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Bioengineering

जीवित ऊतक में सीटू में चमक को मापने के लिए एक इंट्रा-टिशू रेडियोमेट्री माइक्रोप्रोब

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/64595
Automatic Translation
1,3, 2,4, 1,3
1Department of Physics, Yale University, 2Lund Vision Group, Department of Biology, Lund University, 3Department of Physics and Astronomy, University of Pennsylvania, 4Department of Biology, Duke University

Summary

इस पेपर में, जीवित ऊतक में सीटू में चमक को मापने के लिए एक विधि का वर्णन किया गया है। इस काम में चमक और विकिरण के विभिन्न मापों के लिए माइक्रो-स्केल जांच के निर्माण का विवरण शामिल है, चमक के लक्षण वर्णन के लिए बढ़ते ऊतक के लिए मार्गदर्शन प्रदान करता है, और परिणामस्वरूप डेटा का विश्लेषण करने के लिए कम्प्यूटेशनल तरीकों की रूपरेखा तैयार करता है।

Abstract

जीव बड़े पैमाने पर अपारदर्शी दिखाई देते हैं क्योंकि उनकी बाहरी ऊतक परतें घटना प्रकाश के लिए दृढ़ता से बिखर रही हैं; रक्त जैसे पिगमेंट को दृढ़ता से अवशोषित करने वाले पिगमेंट में आमतौर पर संकीर्ण अवशोषण होते हैं, जैसे कि अवशोषण चोटियों के बाहर प्रकाश का औसत मुक्त मार्ग काफी लंबा हो सकता है। जैसा कि लोग ऊतक के माध्यम से नहीं देख सकते हैं, वे आम तौर पर कल्पना करते हैं कि मस्तिष्क, वसा और हड्डी जैसे ऊतकों में बहुत कम या कोई प्रकाश नहीं होता है। हालांकि, फोटोरेस्पॉन्सिव ऑप्सिन प्रोटीन इन ऊतकों में से कई के भीतर व्यक्त किए जाते हैं, और उनके कार्यों को खराब तरीके से समझा जाता है। प्रकाश संश्लेषण को समझने के लिए ऊतक के आंतरिक विकिरण भी महत्वपूर्ण है। उदाहरण के लिए, विशाल क्लैम दृढ़ता से अवशोषित होते हैं फिर भी ऊतक में गहरे शैवाल की घनी आबादी बनाए रखते हैं। तलछट और बायोफिल्म जैसी प्रणालियों के माध्यम से प्रकाश प्रसार जटिल हो सकता है, और ये समुदाय पारिस्थितिकी तंत्र उत्पादकता में प्रमुख योगदानकर्ता हो सकते हैं। इसलिए, जीवित ऊतक के अंदर इन घटनाओं को बेहतर ढंग से समझने के लिए स्केलर विकिरण (फोटॉन फ्लक्स एक बिंदु को प्रतिच्छेद करता है) और डाउनवेलिंग विकिरण (फोटॉन फ्लक्स एक विमान को लंबवत पार करता है) को मापने के लिए ऑप्टिकल माइक्रो-प्रोब के निर्माण के लिए एक विधि विकसित की गई है। यह तकनीक क्षेत्र प्रयोगशालाओं में भी वापस लेने योग्य है। ये माइक्रो-प्रोब गर्मी-खींचे गए ऑप्टिकल फाइबर से बने होते हैं जो तब खींचे गए ग्लास पिपेट में सुरक्षित होते हैं। जांच की कोणीय स्वीकृति को बदलने के लिए, टाइटेनियम डाइऑक्साइड के साथ मिश्रित यूवी-इलाज योग्य एपॉक्सी के 10-100 μm आकार के गोले को फिर एक खींचे गए, छंटनी किए गए फाइबर के अंत तक सुरक्षित किया जाता है। जांच को जीवित ऊतक में डाला जाता है, और इसकी स्थिति को माइक्रोमैनिपुलेटर का उपयोग करके नियंत्रित किया जाता है। ये जांच 10-100 μm के स्थानिक रिज़ॉल्यूशन पर या एकल कोशिकाओं के पैमाने पर सीटू ऊतक चमक को मापने में सक्षम हैं। इन जांचों का उपयोग एक जीवित माउस की त्वचा के नीचे 4 मिमी वसा और मस्तिष्क कोशिकाओं तक पहुंचने वाले प्रकाश को चिह्नित करने और जीवित शैवाल समृद्ध विशाल क्लैम ऊतक के भीतर समान गहराई तक पहुंचने वाले प्रकाश को चिह्नित करने के लिए किया गया था।

Introduction

आश्चर्यजनक रूप से, भूमि जानवरों और उथले समुद्र के निवासियों के पास दृश्य शरीर विज्ञान और यहां तक कि प्रकाश संश्लेषण के लिए उनके शरीर के भीतर पर्याप्त प्रकाश है। उदाहरण के लिए, माउस के सिर के केंद्र में प्रकाश का स्तर (मजबूत हीमोग्लोबिन अवशोषण बैंड के बाहर) बाहरी दुनिया के सापेक्ष परिमाण के तीन या चार आदेशों से क्षीण हो जाता है। यह मोटे तौर पर घर के अंदर और बाहर प्रकाश के स्तर के बीच का अंतर है। तो, मजबूत प्रकीर्णन के कारण ऊतक या सामग्री की अस्पष्टता मजबूत प्रकाश अवशोषण के कारण अस्पष्टता के समान नहीं है। प्रकाश एक दृढ़ता से आगे-प्रकीर्णन प्रणाली में लंबी दूरी पर फैल सकता है, कोशिकाओं और कणोंकी उच्च सांद्रता के साथ जलीय प्रणालियों के माध्यम से प्रकाश का प्रसार होता है। यह अवलोकन इस तथ्य के प्रकाश में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है कि ऑप्सिन प्रोटीन सभी जानवरों के सभी ऊतकों में लगभग सर्वव्यापी रूप से व्यक्त किए जाते हैं। इस प्रकार, यह समझना महत्वपूर्ण है कि जीवित ऊतक के भीतर प्रकाश कैसे और कहां क्षीण और बिखरा हुआ है। हालांकि, जलीय प्रणालियों के विपरीत, जीवित ऊतक के साथ, पानी के स्तंभ में एक उपकरण को विसर्जित करना और चमक और विकिरण माप प्राप्त करना असंभव है, और एक नई तकनीक आवश्यक है।

जीवित ऊतक के अवशोषण और प्रकीर्णन गुणों को चिह्नित करने के लिए पहले उपयोग की जाने वाली अन्य विधियों में ऊतक परावर्तनीयता जांच को मापना और / या गोले2,3 को एकीकृत करना, सूक्ष्म तरीके जैसे कि स्कैनिंग कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी4, सतह5 पर लेजर प्रकाश के प्रसार को मापना और मोंटे कार्लो विकिरण हस्तांतरण6 जैसी मॉडलिंग तकनीक शामिल हैं।. उल्लिखित प्रयोगात्मक विधियों को अक्सर ऊतक संरचना के बारे में विशिष्ट, बड़े और महंगे उपकरण या विस्तृत ज्ञान की आवश्यकता होती है और आम तौर पर ऊतक के भीतर गहरे प्रकाश की स्थानिक संरचना को चिह्नित करने की उनकी क्षमता में सीमित होते हैं।

इसी तरह की जांच-आधारित विधियां भी हैं जो ऊतक7,8,9 के माध्यम से ऑप्टिकल फाइबर डालने के लिए हाइपोडर्मिक सुई का उपयोग करती हैं। हमारे अनुभव में, संशोधित सुइयां ऊतक को घुमाने में प्रभावी होती हैं, लेकिन घनी कोशिकाओं से गुजरने पर काफी बल की आवश्यकता होती है और आम तौर पर नाजुक ऊतकों को फाड़देती हैं। इसलिए, इन सुइयों को आमतौर पर ऊतक परत में एक मिलीमीटर या उससे अधिक डालने के लिए एक शल्य चिकित्सा प्रक्रिया की आवश्यकता होती है। यहां वर्णित विधि, एक चिकनाई, खींचे गए ग्लास समर्थन का उपयोग करके, ऊतक के न्यूनतम घाव के साथ और अतिरिक्त सर्जरी के बिना कोशिकाओं के बीच स्लाइड करने में सक्षम है।

