incubadora de cultivo celular a 37 °C gaseada con 5% (v/v) de CO2 hasta que alcancen una confluencia del 80%-90% (~2 x 107 células).
    2. Usando una pipeta de vidrio conectada a una fuente de vacío, aspire el medio y luego enjuague las células transfiriendo 20 ml de PBS estéril (2.7 mM KCl, 1.5 mM KH 2 PO 4, 136.9 mM NaCl y 8.9 mM Na2HPO4) al plato usando una pipeta de 25 ml. Aspirar el PBS gastado y luego usar una pipeta de 5 ml para transferir 3 ml de solución de proteinasa tibia (37 °C) (ver Tabla de materiales) al plato, incubando el plato en la incubadora de cultivo celular hasta que las células se desprendan (~ 3-4 min).
      NOTA: La proteólisis efectiva se puede evaluar mejor inclinando lentamente el plato hacia adelante y hacia atrás buscando la liberación de células de todas las porciones del plato en el líquido en movimiento. Las células HEK293T son sensibles al tratamiento prolongado con proteinasa y morirán si se dejan más de unos pocos minutos en solución de proteinasa.
    3. Use una pipeta de 10 ml para transferir 7 ml de DMEM-FBS-PS a la placa de células desprendidas, y luego use la misma pipeta para aspirar las células y el medio. Transfiera las células suspendidas a un tubo cónico de 50 ml y luego granule las células centrifugando la suspensión en una centrífuga clínica de baja velocidad a 200 x g durante 5 min. Aspirar el sobrenadante con una pipeta de vidrio conectada a una fuente de vacío. Utilice una pipeta de 25 ml para resuspender el pellet celular en 15 ml de DMEM-FBS-PS.
    4. Añadir 1 ml de la suspensión celular a cada uno de los quince platos de 15 cm que contienen 19 ml de DMEM-FBS-PS.
    5. Cultivar las células en una incubadora de cultivo de tejidos hasta que alcancen el 85%-90% de confluencia (~3-4 días).
  2. Preparar una solución de virus diluida
    1. Agregue ~ 1.5 x 109 a 3 x 109 IVP de un stock de virus existente (5-10 IVP / célula) a un tubo cónico de 50 ml lleno de 45 ml de DMEM que carece de FBS o antibióticos.
      NOTA: Es posible utilizar una concentración más baja del virus (1-5 PIV/célula); Sin embargo, tomará más tiempo para que la producción del virus se produzca.
  3. Infectar las células cultivadas con el virus.
    1. Utilizando una pipeta de vidrio conectada a una fuente de vacío, aspirar el medio a partir de las células casi confluentes en el paso 1.1.5.
    2. Utilice una pipeta de 25 ml para transferir 3,0 ml de solución de virus diluida (preparada en el paso 1.2.1) a cada placa de cultivo celular. Luego, use una pipeta de 10 ml para agregar 7.0 ml de medio DMEM (que carece de FBS o antibióticos) a cada plato. Incubar durante 60 minutos en una incubadora de cultivo celular, y luego añadir 10 ml de DMEM que contiene 20% (v/v) FBS y 2x PS a cada plato.
      NOTA: El uso de uno de los 15 platos como placa de control (en el que no se agrega el virus) facilita la identificación del redondeo celular inducido por el virus y la muerte en las células infectadas en el siguiente paso.
    3. Incubar las células en la incubadora de cultivo celular durante 2-4 días hasta que la mayoría de ellas comiencen a redondearse y el >60% de las células se hayan desprendido.
      NOTA: Si se usa un título más bajo del virus, puede tomar hasta una semana para que ocurra la muerte celular. Si la muerte celular no ocurre dentro de una semana, es probable que el proceso deba repetirse usando un título más alto del virus.
  4. Recuperar virus de lisados celulares
    1. Use un raspador de células para raspar el fondo de cada plato, liberando células adheridas en el medio.
    2. Usando una pipeta de 25 ml, recolecte y agrupe el medio, las células y los restos celulares de cada placa de cultivo celular en un tubo de cultivo celular cónico de 50 ml.
