Microssonda de Radiometria Intratecidual para Medição de Radiância In Situ em Tecido Vivo

Summary

Neste trabalho, um método para medir a radiância in situ em tecidos vivos é descrito. Este trabalho inclui detalhes da construção de sondas em microescala para diferentes medidas de radiância e irradiância, fornece orientação para a montagem de tecidos para a caracterização da radiância e delineia métodos computacionais para análise dos dados resultantes.

Abstract

Os organismos parecem opacos em grande parte porque suas camadas externas de tecido estão fortemente espalhadas para a luz incidente; Pigmentos fortemente absorventes, como o sangue, normalmente têm absorbâncias estreitas, de modo que o caminho livre médio da luz fora dos picos de absorbância pode ser bastante longo. Como as pessoas não conseguem ver através do tecido, geralmente imaginam que tecidos como cérebro, gordura e osso contêm pouca ou nenhuma luz. No entanto, proteínas opsina fotorresponsivas são expressas em muitos desses tecidos, e suas funções são pouco compreendidas. A radiância interna ao tecido também é importante para a compreensão da fotossíntese. Por exemplo, os moluscos gigantes são fortemente absorventes, mas mantêm uma densa população de algas nas profundezas do tecido. A propagação da luz através de sistemas como sedimentos e biofilmes pode ser complexa, e essas comunidades podem ser grandes contribuintes para a produtividade do ecossistema. Portanto, um método para a construção de microssondas ópticas para medir a irradiância escalar (fluxo de fótons cruzando um ponto) e a irradiância descendente (fluxo de fótons cruzando um plano perpendicularmente) para melhor entender esses fenômenos dentro do tecido vivo foi desenvolvido. Esta técnica também é tratável em laboratórios de campo. Essas microssondas são feitas de fibras ópticas puxadas pelo calor que são então fixadas em pipetas de vidro puxadas. Para alterar a aceitação angular da sonda, uma esfera de 10-100 μm de epóxi curável por UV misturada com dióxido de titânio é então fixada na extremidade de uma fibra puxada e aparada. A sonda é inserida em tecido vivo, e sua posição é controlada usando um micromanipulador. Essas sondas são capazes de medir a radiância do tecido in situ em resoluções espaciais de 10-100 μm ou na escala de células únicas. Essas sondas foram usadas para caracterizar a luz que atinge as células adiposas e cerebrais 4 mm abaixo da pele de um camundongo vivo e para caracterizar a luz que atinge profundidades semelhantes dentro do tecido vivo de moluscos gigantes ricos em algas.

Introduction

Surpreendentemente, animais terrestres e habitantes rasos do oceano têm luz suficiente dentro de seu corpo para fisiologia visual e até fotossíntese. Por exemplo, os níveis de luz no centro da cabeça de um rato (fora das bandas de forte absorvância da hemoglobina) são atenuados por três ou quatro ordens de magnitude em relação ao mundo exterior. Esta é aproximadamente a diferença entre os níveis de luz dentro e fora de casa. Assim, a opacidade de um tecido ou material devido à forte dispersão não é o mesmo que opacidade devido à forte absorção de luz. A luz pode continuar se propagando por longas distâncias em um sistema fortemente espalhador, semelhante à luz que se propaga através de sistemas aquáticos com altas concentrações de células e partículas¹. Esta observação é particularmente saliente à luz do fato de que as proteínas opsina são quase onipresentes expressas em todos os tecidos de todos os animais. Assim, é importante entender como e onde a luz é atenuada e espalhada dentro do tecido vivo. No entanto, ao contrário dos sistemas aquáticos, com tecido vivo, é impossível imergir um instrumento na coluna d'água e obter medidas de radiância e irradiância, sendo necessária uma nova técnica.

Outros métodos previamente utilizados para caracterizar as propriedades de absorção e espalhamento de tecidos vivos incluem a mensuração de sondas de reflectância tecidual e/ou esferas integradoras^2,3, métodos microscópicos como a microscopia confocal de varredura^4, a medição da difusão da luz laser na superfície⁵ e técnicas de modelagem como a transferência radiativa Monte Carlo⁶. Os métodos experimentais mencionados frequentemente requerem equipamentos específicos, grandes e caros ou conhecimento detalhado sobre a estrutura do tecido e geralmente são limitados em sua capacidade de caracterizar a estrutura espacial da luz no interior do tecido.

Existem também métodos similares baseados em sonda que utilizam uma agulha hipodérmica para inserir uma fibra óptica através do tecido ^7,8,9. Em nossa experiência, agulhas modificadas são eficazes em puncionar tecidos, mas requerem força considerável e geralmente rasgam tecidos delicados ao passar através de células densamente embaladas. Portanto, essas agulhas geralmente requerem um procedimento cirúrgico para inserir mais de um milímetro ou mais em uma camada de tecido. O método aqui descrito, utilizando um suporte de vidro lubrificado e puxado, é capaz de deslizar entre as células com mínima lesão do tecido e sem cirurgia adicional.