यह पांडुलिपि ग्लास-समर्थित ऑप्टिकल माइक्रोप्रोब्स और पोर्टेबल इलेक्ट्रॉनिक्स का उपयोग करके एल्गल मैट10,11 के भीतर प्रकाश को मापने पर जोर्गेनसन और सहयोगियों के काम से प्रेरित एक विधि प्रस्तुत करती है जो घने ऊतक में गहराई से जांच करने और क्षेत्र में निर्माण और उपयोग करने के लिए उत्तरदायी हैं। इन जांचों का निर्माण उच्च स्थानिक रिज़ॉल्यूशन पर जीवित ऊतक के अंदर स्केलर विकिरण (सभी दिशाओं से एक बिंदु से टकराने वाला प्रकाश) और डाउनवेलिंग रेडियंस (एक क्षैतिज तल को प्रतिच्छेद करने वाला प्रकाश) को चिह्नित करने के लिए किया जा सकता है। ये जांच मूल रूप से फोटोसिम्बायोटिक विशाल क्लैम12 के ऊतक के भीतर विकिरण हस्तांतरण को मापने के लिए विकसित की गई थी। कुल ऊतक के अवशोषण और संचरण के मानक माप ऊतक के प्रकाश संश्लेषक प्रदर्शन को चिह्नित करने के लिए पर्याप्त नहीं थे, क्योंकि यह एक बड़ा अंतर बनाता है कि क्या सभी घटना प्रकाश ऊतक की सतह पर उच्च तीव्रता का अनुभव करने वाली कुछ कोशिकाओं द्वारा अवशोषित होते हैं या ऊतक की मात्रा में कम तीव्रता का अनुभव करने वाली कई कोशिकाएं होती हैं। एक दूसरी परियोजना में, इन जांचों का उपयोग माउस के मस्तिष्क13,14 के भीतर विवो विकिरण को मापने के लिए किया गया था, जिससे मस्तिष्क के भीतर गहराई से व्यक्त ऑप्सिन के प्रकाश वातावरण को चिह्नित किया गया था। ये माइक्रो-प्रोब ्स माउस मस्तिष्क के ऊतकों के भीतर विकिरण को मापने के लिए पर्याप्त छोटे और संवेदनशील दोनों हैं, जिसमें सभी फर, त्वचा और हड्डी बरकरार है और यह प्रदर्शित करती है कि शारीरिक प्रकाश का स्तर गहरे मस्तिष्क के ऑप्सिन को उत्तेजित करने के लिए आसानी से पर्याप्त है।

यह माइक्रो-ऑप्टिकल जांच और मापने वाला सेटअप शोधकर्ताओं के लिए उपयोगी हो सकता है, जिन्हें जैविक ऊतक के आंतरिक प्रकाश को मापने और चिह्नित करने की आवश्यकता होती है, विशेष रूप से प्रकाश संश्लेषण की अधिक सूक्ष्म समझ या आंखों के बाहर व्यक्त दृश्य वर्णक के कार्यों के लिए। इस विधि का उपयोग अकेले या अन्य तकनीकों के साथ संयोजन में किया जा सकता है ताकि कम लागत पर जीवित ऊतक के भीतर ऑप्टिकल गुणों और प्रकाश प्रसार को पूरी तरह से चिह्नित किया जा सके, जिसमें छोटे पोर्टेबल उपकरण इन-हाउस और कार्य-निर्भर समायोज्य मापदंडों के साथ बनाए गए हैं।

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Protocol

यह अध्ययन कशेरुक और अकशेरुकी पशु अनुसंधान के संबंध में येल विश्वविद्यालय के सभी प्रासंगिक नैतिक नियमों के अनुरूप है।