      NOTA: Para ahorrar recursos, el medio de dos platos se puede combinar en un tubo de 50 ml.
    3. Granular el material celular por centrifugación utilizando una centrífuga de mesa de baja velocidad: 5 min a temperatura ambiente a 3.000 x g. Utilice una pipeta de vidrio conectada a un dispositivo de vacío para aspirar el sobrenadante.
    4. Utilice una pipeta de 10 ml, combinada con trituración, para consolidar todo el material granulado resultante en un total de 7 ml de Tris-HCl de 100 mM de pH 7,4 de 100 mM filtrado estéril que contiene 10 mM de EDTA (solución de Tris-EDTA). Transfiera el material agrupado a un tubo cónico estéril de cultivo celular de 15 ml y colóquelo en hielo.
      NOTA: En este punto, la preparación del virus se puede congelar a -80 °C indefinidamente.
  5. Preparar lisados celulares
    1. Realice tres ciclos de congelación-descongelación para interrumpir las células restantes y, por lo tanto, liberar aún más las partículas de virus formadas. Congelar el material agrupado en el paso 1.4.4 sumergiendo el tubo en nitrógeno líquido (~30-60 s). Descongelar rápidamente la muestra colocando el tubo en una incubadora a 37 °C. Vortex la muestra durante 15 s, y luego repita el procedimiento de congelación y descongelación rápida 2 veces más.
      NOTA: La solución de virus se puede descongelar rápidamente en un baño de agua a 37 ° C, pero se debe tener precaución ya que los cambios de temperatura pueden hacer que el tubo se agriete, liberando la solución de virus en el baño de agua. Para evitar que esto ocurra, coloque el tubo que contiene el sobrenadante viral en un tubo más grande, que luego se coloca en el baño de agua.
    2. Use una pipeta de 10 ml para transferir el material celular tres veces congelado y descongelado a un tubo centrífugo de supervelocidad. Centrifugar el material en el tubo durante 30 min a 4 °C centrífuga de súper velocidad a ~18,500 x g.
    3. Recuperar los ~7 ml de sobrenadante rico en virus con una pipeta de 10 ml y transferirlo a un tubo cónico de 15 ml. Retenga la muestra en hielo hasta el siguiente paso.
      NOTA: En este punto, considere mantener una alícuota del sobrenadante viral no purificado como preámbulo para comenzar una nueva preparación de virus (o como respaldo). Conservar esta alícuota a -80 °C.
  6. Aislar y purificar el virus mediante centrifugación por gradiente de densidad.
    1. Prepare un gradiente discontinuo de CsCl en un tubo de ultracentrífuga transparente de pared delgada de PET de 12 ml (consulte la Tabla de materiales) o equivalente. Use una jeringa de 3 ml equipada con una aguja de 18 g para introducir cuidadosamente 2,5 ml de solución de CsCl de 1,4 g/ml en el fondo del tubo, y luego use una jeringa/aguja nueva para colocarla en capas con 2,5 ml de solución de CsCl de 1,25 g/ml.
      NOTA: Dejar caer soluciones directamente sobre una capa preexistente causará una mezcla significativa y no deseada. En su lugar, coloque la porción biselada de la aguja contra el borde del tubo, y luego presione muy lentamente el émbolo de la jeringa, elevando la posición de la aguja a medida que la solución llena el tubo.
    2. Cargue los ~7 ml de sobrenadante viral en la parte superior del gradiente de manera similar usando una jeringa de 10 ml. Si hay más de 2-3 mm de espacio entre el sobrenadante viral y la parte superior del tubo, agregue una solución adicional de Tris-EDTA para llenar el tubo hasta que solo queden 2-3 mm de espacio.
    3. Haga un tubo de equilibrio preparado de manera similar, que contenga capas de CsCl, pero sustituya la solución de Tris-EDTA por el sobrenadante viral.
      NOTA: Los dos tubos deben tener pesos idénticos (y densidades similares) para evitar una situación de carga desequilibrada potencialmente peligrosa en la ultracentrífuga.