1. ऑप्टिकल माइक्रो-प्रोब का निर्माण

  1. ग्लास आस्तीन का निर्माण, सामग्री: पाश्चर पिपेट, 5.75 इंच ( सामग्री की तालिका देखें)
    1. एक माउंटेबल मगरमच्छ क्लिप (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके, ग्लास पिपेट को चौड़े छोर से माउंट करें ताकि पतला छोर फर्श की ओर नीचे की ओर हो और पिपेट का अभिविन्यास फर्श के लंबवत हो।
    2. पिपेट के पतले छोर से 50 ग्राम प्लास्टिक वाइस ग्रिप (सामग्री की तालिका) लटकाएं। फिसलन को रोकने में मदद करने के लिए पिपेट और वाइस ग्रिप के बीच विद्युत टेप का एक पैड रखें।
    3. एक छोटे ब्यूटेन टॉर्च (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके पिपेट के पतले छोर को गर्म करें। आंच को वाइस ग्रिप से 1 सेमी ऊपर लगाएं। मशाल को इस तरह पकड़ें कि लौ का सबसे चमकीला हिस्सा कांच से 3 सेमी दूर हो और कांच लौ की नोक पर हो। जब पिपेट की लंबाई लगभग 5 इंच बढ़ जाती है, तो तुरंत आंच को हटा दें।
    4. पिपेट के खींचे गए छोर को उस बिंदु पर ट्रिम करने के लिए छोटी कैंची या ग्लास कटर का उपयोग करें जहां नया खींचा गया व्यास अगले खंड में उपयोग किए जाने वाले ऑप्टिकल फाइबर से लगभग दोगुना है (चरण 1.2 देखें)। कार्बोरंडम पेपर (सामग्री की तालिका) का उपयोग करके छंटनी किए गए छोर के किसी भी तेज क्षेत्रों को दर्ज करें। आइसोप्रोपिल अल्कोहल की एक धारा की बोतल का उपयोग करके किसी भी परिणामी छोटे कांच के टुकड़ों या धूल को कुल्ला करें, जिसके बाद संपीड़ित हवा होती है।
  2. ऑप्टिकल फाइबर खींचना (चित्रा 1 डी)।
    1. ऑप्टिकल फाइबर को अलग करने के लिए रेजर ब्लेड का उपयोग करें, 200 μm व्यास एसएमए-समाप्त ऑप्टिकल फाइबर (सामग्री की तालिका) के एक एसएमए कनेक्टर को हटादें। एसएमए समाप्ति में से एक के करीब कटौती करें। फिर, अगले 5 सेमी प्लास्टिक और फाइबरग्लास जैकेटिंग को हटाने के लिए रेजर ब्लेड का उपयोग करें ताकि नंगे ऑप्टिकल फाइबर उजागर हो और बाकी बरकरार विधानसभा से बाहर निकल जाए।
    2. ग्लास फाइबर से पॉलीमाइड बहुलक कोटिंग को जलाने के लिए ब्यूटेन टॉर्च का उपयोग करें। आइसोप्रोपेनोल से धो लें। लिंट-फ्री वाइप का उपयोग करके नंगे ग्लास फाइबर को साफ करें।
    3. अगला कदम नंगे फाइबर को माउंट करना है ताकि इसे लौ के साथ भी खींचा जा सके। ऑप्टिकल फाइबर के नंगे छोर को सीधे एक टेबल या शेल्फ किनारे पर एक प्लियर क्लैंप (सामग्री की तालिका) में माउंट करें, जिससे फाइबर का एसएमए-समाप्त छोर फर्श की ओर लटक जाए। फाइबर के जैकेट वाले छोर पर दो छोटे क्लैंप (कुल वजन: 10 ग्राम) के रूप में खींचने के लिए वजन जोड़ें, जहां से नंगे ऑप्टिकल फाइबर को प्लियर क्लैंप में रखा जाता है।
    4. फाइबर खींचने के लिए, ब्यूटेन टॉर्च लौ के साथ शुरू करें। आंच चालू होने के साथ, ब्यूटेन टॉर्च को नंगे फाइबर से 1 सेमी पकड़ें ताकि लौ ऑप्टिकल फाइबर के लंबवत हो और 3 सेमी नीचे लंबवत हो जहां प्लियर क्लैंप नंगे फाइबर रखता है। फाइबर को खींचने, खींचने, अलग करने और फर्श पर गिरने की अनुमति दें।
    5. परिणामी खींचे गए ऑप्टिकल फाइबर अंत की जांच करें। कार्बोरंडम पेपर के साथ किसी भी अनियमितता को धीरे से दूर करें, आइसोप्रोपिल अल्कोहल और लिंट-फ्री वाइप के साथ साफ करें, और संपीड़ित हवा के साथ सुखाएं।
      नोट: इस बिंदु पर, कोई खींचे गए फाइबर के आकार और आकार को चिह्नित करने और दस्तावेज करने के लिए एक माइक्रोस्कोप का उपयोग कर सकता है।
    6. फाइबर के किनारों को काला करने और आवारा प्रकाश (सामग्री की तालिका) के प्रवेश को रोकने के लिए एक फिल्म-ओपेक्विंग पेन का उपयोग करें। धीरे से फाइबर को पेन की नोक पर खींचें, जिससे नोक पर केवल एक छोटा सा क्षेत्र खुला रह जाए।
  3. ग्लास पिपेट आस्तीन के अंदर खींचे गए फाइबर को माउंट करना (चित्रा 1 ए)।
    1. स्टीरियोमाइक्रोस्कोप के तहत काम करते हुए, चरण 1.1 से परिवर्तित ग्लास पिपेट के चौड़े छोर में चरण 1.2 से पतला ऑप्टिकल फाइबर को सावधानीपूर्वक डालें, और फाइबर को तब तक धक्का दें जब तक कि ~ 1 मिमी नंगे फाइबर पिपेट के पतले छोर से बाहर न चिपक जाए।
    2. विद्युत टेप का उपयोग करके, ऑप्टिकल फाइबर के जैकेट वाले छोर को पिपेट के विस्तृत छोर तक सुरक्षित करें।
    3. एक छोटे गेज सुई (सामग्री की तालिका) पर साइनोएक्रिलेट चिपकने वाला एक बूंद डालें। खींचे गए फाइबर के नंगे छोर से बचते हुए, खींचे गए पिपेट के कटे हुए किनारे पर चिपकने वाली बूंद को ध्यान से स्पर्श करें।
    4. पिपेट की दीवार और ऑप्टिकल फाइबर के बीच के क्षेत्र को गीला करते हुए, चिपकने वाले को पिपेट में बाती करने के लिए केशिका कार्रवाई की अनुमति दें। जांच असेंबली को स्थानांतरित करने से पहले चिपकने वाले को कम से कम 15 मिनट के लिए ठीक करने की अनुमति दें।
  4. एक प्रकीर्णन गोले के साथ फाइबर टिप को संशोधित करना (चित्रा 1 सी)।
    1. ~ 1: 1 v / v पर टाइटेनियम डाइऑक्साइड पाउडर (सामग्री की तालिका) के साथ यूवी-इलाज योग्य चिपकने वाला की एक बूंद को मिलाकर प्रकीर्णन बॉल टिप के लिए कच्चा माल बनाएं।
    2. जांच को एक माउंटिंग रॉड होल्डर (सामग्री की तालिका) के साथ एक माइक्रोमैनिपुलेटर से संलग्न करें ताकि जांच एक क्षैतिज अभिविन्यास में हो। ऊपर तैयार चिपकने वाले/टीआईओ2 मिश्रण में तार या सुई की नोक को डुबोकर प्रकीर्णन सामग्री का एक कार्यशील जलाशय तैयार करें ताकि चिपकने वाला पदार्थ की एक बूंद बन जाए। क्षैतिज जांच के सिरे के पास बूंद के साथ तार या सुई माउंट करें। बेंच पर लगे मगरमच्छ क्लिप का उपयोग करके ऐसा करना सुविधाजनक है।
    3. जांच की नोक पर एक प्रकीर्णन गोला जमा करें। जांच के ऑप्टिकल फाइबर की नोक को धीरे-धीरे और सावधानी से चिपकने वाला / टीआईओ2 की बूंद में धकेलने के लिए माइक्रोमैनिपुलेटर का उपयोग करें। फिर, जल्दी से गोंद से टिप वापस ले लें। ऑप्टिकल फाइबर की नोक पर वांछित आकार के चिपकने वाली एक गोलाकार बूंद जमा होने तक दो से तीन बार दोहराएं।
      नोट: प्रकीर्णन क्षेत्र पतला ऑप्टिकल फाइबर के व्यास से दो से आठ गुना अधिक व्यास पर स्थिर होगा। अंतिम इष्टतम आकार अंतिम वांछित अनुप्रयोग पर निर्भर करता है।
    4. ऑप्टिकल फाइबर के एसएमए-समाप्त छोर को फाइबर-युग्मित यूवी प्रकाश स्रोत (सामग्री की तालिका) से जोड़कर गोले का इलाज करें।
      नोट: इस अध्ययन में उपयोग किए गए प्रकाश स्रोत में 5.3 मेगावाट की शक्ति थी। इस शक्ति पर, अनुशंसित इलाज का समय कम से कम 12 घंटे या रात भर है। इलाज के बाद अंतिम ऑप्टिकल जांच टिप के आकार को चिह्नित करने और मापने का एक अच्छा समय है।

2. ऑप्टिकल माप के लिए ऊतक तैयार करना और बढ़ाना (चित्रा 2 और चित्रा 3)।

  1. एक प्रयोग के लिए नमूने माउंट करने के लिए व्यंजन तैयार करें। 35 मिमी x 10 मिमी प्लास्टिक पेट्री डिश के तल में 0.5 सेमी व्यास के छेद को पिघलाने के लिए एक पंच बनाने के लिए ब्यूटेन टॉर्च का उपयोग करके पाश्चर पिपेट के बड़े छोर को गर्म करें। डिश के निचले हिस्से में छेद को विद्युत टेप या लैब टेप के साथ सील करें। दक्षता के लिए एक समय में कई बनाएं।
  2. पैकेज पर दिए गए निर्देशों के अनुसार तरल जिलेटिन (सामग्री की तालिका) तैयार करें।
    नोट: किराने की दुकान से वाणिज्यिक खाद्य-ग्रेड स्वादहीन जिलेटिन रासायनिक आपूर्तिकर्ताओं से रासायनिक-ग्रेड जिलेटिन की तुलना में इस उद्देश्य के लिए बेहतर है क्योंकि रासायनिक-ग्रेड जिलेटिन खाद्य उत्पाद की तुलना में कम ऑप्टिकल रूप से स्पष्ट और कम यांत्रिक रूप से विश्वसनीय है।
  3. उपयोग किए जाने वाले ऊतक का विच्छेदन और तैयारी करें।
    नोट: अनुभव से, 1 सेमी मोटे तक के किसी भी सपाट ऊतक को इस प्रयोग में ब्याज की प्रणाली के लिए उपयुक्त किसी भी विच्छेदन तकनीक का उपयोग करके सफलतापूर्वक मापा जा सकता है। विशाल क्लैम ऊतक के लिए, प्रयोग12 में उपयोग के लिए क्लैम ऊतक का एक सपाट, नियमित सर्कल बनाने के लिए 8 मिमी बायोप्सी पंच का उपयोग किया गया था। इस प्रणाली के लिए, माप को पूरा करने के लिए आवश्यक समय की लंबाई को देखते हुए एक समय में केवल एक नमूना प्रभावी ढंग से तैयार किया जा सकता है ताकि यह सुनिश्चित किया जा सके कि नमूना प्रयोग के अंत में अभी भी आजीवन स्थिति में था।
  4. तरल जिलेटिन के साथ चरण 2.1 से एक चौथाई रास्ते से दो पेट्री व्यंजन भरें, और कमरे के तापमान (आरटी) को गेलेशन से कम ठंडा होने दें। एक डिश में, बायोप्सी को चिपचिपे जिलेटिन के कुशन में रखें जो डिश के तल में छेद में बनता है। पेट्री डिश के भरे होने तक बायोप्सी के चारों ओर आरटी जिलेटिन को धीरे से जोड़ने के लिए पाश्चर पिपेट का उपयोग करें (चित्रा 3)। खाली नमूना बनाने के लिए जिलेटिन के साथ दूसरी डिश भरें।
  5. नमूना व्यंजन ों को लगभग 10-30 मिनट के लिए रेफ्रिजरेटर में रखें जब तक कि जिलेटिन पूरी तरह से ठीक न हो जाए और स्पर्श के लिए थोड़ा लोचदार न हो जाए।
    नोट: एक शांत कमरे में, यह आवश्यक नहीं हो सकता है; उष्णकटिबंधीय क्षेत्रों में काम करते समय, जिलेटिन को पूरी तरह से ठीक करने के लिए इस कदम की आवश्यकता होती है।
  6. माइक्रोमैनिपुलेटर पर पेट्री डिश के लिए एक माउंट बनाना (चित्रा 2)।
    1. मोटे प्लेक्सीग्लास (सामग्री की तालिका) में 1/4 के 6 सेमी x 6 सेमी वर्ग को काटें।
    2. पेट्री डिश (~ 35 मिमी) के समान व्यास के प्लास्टिक वर्ग में एक छेद ड्रिल करें या पिघलाएं। सुनिश्चित करें कि पेट्री डिश इस छेद में अच्छी तरह से फिट बैठता है और घर्षण के साथ जगह पर रखा जाता है। आकार और घर्षण संपर्क को थोड़ा बढ़ाने के लिए पकवान के किनारों पर टेप जोड़ें।
    3. प्लास्टिक वर्ग के कोने में 1/4 व्यास के छेद को ड्रिल या पिघलाएं। स्क्रू और बोल्ट में 1/4 का उपयोग करके स्क्वायर को माइक्रोमैनिपुलेटर से जोड़ने के लिए इस छेद का उपयोग करें।
    4. जांच तक पहुंचने वाले आवारा प्रकाश को कम करने के लिए प्लास्टिक स्क्वायर को काले विद्युत टेप के साथ कवर करें। इसी तरह, आवारा प्रकाश को कम करने के लिए डाले गए डिश (>10 मिमी) के नीचे फैले वर्ग के किनारों के चारों ओर एक स्कर्ट बनाने के लिए टेप का उपयोग करें (चित्रा 2 बी)।
    5. पेट्री डिश धारक को एक माइक्रोमैनिपुलेटर से जोड़ने के लिए एक बोल्ट और उपयुक्त हार्डवेयर का उपयोग करें जो नमूने की मोटाई से अधिक सीमा पर त्रि-आयामी समायोजन और अच्छी तरह से हल ऊर्ध्वाधर आंदोलन की अनुमति देता है ( सामग्री की तालिका में उल्लिखित मैनिपुलेटर का भाग 1 और भाग 2 अच्छे उदाहरण हैं)। इस माइक्रोमैनिपुलेटर को ऑप्टिकल ब्रेडबोर्ड से चिपकाएं।

3. ऊतक बायोप्सी के लिए माप सेटअप

  1. उस क्षेत्र के ऊपर एक प्रकाश स्रोत माउंट करें जहां माप होता है ताकि जब प्रकाश उस विमान तक पहुंचता है जहां नमूना रखा जाएगा (चित्रा 2 ए)। उदाहरण के लिए, 5 मिमी तरल प्रकाश गाइड (सामग्री की तालिका) में 5 सेमी कोलीमेटिंग लेंस (सामग्री की तालिका) संलग्न करें, और ऑप्टिकल ब्रेडबोर्ड (सामग्री की तालिका) से जुड़े वाइस और फ्रेम का उपयोग करके नमूने के ऊपर >0.6 मीटर तक ऊंचा करें। फिर, प्रकाश मार्गदर्शिका को ब्रॉडबैंड प्रकाश स्रोत से कनेक्ट करें, जैसे कि सामग्री तालिका में सूचीबद्ध प्लाज्मा प्रकाश स्रोत।
  2. प्रोब को एक लंबवत उन्मुख माउंट से संलग्न करें जैसे कि यह प्रकाश स्रोत की ओर इंगित करता है। एक ऑप्टिकल टेबल पोस्ट पर क्लैंप, नली क्लैंप या टेप के साथ जांच को सुरक्षित करें।
    नोट: विशाल क्लैम प्रयोग में, एक विशेष रूप से डिज़ाइन किए गए रॉड धारक, जैसे कि सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध माइक्रोमैनिपुलेटर का उपयोग किया जाता है। इस काम में, इसे मैग्नेट द्वारा ऑप्टिकल ब्रेडबोर्ड (सामग्री की तालिका) में सुरक्षित किया गया था। मैनिपुलेटर्स पर जांच और नमूना दोनों होने से प्राप्त संरेखण के लिए स्वतंत्रता की अतिरिक्त डिग्री सुविधाजनक है लेकिन आवश्यक नहीं है। सावधान रहें कि पोस्ट पर ओवर-क्लैंप न करें, क्योंकि इससे पिपेट आवास टूट सकता है।
  3. नमूना मैनिपुलेटर को लंबवत रूप से माउंटेड जांच के पास रखें। नमूना चरण की स्थिति को समायोजित करने के लिए नमूना मैनिपुलेटर का उपयोग करें जैसे कि जांच पेट्री डिश के निचले भाग में 0.5 सेमी खोलने में केंद्रित है। माउंटेड प्रोब की नोक को छूने या टक्कर देने से बचने के लिए अत्यधिक सावधानी बरतें।
    नोट: नमूना क्षेत्र पर स्थित एक बूम-माउंटेड स्टीरियोमाइक्रोस्कोप उपयोगी हो सकता है। इस तरह, एक प्रयोग शुरू करने से पहले जांच टिप, चरण और नमूने के शीर्ष-नीचे संरेखण को देखा जा सकता है (चित्रा 2 ए)।
  4. जांच के ऑप्टिकल फाइबर के एसएमए-समाप्त छोर को यूएसबी फाइबर-ऑप्टिक स्पेक्ट्रोमीटर (सामग्री की तालिका) से कनेक्ट करें, और स्पेक्ट्रोमीटर को यूएसबी केबल का उपयोग करके कंप्यूटर से कनेक्ट करें।