  7. Aislar el virus mediante ultracentrifugación zonal de velocidad.
    1. Cargue los gradientes formados en los pasos 1.6.2-1.6.3 en los cucharones de un rotor SW41 o equivalente. Atornille las tapas del cucharón, coloque el rotor en una ultracentrífuga (preenfriada a 4 °C) y centrifugar durante 1 h a ~150,000 x g.
    2. Durante la centrifugación, equilibrar la columna descrita en el paso 1.9.1.
  8. Recuperar partículas de virus aisladas
    1. Al final de la etapa de centrifugación, separe cuidadosamente los cucharones del rotor y, en una campana de cultivo celular, retire las tapas del cucharón y luego retire los tubos y colóquelos en una rejilla.
    2. Recoja el material con bandas, rico en partículas de virus, que flota en la interfaz entre la solución de CsCl de 1,25 g/ml y 1,4 g/ml. Sosteniendo el tubo que contiene el gradiente sobre la mitad inferior de una placa de cultivo celular (que atrapará cualquier material derramado), use una aguja de 1 pulgada y 18 G conectada a una jeringa de 3 ml para perforar cuidadosamente el tubo, justo debajo del virus con bandas. Aspire lentamente el virus, que generalmente se recupera en ~ 1 ml.
    3. Retire la aguja del tubo, lo que hará que el material restante en el gradiente fluya fuera del tubo hacia la mitad inferior de la placa de cultivo celular (cualquier líquido debe tratarse como residuo peligroso).
    4. Transfiera la solución de virus en la jeringa a un tubo de microcentrífuga estéril sobre hielo.
      NOTA: Cuando recupere el virus en este paso, coloque la aguja de modo que la luz de la aguja quede hacia arriba con la abertura de la aguja unos pocos mm por debajo de la banda rica en virus. Evite la contaminación por la banda delgada de virus ensamblado incorrectamente que a veces se observa 2-3 mm por encima del virus con bandas (ver flecha negra delgada en la Figura 1A).
  9. Eliminar el CsCl de la muestra mediante filtración en gel.
    1. Equilibre una columna PD-10 (preempaquetada con Sephadex G-25M), sujeta a un soporte de soporte, con 50 ml de PBS filtrado estéril de 0,2 μm que contiene 10% (v/v) de glicerol.
      NOTA: El paso de equilibrio inicial tarda 2-3 h en completarse y es necesario para garantizar el lavado completo de los conservantes que utiliza el fabricante para estabilizar la columna.
    2. Deje que la solución de lavado retroceda por debajo de la frita (un disco protector de material blanco en la parte superior del medio de la columna) y, a continuación, transfiera con cuidado la solución de virus purificada recogida en el paso 1.8 a la parte superior de la columna. Permita que la solución rica en virus retroceda por debajo de la frita y luego comience a llenar la columna con PBS-glicerol.
      NOTA: Una función de la frita es evitar que la columna se seque. Como resultado, se toleran retrasos cortos antes de que se agregue más eluyente a la columna.
    3. Recoger el eluido en 12 tubos de microcentrífuga estériles, 0,5 mL por fracción.
  10. Determinar el rendimiento viral.
    1. Determinar las fracciones máximas del virus mediante espectrofotometría. Prepare una dilución 1:100 de cada fracción en PBS y mida el OD260 en un espectrofotómetro, utilizando una dilución 1:100 del tampón solo como espacio en blanco. Las partículas de virus deben eluir en el volumen vacío, comenzando alrededor de la fracción 6. Agrupe las fracciones que contienen las lecturas más altas de OD260 .
    2. Haga una dilución 1:100 de las fracciones virales agrupadas y vuelva a medir el OD260. Calcule la concentración final de partículas de virus y el número de PIV en las fracciones agrupadas utilizando la siguiente fórmula: Partículas de virus por ml = OD260 × 100 (esto corrige el factor de dilución) × 1012. Una estimación general es que el 1% de las partículas del virus son PIV, como tal: PIV/ml = OD 260 × 100 × 10 10 o PIV/μL = OD260 × 100 ×10 7.