4. डेटा संग्रह

  1. प्रायोगिक सेटअप
    1. जांच और मैनिपुलेटर्स को सटीक संरेखित स्थिति में रखें जिसमें डेटा एकत्र किया जाएगा, जैसा कि चरण 3.4 में है।
    2. जांच के हिस्से में सिलिकॉन स्नेहक (सामग्री की तालिका) की एक छोटी मात्रा को सावधानीपूर्वक लागू करने के लिए कपास के फाहे या फाइन-गेज सुई का उपयोग करें जिसे जांच के किनारों और ऊतक के नमूने के बीच घर्षण को कम करने के लिए ऊतक में डाला जाएगा। प्रत्येक बेसलाइन या ऊतक माप से पहले सिलिकॉन स्नेहक को फिर से लागू करें।
    3. रिक्त नमूना पेट्री डिश में छेद को कवर करने वाले टेप को हटा दें, और इसे नमूना धारक (चरण 2.7) में रखें, यह सुनिश्चित करें कि यह घर्षण द्वारा सुरक्षित रूप से रखा गया है।
    4. जांच पर नमूना कम करने के लिए माइक्रोमैनिपुलेटर का उपयोग करें। पेट्री डिश के नीचे छेद के माध्यम से जिलेटिन में प्रवेश करने के लिए जांच की अनुमति दें। जिलेटिन परत के नीचे से जांच लगभग 5 मिमी होने तक जारी रखें।
    5. प्रकाश स्रोत चालू करें. स्पेक्ट्रोमीटर सॉफ्टवेयर का उपयोग करके, स्पेक्ट्रोमीटर एकीकरण समय को समायोजित करें जब तक कि सिग्नल जितना संभव हो उतना अधिक न हो। औसत स्कैन की संख्या दो और पांच के बीच सेट करें और स्मूथिंग पिक्सेल मान छह पर सेट करें। इस स्तर पर प्रयोग करने योग्य एकीकरण समय इस आधार रेखा के लिए 1-50 एमएस के बीच भिन्न हो सकता है।
  2. संदर्भ स्पेक्ट्रा एकत्र करना
    1. एक अंधेरा माप एकत्र करें।
      1. एक बार स्पेक्ट्रोमीटर पैरामीटर रिक्त नमूने के साथ सेट हो जाने के बाद, स्पेक्ट्रोमीटर से जांच फाइबर को अलग करें, और स्पेक्ट्रोमीटर के साथ आने वाले अपारदर्शी धातु कवर के साथ पोर्ट को कवर करें।
      2. स्पेक्ट्रोमीटर से एक अंधेरा माप प्राप्त करें (अक्सर जीयूआई में डार्क लाइटबल्ब आइकन का उपयोग करके) बिना इनपुट प्रकाश के स्पेक्ट्रोमीटर के शोर को चिह्नित करने के लिए। डेटा अधिग्रहण रणनीति के अनुसार इस माप को सहेजें।
    2. एक दीपक माप एकत्र करें। प्रोब फाइबर को स्पेक्ट्रोमीटर से फिर से कनेक्ट करें, सिग्नल को स्थिर करने की प्रतीक्षा करें, और एक और स्पेक्ट्रम प्राप्त करें। यह माप ऊतक की अनुपस्थिति में जिलेटिन के माध्यम से जांच तक पहुंचने वाले प्रकाश की विशेषता है।
  3. ऊतक स्पेक्ट्रा एकत्र करना।
    1. नमूना पेट्री डिश के नीचे टेप को हटा दें, और इसे नमूना धारक में रखें।
    2. तीन-आयामी हेरफेर का उपयोग करके जांच के साथ नमूना डिश को संरेखित करें ताकि ऊतक बायोप्सी जांच की नोक के ऊपर केंद्रित हो।
    3. जांच में सिलिकॉन जेल लागू करें (4.1.2 देखें), और धीरे-धीरे जांच पर नमूना कम करें जब तक कि जांच टिप ऊतक के नमूने का समर्थन करने वाले जिलेटिन से गुजर न जाए और अभी ऊतक के नमूने में प्रवेश न कर ले।
      नोट: कुछ स्पेक्ट्रोमीटर और कंप्यूटर प्रोग्राम पता लगाए गए प्रकाश की वास्तविक समय की निगरानी की अनुमति देते हैं। यह निर्धारित करने के लिए इसका उपयोग करें कि जांच ऊतक में कब प्रवेश करती है। जैसे ही जांच टिप ऊतक के सीधे संपर्क में होती है, स्पेक्ट्रम की तीव्रता अचानक कम हो जाएगी।
    4. सत्यापित करें कि एकीकरण समय माप के लिए उपयुक्त है, यह सुनिश्चित करके कि मापा स्पेक्ट्रम न तो बहुत शोर है और न ही संतृप्त है। यदि आवश्यक हो तो एकीकरण समय बदलें।
      1. किसी भी समय एकीकरण समय समायोजित हो जाता है, एक नया अंधेरा माप (चरण 4.2.1) निष्पादित और संग्रहीत करें। औसत स्कैन की संख्या या चिकना पिक्सेल की संख्या न बदलें।
      2. उपयुक्त माप पैरामीटर खोजने के बाद, माप लें और स्पेक्ट्रम को सहेजें।
    5. माइक्रोमैनिपुलेटर का उपयोग करके नमूने को एक निर्दिष्ट दूरी से नीचे ले जाएं। इस अध्ययन के लिए उपयोग किए जाने वाले मैनिपुलेटर के लिए, प्रत्येक छोटा टिक मार्क 0.001 इंच या 25.4 μm था। प्रत्येक माप के लिए नमूने को पांच टिक चिह्न, या 127 μm के माध्यम से नीचे ले जाया गया था। चरण 4.3.4 दोहराएँ।
    6. ऊतक के भीतर प्रत्येक ऊर्ध्वाधर स्थिति में स्पेक्ट्रा को सहेजना जारी रखें।
      नोट: यहां वर्णित प्रणाली के लिए, एक ऊतक नमूने के भीतर माप के लिए आवश्यक एकीकरण समय 1 एमएस से 5 सेकंड के बीच भिन्न होता है। आखिरकार, जांच टिप ऊतक के शीर्ष से बाहर निकल जाएगा और वहां दिखाई देगा (चित्रा 4 ए)। यह अंतिम माप है और ऊतक के शीर्ष पर प्रकाश की घटना की विशेषता है।
  4. डेटा लोड करना और संसाधित करना
    1. सभी एकत्रित स्पेक्ट्रा (डार्क स्पेक्ट्रा, लैंप स्पेक्ट्रा और ऊतक माप) को सीमांकित पाठ फ़ाइलों में परिवर्तित करने के लिए स्पेक्ट्रोमीटर के सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।
    2. Matlab या पसंद की कोडिंग भाषा का उपयोग करके, नमूने के लिए सभी माप फ़ाइलों को लोड करें। प्रत्येक ऊतक माप स्पेक्ट्रम के लिए, मिलान एकीकरण समय के साथ अंधेरे स्पेक्ट्रम को घटाएं, और फिर इसे एकीकरण समय से विभाजित करें।
      नोट: इस अध्ययन में, डेटा लोड करने और संसाधित करने के लिए एक मैटलैब स्क्रिप्ट का उपयोग किया गया था (पूरक फ़ाइल 1)।
    3. खाली जिलेटिन में प्राप्त बेसलाइन स्पेक्ट्रम द्वारा ऊतक के अंदर जांच के साथ प्राप्त स्पेक्ट्रा को विभाजित करके ऊतक में प्रत्येक स्थिति तक पहुंचने वाले घटना प्रकाश के प्रतिशत की गणना करें।
      नोट: ऊतक के शीर्ष पर माप (चरण 4.3.6) जिलेटिन (चरण 4.1) में बेसलाइन माप के समान होना चाहिए और, विभाजित होने पर, 100% के करीब होना चाहिए। प्रयोगात्मक संदर्भ के आधार पर, या तो लैंप स्पेक्ट्रम (खाली जिलेटिन से स्पेक्ट्रम या ऊतक के शीर्ष से) को संदर्भ के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। हालांकि, प्रयोग शुरू करने से पहले एक लैंप स्पेक्ट्रम एकत्र करना अभी भी महत्वपूर्ण है। ऐसा इसलिए है, क्योंकि यदि जांच टूट जाती है या प्रयोग अन्यथा ऊतक के शीर्ष तक पहुंचने से पहले विफल हो जाता है, तो विफलता से पहले प्राप्त डेटा अभी भी उपयोग करने योग्य हैं, जो कि ऐसा नहीं है यदि कोई प्रारंभिक दीपक संदर्भ स्पेक्ट्रम नहीं है।
    4. डेटा को विज़ुअलाइज़ करें; समोच्च भूखंड सहायक हो सकते हैं (चित्रा 4 बी)।

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Representative Results

यह प्रोटोकॉल एक माइक्रो-ऑप्टिकल जांच के निर्माण की प्रक्रिया का वर्णन करता है जिसका उपयोग डाउनवेलिंग विकिरण (एक दिशा से एक बिंदु तक पहुंचने वाला प्रकाश) को मापने के लिए किया जा सकता है या, एक प्रकाश-प्रकीर्णन गोलाकार नोक के अतिरिक्त, स्केलर विकिरण (सभी दिशाओं से एक बिंदु तक पहुंचने वाला प्रकाश) को मापने के लिए। ये जांच जीवित ऊतक के अंदर एकल कोशिकाओं की लंबाई के पैमाने तक पहुंचने वाले स्थानिक संकल्पों पर विकिरण को माप सकती हैं। यह प्रोटोकॉल वर्णित जांच और डेटा देखने और विश्लेषण के लिए एक प्रतिनिधि विधि का उपयोग करके विकिरण माप के लिए एक ऊतक नमूना तैयार करने के लिए एक प्रतिनिधि विधि का भी वर्णन करता है।

चित्र 1 माइक्रो-प्रोब उत्पादन के आउटपुट को दर्शाता है। जब खींचा जाता है, तो ऑप्टिकल फाइबर को लगभग 3 सेमी तक पतला होना चाहिए और टेपर के साथ कोई खरोंच नहीं होनी चाहिए। यह अंत में भी सपाट होना चाहिए और इसका व्यास 15-30 μm (चित्रा 1 डी) होना चाहिए। टिप की सपाटता को कार्बोरंडम पेपर के साथ अंत को रेत कर या स्कोरिंग और फिर से तोड़कर सुधार किया जा सकता है। इसी तरह, फाइबर के आवास के रूप में उपयोग किए जाने वाले खींचे गए ग्लास पिपेट में कोई तेज या टूटा हुआ किनारे नहीं होना चाहिए। जब प्रकीर्णन गेंद फाइबर के सपाट, कट टिप के अंत में बनती है, तो यह गोलाकार होना चाहिए (चित्रा 1 सी)। इलाज करने से पहले, गेंद को मूल चिपकने वाली बूंद में डालने और फाइबर को जल्दी से बाहर खींचने के एक और दौर से मिसशेपन को हटाया जा सकता है। आंदोलन की तेज गति फाइबर के अंत से गोंद की गेंद को खींच लेगी। धीमी गति से फाइबर पर अतिरिक्त चिपकने वाला निर्माण होता है। एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्रक्रिया को देखना, जबकि फाइबर एक प्रकाश स्रोत से जुड़ा होता है, काम की कल्पना करने और यह निर्धारित करने के लिए सहायक होता है कि प्रक्रिया काम कर रही है या नहीं। प्रकीर्णन चिपकने वाला लगाने से पहले गोंद और विद्युत टेप के साथ ग्लास पिपेट के अंदर फाइबर को सुरक्षित करना महत्वपूर्ण है; अन्यथा, फाइबर टूट सकता है, या चिपकने वाला शिफ्टिंग फाइबर के साथ धब्बा लगा सकता है (चित्रा 1)।

चित्र 2 माप उपकरण को दर्शाता है। इस उदाहरण में, ऊतक नमूना और जांच दोनों के धारकों में तीन आयामों में समायोजन क्षमताएं हैं (चित्रा 2)। नमूना और जांच दोनों को मैनिपुलेटर्स से जोड़ना संरेखण में मदद करता है लेकिन आवश्यक नहीं है; जांच को एक स्थिर पोस्ट से जोड़ा जा सकता है। मैनिपुलेटर्स के सबसे हल किए गए आंदोलनों को ऊर्ध्वाधर, जेड-दिशा में उन्मुख किया जाना चाहिए ताकि ऊतक में स्थिति और / या जांच की मात्रा को सटीक रूप से निर्धारित किया जा सके (चित्रा 2 ए)। एक बूम-माउंटेड स्टीरियोमाइक्रोस्कोप उपयोगी हो सकता है जब इसे इस तरह रखा जाता है कि कोई मंच, डिश और नमूने के साथ जांच के संरेखण की जांच करने के लिए आईपीस के माध्यम से मंच, जांच और नमूना देख सकता है (चित्रा 2 बी)। जांच पर नमूना को कम करते समय वास्तविक समय में स्पेक्ट्रा देखना सहायक होता है क्योंकि यदि जांच द्वारा मापा गया स्पेक्ट्रम अचानक बदल जाता है, तो इससे पता चलता है कि नमूना सफलतापूर्वक अत्यधिक प्रकीर्णन या अवशोषित ऊतक के अंदर स्थित है या जांच झुक रही है या टूट रही है। स्पेक्ट्रम के आकार और तीव्रता में अचानक बदलाव सबसे अधिक ऊतक प्रवेश का संकेत देते हैं, जबकि आकार में बदलाव के बिना अचानक तीव्रता में परिवर्तन से पता चलता है कि जांच झुक रही है या टूट रही है। क्लैम ऊतक के शीर्ष पर, एक पतली स्पष्ट झिल्ली होती है जिसे जांच बिना तोड़े प्रवेश नहीं कर सकती है। इस तरह के मामले में, ऊतक के शीर्ष की निगरानी यह देखने के लिए की जानी चाहिए कि जांच कब बाहर निकलने वाली है, और माप को उस बिंदु पर रोक दिया जाना चाहिए ताकि जांच टूट न जाए।

चित्रा 3 जिलेटिन के पेट्री डिश में एम्बेडेड ऊतक बायोप्सी नमूना दिखाता है, जैसा कि खंड 2 में वर्णित है। नीचे से ऊतक में ऑप्टिकल जांच के सम्मिलन की अनुमति देने के लिए पेट्री डिश के तल में एक छेद है। बायोप्सी व्यास में 8 मिमी है और पेट्री डिश (चित्रा 3 ए) में छेद पर केंद्रित है। ऊतक के नमूने के नीचे जिलेटिन की एक छोटी मात्रा होती है, और जिलेटिन ऊतक के ऊपर पकवान के शीर्ष पर भरा होता है (चित्रा 3 बी)।

चित्रा 4 ए जांच को दिखाता है क्योंकि यह ऊतक के शीर्ष से बाहर निकलना शुरू कर देता है, और चित्रा 4 बी प्रतिनिधि डेटा दिखाता है। चित्रा 4 बी में निशान उत्पन्न करने के लिए एक मैटलैब स्क्रिप्ट (पूरक फ़ाइल 2) का उपयोग किया गया था। एक्स-अक्ष तरंग दैर्ध्य है, और वाई-अक्ष बेसलाइन स्पेक्ट्रम के सापेक्ष ऊतक गहराई पर प्रकाश का प्रतिशत है। ऊतक की गहराई के लिए व्यक्तिगत माप ग्रे स्केल रंग वाली रेखाओं द्वारा इंगित किए जाते हैं। ऊतक में गहराई से लिए गए माप को एक गहरे रंग की रेखा द्वारा दर्शाया जाता है। बेसलाइन स्पेक्ट्रम जिलेटिन-केवल नमूने में माप है और इसका उपयोग दीपक और दीपक के लिए जांच की प्रतिक्रिया को चिह्नित करने के लिए किया जाता है। जिलेटिन में मामूली अवशोषण और प्रकीर्णन होता है, जिसका अर्थ है कि तरंग दैर्ध्य के खिलाफ जिलेटिन अवशोषण के लिए संकेत पूरी तरह से सपाट नहीं है। इसलिए, पूरे ऊतक में लिए गए स्पेक्ट्रा को या तो जिलेटिन में जांच के स्पेक्ट्रम द्वारा या ऊतक के शीर्ष पर जांच के स्पेक्ट्रम द्वारा विभाजित किया जाता है ताकि चित्रा 4 बी में दिखाए गए वर्णक्रमीय डेटा केवल ऊतक के नमूने के लिए प्रकाश के प्रतिशत का प्रतिनिधित्व करते हैं और इस प्रकार, प्रकाश स्रोत से स्वतंत्र होते हैं, जिलेटिन, और प्रत्येक व्यक्तिगत जांच की बारीकियां।