  11. Alícuota las fracciones de virus agrupadas (que contienen 5 x 107 a 1 x 108 PIV) en tubos de microcentrífuga estériles o crioviales. Conservar las muestras a -80 °C.

2. Transducción de vejiga de roedor

NOTA: Si es nuevo en esta técnica, se recomienda que el número de animales transducidos a la vez se limite a 2-4. Esto se puede lograr escalonando los tiempos de inicio de cada animal, especialmente durante el tratamiento con detergente en el paso 2.2, y luego la incubación del virus en el paso 2.3. Los investigadores experimentados pueden transducir hasta seis animales a la vez.

  1. Cateterizar la vejiga
    1. Anestesiar ratones hembra C57Bl/6J (típicamente 8-10 semanas de edad, ~20-25 g) o ratas hembras Sprague Dawley (típicamente 2-3 meses de edad, ~250 g) usando un vaporizador con un cono nasal adjunto. Calibre el vaporizador para producir 3.0% (v/v) de isoflurano, 97% (v/v) O2 para ratones o 4.0% (v/v) isoflurano, 96% (v/v)O2 para ratas. Confirme que los animales están anestesiados asegurándose de que no respondan al pellizco del dedo del pie (generalmente después de 1-2 minutos).
    2. Mantenga la temperatura corporal del animal colocando a los animales en una almohadilla térmica. Controle al animal durante todo el protocolo de transducción para asegurarse de que los animales estén anestesiados y no experimenten ningún dolor durante este procedimiento.
    3. Reducir el isoflurano al 1,5% (v/v) para ratones o al 2,0% (v/v) para ratas y mantener a los animales bajo anestesia durante la duración del protocolo.
    4. Para evitar la introducción de aire en la vejiga, llene la porción plástica del catéter de un catéter intravenoso (consulte la Tabla de materiales) y el cubo asociado con PBS estéril usando una pipeta de transferencia.
    5. Con el animal en posición supina, frote el meato externo con alcohol al 70% e inserte el catéter estéril en el meato externo, luego en la uretra y luego en la vejiga.
      1. Para realizar esta tarea, use pinzas finas para agarrar suavemente el tejido que forma el meato externo y extenderlo verticalmente, lejos del animal. Con la otra mano, inserte cuidadosamente el catéter verticalmente unos 3-4 mm en el meato uretral (un montículo de carne justo encima de la abertura de la vagina). Luego, debido a una curva en la uretra, baje el catéter, insertado en el meato externo, hacia la cola del animal, lo que facilita su entrada en la porción de la uretra que pasa por debajo del hueso púbico y, finalmente, en la vejiga.
        . NOTA: Especialmente en el caso del ratón, el catéter puede ser demasiado largo y no se deben insertar más de 1.0-1.1 cm en el animal. De lo contrario, se producirá daño a la mucosa de la vejiga. Para evitar esto, marque el catéter ~1 cm por debajo de su punta y luego no inserte el catéter más allá de esta marca.
    6. Permita que la orina en la vejiga se escape. Elimine cualquier orina residual realizando la maniobra de Credé: masajee y presione suavemente hacia abajo la protuberancia de la vejiga en el área abdominal inferior.
  2. Haga que el urotelio sea receptivo a la transducción tratándolo con una solución detergente.
    1. Lave la vejiga del ratón o rata conectando una jeringa estéril de 1 ml llena de PBS al cubo del catéter. Inyecte 100 μL de PBS estéril en la vejiga del ratón (o 450 μL en el caso de la vejiga de rata). Separe la jeringa del accesorio del catéter y permita que el PBS drene. Si es necesario, realice la maniobra de Crede para eliminar el exceso de líquido de la vejiga.
    2. Instilar 100 μL de N-dodecil-β-D-maltósido (DDM) al 0,1% (p/v) (disuelto en PBS y 0,2 μm esterilizado por filtro) en la vejiga del ratón utilizando una jeringa estéril de 1 ml. Retenga la DDM en la vejiga durante 10 minutos dejando la jeringa en su lugar. En ratas, el volumen de DDM aumenta a 450 μL.