Figure 1
चित्रा 1: माइक्रो-ऑप्टिकल इंट्रा-टिशू रेडियोमेट्री जांच के निर्माण के चरण । (ए) ऑप्टिकल जांच का एक योजनाबद्ध। (बी) तैयार ऑप्टिकल जांच का एक दृश्य। (सी) ग्लास पाइप समर्थन के अंदर खींचे गए ऑप्टिकल फाइबर से जुड़े प्रकीर्णन क्षेत्र का एक क्लोज-अप। (डी) खींचा और साफ ऑप्टिकल फाइबर। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: ऊतक के अंदर स्केलर विकिरण को मापने के लिए प्रयोगात्मक सेटअप की छवियां और आरेख । (ए) प्रयोगात्मक सेटअप की एक समग्र योजनाबद्ध और छवि। (बी) नमूना पेट्री डिश धारक का एक क्लोज-अप। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: क्लैम ऊतक बायोप्सी । (ए) क्लैम ऊतक की बायोप्सी के शीर्ष और (बी) साइड व्यू जिलेटिन से भरे परिवर्तित पेट्री डिश में मापने के लिए तैयार हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: प्रतिनिधि डेटा । (ए) माइक्रोस्कोप छवि कि ऊतक के माध्यम से आने पर जांच कैसी दिखती है। (बी) इंट्रा-टिशू रेडियोमेट्री जांच के साथ प्राप्त प्रतिनिधि डेटा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 1: डेटा लोड करने और संसाधित करने के लिए उपयोग की जाने वाली मैटलैब स्क्रिप्ट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक फ़ाइल 2: चित्रा 4 बी में निशान उत्पन्न करने के लिए उपयोग की जाने वाली मैटलैब स्क्रिप्ट। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

यह प्रोटोकॉल एकल कोशिकाओं के पैमाने पर लगभग एक स्थानिक संकल्प के साथ जीवित ऊतक की एक बड़ी मात्रा के माध्यम से ऑप्टिकल वातावरण को व्यवस्थित रूप से चिह्नित करने के लिए एक तकनीक का वर्णन करता है। यह सस्ती, लचीली, और क्षेत्र-साध्य विधि जीवित प्रणालियों के भीतर प्रकाश के प्रसार का अध्ययन करने वाले किसी भी शोधकर्ता के लिए उपयोगी हो सकती है। अनुभव से, मौजूदा तरीकों7 की तुलना में, इन जांचों को बनाने के लिए थोड़ा अधिक अभ्यास और कौशल की आवश्यकता होती है, लेकिन परिणामस्वरूप कम ऊतक क्षति होती है और घने ऊतक की बड़ी मात्रा को अधिक व्यापक रूप से चिह्नित करने की क्षमता होती है।

इस विधि में चार भाग शामिल हैं। पहला भाग, जांच का निर्माण, पिछले डिवाइस डिजाइन10,11 से प्रेरित था। वर्तमान दृष्टिकोण मोटे ऊतक की संपूर्णता के व्यवस्थित, कम विनाशकारी स्कैन के लिए विकसित किया गया था, क्योंकि खींची गई कांच की सुई कोशिकाओं के बीच धीरे से स्लाइड कर सकती है। यह एक क्षेत्र प्रयोगशाला12,13,14 में उपयोग के लिए भी उपयुक्त है। इस प्रोटोकॉल के परिणामस्वरूप डाउनवेलिंग चमक को मापने के लिए ~ 20 μm व्यास युक्तियों के साथ जांच होती है और स्केलर विकिरण को मापने के लिए एक वैकल्पिक 50-100 μm व्यास प्रकीर्णन क्षेत्र होता है। उपयोग की जाने वाली सामग्रियों को संशोधित करके बड़े या छोटे स्केलर विकिरण गोले विकसित किए जा सकते हैं, उदाहरण के लिए, एक अलग प्रारंभिक चिपचिपाहट के साथ एक यूवी-इलाज योग्य चिपकने वाला। पिपेट खींचने और फाइबर प्रक्रिया दोनों में वजन को कम या ज्यादा कम करने के परिणामस्वरूप समायोजित किया जा सकता है। खींचने की प्रक्रिया और परिणामस्वरूप टेपर को समायोजित करने के लिए मशाल की लौ से दूरी के माध्यम से हीटिंग दर को भी संशोधित किया जा सकता है।

जांच निर्माण तकनीक को सही करने के लिए कुछ मैनुअल कौशल और परीक्षण और त्रुटि की आवश्यकता होती है लेकिन अभ्यास के साथ विश्वसनीय और त्वरित हो सकता है। यहां, समय के साथ विकसित कुछ समस्या निवारण बारीकियों को प्रस्तुत किया गया है। जैकेट वाले छोर से ऑप्टिकल फाइबर को नीचे खींचने से अधिक सुसंगत टेपर्स होते हैं। गोलाकार प्रकीर्णन टिप को जोड़ने से पहले ओपेक्विंग पेन को लागू करना महत्वपूर्ण है, क्योंकि अपारदर्शी स्याही के गीला करने वाले गुण फाइबर टिप पर चिपकने वाली एक सुव्यवस्थित गेंद के गठन को अनुकूल रूप से प्रभावित करते हैं। यदि परिणामी चिपकने वाली गेंद गलत आकार की है, तो इसे खींचना और फिर से प्रयास करना संभव है। ऐसा करने के लिए, माइक्रोमैनिपुलेटर का उपयोग पूरी गेंद को चिपकने वाले जलाशय में स्लाइड करने के लिए किया जा सकता है और फिर बहुत धीरे-धीरे वापस ले लिया जा सकता है। यह आमतौर पर पहले, गलत आकार के प्रयास को खींचता है, इसे चिपकने वाले जलाशय में छोड़ देता है और फिर से कोशिश करना संभव बनाता है।

देखभाल के साथ इलाज किया जाता है, इन जांचों का उपयोग विभिन्न नमूनों के लिए बार-बार किया जा सकता है। सबसे बड़ा खतरा गलती से किसी चीज को हिलाते समय जांच टिप को खटखटाना है। माप के बीच, उन्हें आइसोप्रोपिल अल्कोहल और संपीड़ित हवा का उपयोग करके सेलुलर मलबे से साफ किया जाना चाहिए। जांच को हफ्तों तक भी संग्रहीत किया जा सकता है जब तक कि जांच टिप कुछ भी नहीं छू रही है और फाइबर ऑप्टिक असेंबली पर कोई बल नहीं है जो कांच की आस्तीन के अंदर जांच को पकड़ने वाले टेप और गोंद को अलग कर सकता है। यह फाइबर और ग्लास पिपेट को कई स्थानों पर एक उच्च शेल्फ के किनारे पर दबाकर पूरा किया जा सकता है।

इस विधि के दूसरे और तीसरे भाग में प्रयोग के मेकानो-ऑप्टिकल पहलुओं और माप के लिए ऊतक को सुरक्षित करना शामिल है। विधि का यह हिस्सा विशेष रूप से विशाल क्लैम ऊतक12 के अंदर इंट्रा-ऊतक स्केलर विकिरण को मापने के लिए विकसित किया गया था। यहां, विधि के इन पहलुओं के समस्या निवारण के लिए विवरण प्रस्तुत किए गए हैं। सबसे पहले, बायोप्सी जांच के सापेक्ष बड़ी होनी चाहिए। यह जांच को ऊतक को स्थानांतरित करने से रोकता है क्योंकि यह पारगमन करता है। इसके अतिरिक्त, ऊतक को पेट्री डिश के तल पर बैठना चाहिए ताकि जिलेटिन की लोच और वजन माप के दौरान ऊतक को जगह में रखने के लिए गठबंधन करें। यह भी महत्वपूर्ण है कि प्रयोगात्मक प्रकाश स्रोत के तहत जिलेटिन को लोचदार, ठोस अवस्था में बनाए रखने के लिए कमरा पर्याप्त ठंडा हो। इसी तरह, यह दृश्य प्रकाश के सापेक्ष तुलनात्मक रूप से कम गर्मी उत्पादन के साथ एक एलईडी या अन्य स्रोत का उपयोग करने में मदद करता है।