    3. Retire el DDM de la vejiga desprendiendo la jeringa y dejando que drene. Realice la maniobra de Crede si es necesario.
  3. Introducir el virus en la vejiga.
    1. Conecte una jeringa estéril de 1 ml al cubo del catéter e instilar 0,5 x 107 a 1 x 108 PIV de adenovirus (preparado en el paso 1), diluido en 100 μL de PBS estéril para ratones o 450 μL para ratas, en la vejiga. Deje la jeringa conectada al catéter para evitar que la solución del virus se escape.
    2. Después de 30 minutos, separe la jeringa y permita que la solución del virus evacue la vejiga a una almohadilla desechable. Seque cualquier solución de virus residual con una toallita absorbente y deseche la almohadilla y limpie los desechos biopeligrosos.
      NOTA: El glicerol es citotóxico. Como tal, el volumen máximo de solución de virus instilada en ratones se limita a 5 μL (que cuando se diluye en 100 μL de PBS daría como resultado una concentración final de glicerol de ~ 0.5% [v / v]). Además, es posible mejorar la eficiencia de la transducción aumentando el número de PIV instiladas y extendiendo la incubación del virus a 45 min.
    3. Paso opcional: La vejiga se puede enjuagar con PBS como se describe en el paso 2.2.1 anterior; sin embargo, esto no es necesario.
  4. Permita que el animal se recupere.
    1. Detener el flujo de isoflurano y permitir que el animal se recupere y esté completamente móvil antes de devolverlo a su jaula, especialmente si los animales están alojados en grupo.
      NOTA: Como la transducción del virus per se no causa síntomas observables del tracto urinario inferior o dolor, generalmente no hay necesidad de tratamiento postquirúrgico. Sin embargo, si el transgén codificado es tóxico, puede ser necesaria la analgesia posterior al procedimiento o los antibióticos, según lo requiera la institución.
  5. Analizar los efectos de la expresión transgénica 12-72 h después del tratamiento utilizando métodos como la hibridación in situ de ARNm, western blot o inmunofluorescencia 9,10,23 (ver los resultados representativos).

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Resultados

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Preparación del virus
Un ejemplo de purificación de virus por centrifugación por gradiente de densidad se muestra en la Figura 1A. La banda de color rosa claro, que se encuentra en la interfaz del material celular cargado y la capa de CsCl de 1,25 g/ml, está compuesta principalmente de células interrumpidas y sus restos (ver flecha magenta en la Figura 1A). Deriva su color rosado de la pequeña cantidad de medio de cultivo que se transfiere de...

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Discusión

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Mientras que Ramesh et al. se centraron en desarrollar estrategias para utilizar la transducción adenoviral en el tratamiento del cáncer de vejiga 18, informes más recientes han demostrado la utilidad de estas técnicas en el estudio de la biología/fisiología urotelial normal y la fisiopatología 10,18,19,20,21 . Las características impor...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por una adjudicación de proyecto piloto a través de P30DK079307 (a M.G.D.), subvención de los NIH R01DK119183 (a G.A. y M.D.C.), subvención de los NIH R01DK129473 (a G.A.), un premio de Desarrollo Profesional de la Asociación Americana de Urología y una subvención de la Fundación Winters (a N.M.), por los Núcleos de Imágenes Renales de Fisiología Celular y Organismos Modelo del Centro de Investigación Renal de Pittsburgh (P30DK079307), y por S10OD028596 (a G.A.), que financió la compra del sistema confocal utilizado para capturar algunas de las imágenes presentadas en este manuscrito.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Pipeta de 10 mLCorning Costar (Millipore Sigma)CLS4488pipeta estéril serológica, envuelta individualmente