विधि के ज्यामितीय और ऑप्टोमैकेनिकल पैरामीटर बहुत लचीले हैं। उदाहरण के लिए, स्केलर विकिरण जांच का उपयोग एक बरकरार माउस के मस्तिष्क और वसा ऊतक13,14 के अंदर विकिरण को मापने के लिए किया गया था। ऐसा करने के लिए, जांच को एक मानक कृंतक स्टीरियोटैक्टिक फ्रेम पर मैनिपुलेटर्स पर लगाया गया था, और प्रकाश स्रोत को माउस के रोस्ट्रम की ओर इशारा करते हुए लगाया गया था। किसी भी ज्यामिति में, इस विधि के सफल उपयोग की कुंजी हमेशा किसी भी माप की शुरुआत में उचित दीपक और अंधेरे संदर्भ स्पेक्ट्रा एकत्र करना है। यदि ऊतक माप के दौरान एक जांच टूट जाती है और ऊतक के बिना कोई प्रारंभिक लक्षण वर्णन नहीं होता है, तो डेटा की व्याख्या करना मुश्किल या असंभव होगा, और एक नई जांच के साथ शुरू करना आवश्यक होगा। इसके विपरीत, शुरुआत में उचित संदर्भों के साथ, आंशिक माप उपयोग करने योग्य डेटा हैं।

इस विधि का अंतिम भाग डेटा अधिग्रहण से संबंधित है। जांच से संकेतों की निगरानी के लिए एक फाइबर-ऑप्टिक स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग वर्णित है, जो एसएमए युग्मन की आसानी सुनिश्चित करता है और पूरी तरह से वर्णक्रमीय तरंग दैर्ध्य जानकारी प्रदान करता है। हालांकि, कम फोटॉन फ्लक्स वाले सिस्टम के लिए, इन प्रोब्स को फोटोमल्टीप्लायर ट्यूब या हिमस्खलन फोटोडायोड से जोड़ना भी संभव है। किसी भी मामले में, सभी डिटेक्टरों को प्रत्येक नए माप के लिए संदर्भ माप की आवश्यकता होती है। इसलिए, वर्णित डेटा संग्रह विधियों में केवल मामूली समायोजन के साथ, सभी विभिन्न प्रकार के ऑप्टिकल मापदंडों की विशेषता हो सकती है।

इस विधि के भविष्य के दिलचस्प उपयोग बड़े स्तनधारियों के शरीर के भीतर और जटिल विकिरण हस्तांतरण गुणों वाले पौधों के भीतर प्रकाश की मात्रा का ठहराव हो सकते हैं, जैसे कि रसीला।

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Disclosures

हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

जोर्गेनसन के सहयोगियों और उनके काम से हमें परिचित कराने के लिए लेखक सनाज़ वाहिदिनिया को धन्यवाद देते हैं। इस शोध को सेना अनुसंधान कार्यालय (संख्या W911NF-10-0139), नौसेना अनुसंधान कार्यालय (MURI पुरस्कार संख्या N00014-09-1-1053 के माध्यम से), और NSF-INSPIRE पुरस्कार NSF-1343158 से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1" travel ball bearing center+D11+A2:D31+A2:A2:D31 Edmond Optics 37-935 Part 2 of manipulator for lowering sample
1/4" thick acrylic sheet McMaster-Carr 8505K754 For making Petri dish holder
3/4" mini spring clamp Anvil 99693 Use as weight for pulling optical fiber
8 mm biopsy punch Fisher Scientific NC9324386 For tissue sample
Butane Torch McMaster-Carr MT-51 Heat source for pulling fiber and pipette
Collimating lens Thorlabs LLG5A1-A To collimate light source through liquid light guide
Compressed air McMaster-Carr 7437K35 For drying pulled fiber and pipette
Cyanoacrylate glue - liquid McMaster-Carr 66635A31 For securing tapered fiber end at top of pulled pipette
Electrical tape McMaster-Carr 76455A21 For securing fiber in pipette and for adding grip to clamps
Fine grade carborundum paper McMaster-Carr 4649A24 Small triangle on exacto knife holder works well
Gelatin Knox 10043000048679 For securing the tissue biopsy in the petri dish
Glass Pasteur Pipete Fisher Scientific 13-678-20B Disposable glass pipette 5.75" in length
Insulin syringes, 31G needle BD 320440 For applying glue
Isopropanol McMaster-Carr 54845T42 For cleaning pulled fiber and pipette
Kimwipe Cole-Parmer SKU 33670-04 For wiping optical fiber and glass pipette clean
LED driver Thorlabs LEDD1B For powering the UV LEDs
Light source for measurements Cole-Parmer UX-78905-05 Low heat white light source for measurements
Linear metric X-Y-Z axis rack and pinion stage Edmond Optics 55-023 Part 1 of manipulator for lowering sample
Liquid light guide Thorlabs LLG5-4T For light source in measurements
Magnetic feet Siskiyou MGB 8-32 For use with magnetic strips
Magnetic strips Siskiyou MS-6.0 For mounting magnetically to breadboard
Manipulator #1 Siskiyou MX10R 4-axis manipulator with pipette holder
Opaquer pen, small WindowTint TOP01 For opaquing side of optical fiber to prevent stray light from enter probe
Optical breadboard Edmond Optics 03-640 For stable affixation of probe holder, sample, microscope and light source
Optical fibers Ocean Optics P-100-2-UV-VIS About 4 fibers are good to have
Plasma light source Thorlabs HPLS345 For tissue radiometry measurements
Plastic plier clamp McMaster-Carr 5070A11 Plier clamp used for weight in pulling pipette
Polystyrene Petri dishes Thomas scientific 3488N10 Sample holders, enough volume to hold sample thickness plus ~10 mm of gelatin on top
Razor blades McMaster-Carr 3962A3 For stripping jacketing from optical fiber
Silicone oil lubricant Thomas scientific 1232E30 For reducing friction between probe and tissue
Software for analyzing data Matlab Chosen software for data analysis
Spectrometer + spectrometer software Avantes AvaSpec-2048L Spectrometer can be any brand, this one is compatible with sma-terminated optical fibers and comes with its own software for running the spectrometer
Titanium dioxide powder Sigma Aldrich 718467-100G For making scattering sphere
Toolour tabletop clip Toolour Toolour0004 For holding pipette while pulling and for holding finished probes
Trigger-action bar clamps mcMaster-Carr 51755A2 Good for holding optical fibers while pulling or curing
UV curable adhesive Delo Photobond GB368 For making scattering sphere
UV light source Thorlabs M365FP1 Light source for curing adhesive in scattering ball, this one is sma-fiber compatible, higher intensity = less cure time
White LED light source Thorlabs MCWHF2 For characterizing pulled fiber and scattering sphere

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References

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बायोइंजीनियरिंग अंक 196
जीवित ऊतक में <em>सीटू में</em> चमक को मापने के लिए एक इंट्रा-टिशू रेडियोमेट्री माइक्रोप्रोब
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Holt, A. L., Gagnon, Y. L., Sweeney, A. M. An Intra-Tissue Radiometry Microprobe for Measuring Radiance In Situ in Living Tissue. J. Vis. Exp. (196), e64595, doi:10.3791/64595 (2023).

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