Tubo de ultracentrífuga de 12 mLThermoFisher06-752 Tubo deultracentrífuga de pared fina de PET Tubo
centrífuga cónico de 15 mLFalcon (Corning)352097
estéril aguja de 18 gBD 305196Aguja de 18 G x 1,5 pulgadas
Pipeta de 20 mLCorning Costar (Millipore Sigma)CLS4489pipeta serológica estéril, envuelta individualmente
Tubo de centrífuga cónico de 50 mLFalcon (Corning)352098estéril
5 mLCorning Costar (Millipore Sigma)CLS4487pipeta serológica estéril, envuelta individualmente
CavicideHenry Schein6400012Solución antiviral
Placa de cultivo celular - 15 cmFalcon (Corning)353025estéril, tratado con cultivo de tejidos  (Plato de 150 mm x 25 mm)
Raspador de célulasSarstedt893.1832longitud del mango 24 cm, longitud de la hoja 1,7 cm
CsClMillipore SigmaC-4306 Grado debiología molecular ≥ 98%
Medio de cultivo DMEM (glucosa alta)Gibco (ThermoFisher)11965092con 4,5 g/L glucosa + L-glutamina + rojo
fenol EDTAMillipore SigmaEDSBioiultra grado ≥ 99%
Suero fetal bovino Hyclone (Cytiva)SH30070.03sérico definido
Pipeta de vidrioFisher Scientific13-678-20A5.75 en pipeta de vidrio, esterilizada en autoclave
GlicerolMillipore SigmaG-5516Grado de biología molecular ≥ 99%
Células HEK293 Las célulasHEK293T ATCCCRL-3216son una variante de las células HEK293 que expresan el antígeno T grande SV40
IsofluranoCovetrus29405
Catéter intravenoso - ratónSmith Medical Jelco306324 G x 3/4 in Catéter intravenoso de seguridad 
catéter intravenoso radiopaco - rataSmith Medical Jelco306022 G x 1 in Catéter intravenoso de seguridad radiopaco
KClMillipore SigmaP-9541Biología Molecular grado ≥ 99%
KH2PO4Millipore SigmaP5655Grado de cultivo celular  ≥ 99%
Na2HPO4• 7 H2OMillipore Sigma431478  ≥ 99.99%
NaClMillipore SigmaS3014Grado de Biología Molecular ≥ 99%
N-dodecilo-β-D-maltósido Millipore SigmaD4641  ≥ 98%
Cono de nariz para múltiples animalesdiseñadasincluyen una de Parkland Scientific (RES3200)
Columna PD-10 GE Healthcare17-085-01Columnas preempaquetadas rellenas con el antibiótico Sephadex G-25M
Penicilina/estreptomicina (100x)Gibco (ThermoFisher)15070063100x solución concentrada
EspectrofotómetroEppendorf BioFotómetro
Soporte y abrazaderaFisher Scientific14-679Q y 05-769-8FQdisponibles de numerosos proveedores
Unidad de filtro estérilFisher Scientific (Nalgene)09-740-65B0.2 µ m unidad de filtro de flujo rápido (150 mL)
Unidad de filtro estéril 0,2 y micro; m (jeringa)Fisher Scientific SLGV004SLMillipore Sigma Milex 0.22 µ m unidad de filtro que se conecta a la jeringa
centrífuga de súper velocidadEppendorf 5810Rcon rotor de ángulo fijo Eppendorf F34-6-38 (12.000 rpm)
Jeringa (1 mL)BD 309628Jeringa de 1 mL Punta Luer-lok - estéril
Jeringa (3 mL)BD 309656Punta deslizante de jeringa de 3 mL - estéril
Centrífuga de sobremesa (baja velocidad)Eppendorf 5702con rotor de cangilón basculante
Pipetas de transferenciaFisher Scientific13-711-9AMpolietileno 3,4 mL
de transferencia Tris-baseMillipore Sigma648310-MGrado de biología molecular 
TrypLE select solución de proteasaGibco (ThermoFisher)12604013Enzima exprés TrypLE (1x), ultracentrífuga sin rojo fenol
Beckman CoulterOptima L-80 XPcon rotor Beckman SW41 (41.000 rpm)
Vaporizador Servicios de Anestesia General, Inc.Tec 3Vaporizador de isoflurano
Mezclador de vórticeVWR10153-838mezclador de vórtice analógico
de pipeta de Las opciones comerciales a medida pipeta

Referencias

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