Este manuscrito apresenta um método inspirado no trabalho de Jorgenson e colaboradores sobre a medição de luz dentro de esteiras algais^10,11, usando microssondas ópticas suportadas em vidro e eletrônica portátil que são passíveis de sondagem profunda em tecido denso e de construção e uso no campo. Essas sondas podem ser construídas para caracterizar a irradiância escalar (luz atingindo um ponto de todas as direções) e a radiância descendente (luz que cruza um plano horizontal) dentro do tecido vivo em altas resoluções espaciais. Essas sondas foram originalmente desenvolvidas para medir a transferência radiativa dentro do tecido de moluscos gigantes fotossimbióticos¹². Medidas padronizadas de absorção e transmissão do tecido total não foram suficientes para caracterizar o desempenho fotossintético do tecido, pois faz uma grande diferença se toda a luz incidente é absorvida por poucas células experimentando alta intensidade na superfície do tecido ou muitas células experimentando baixas intensidades em todo o volume do tecido. Em um segundo projeto, essas sondas foram utilizadas para medir a irradiância in vivo dentro do cérebro de camundongos^13,14, caracterizando assim o ambiente luminoso de opsinas expressas profundamente no interior do cérebro. Essas microssondas são pequenas e sensíveis o suficiente para medir a irradiância dentro do tecido cerebral de camundongos com toda a pele, pele e osso intactos e demonstrar que os níveis fisiológicos de luz são facilmente altos o suficiente para estimular as opsinas cerebrais profundas.

Esta sonda micro-óptica e configuração de medição poderia ser útil para pesquisadores que precisam quantificar e caracterizar a luz interna ao tecido biológico, particularmente para uma compreensão mais matizada da fotossíntese ou das funções dos pigmentos visuais expressos fora dos olhos. Este método pode ser usado sozinho ou em conjunto com outras técnicas para caracterizar completamente as propriedades ópticas e a propagação da luz dentro de tecidos vivos a um baixo custo, com pequenos equipamentos portáteis construídos internamente e com parâmetros ajustáveis dependentes da tarefa.

Protocol

Este estudo está em conformidade com todos os regulamentos éticos relevantes da Universidade de Yale em relação à pesquisa com animais vertebrados e invertebrados.

1. Construção da micro-sonda óptica

1. Construção da manga de vidro, material: pipeta Pasteur, 5,75 pol (ver Tabela de Materiais)
   1. Usando um clipe de jacaré montável (Tabela de Materiais), monte a pipeta de vidro pela extremidade larga de modo que a extremidade cônica esteja voltada para baixo em direção ao chão e a orientação da pipeta seja perpendicular ao chão.
   2. Pendure um punho de plástico de 50 g (Tabela de Materiais) na extremidade cônica da pipeta. Coloque uma almofada de fita eléctrica entre a pipeta e o punho do vício para ajudar a evitar derrapagens.
   3. Aqueça a extremidade cônica da pipeta usando uma pequena tocha de butano (Tabela de Materiais). Aplique a chama 1 cm acima do punho do vício. Segure a tocha de tal forma que a parte mais brilhante da chama esteja a 3 cm do vidro e o vidro esteja na ponta da chama. Quando o comprimento da pipeta tiver aumentado em cerca de 5 pol, remova imediatamente a chama.
   4. Utilize uma tesoura pequena ou um cortador de vidro para aparar a extremidade puxada da pipeta no ponto em que o novo diâmetro puxado é aproximadamente o dobro do da fibra óptica utilizada na secção seguinte (ver passo 1.2). Arquive todas as áreas pontiagudas da extremidade aparada usando papel carborundum (Tabela de Materiais). Enxágue quaisquer cacos de vidro pequenos resultantes ou poeira usando um frasco de álcool isopropílico seguido de ar comprimido.
2. Puxando a fibra óptica (Figura 1D)
   1. Use uma lâmina de barbear para cortar a fibra óptica, removendo um conector SMA de uma fibra óptica terminada em SMA de 200 μm de diâmetro (Tabela de Materiais). Corte perto de uma das terminações SMA. Em seguida, use a lâmina de barbear para remover os próximos 5 cm de revestimento de plástico e fibra de vidro para que a fibra óptica nua fique exposta e se projete do resto do conjunto intacto.
   2. Use a tocha de butano para queimar o revestimento de polímero de poliimida da fibra de vidro. Enxágue com isopropanol. Limpe a fibra de vidro nua usando um lenço sem fiapos.
   3. O próximo passo é montar a fibra nua para que ela também possa ser puxada com uma chama. Monte a extremidade nua da fibra óptica diretamente em um alicate (Tabela de Materiais) em uma borda de mesa ou prateleira, deixando a extremidade da fibra terminada em SMA pender em direção ao chão. Adicione os pesos para puxar na forma de duas pequenas braçadeiras (peso total: 10 g) na extremidade encamisada da fibra cerca de 12 polegadas para baixo de onde a fibra óptica nua é mantida na braçadeira do alicate.
   4. Para puxar a fibra, comece com a chama da tocha de butano acesa. Com a chama acesa, segure a tocha de butano a 1 cm da fibra nua para que a chama fique perpendicular à fibra óptica e 3 cm para baixo verticalmente de onde a braçadeira do alicate segura a fibra nua. Deixe a fibra esticar, puxar, separar e cair no chão.
   5. Examine a extremidade da fibra óptica puxada resultante. Lixe suavemente quaisquer irregularidades com papel carborundum, limpe com álcool isopropílico e um lenço sem fiapos e seque com ar comprimido.
      NOTA: Neste ponto, pode-se usar um microscópio para caracterizar e documentar o tamanho e a forma da fibra puxada.
   6. Use uma caneta para escurecer as laterais da fibra e evitar a entrada de luz dispersa (Tabela de Materiais). Puxe suavemente a fibra pela ponta da caneta, deixando apenas uma pequena área na ponta descoberta.
3. Montagem da fibra puxada dentro da capa da pipeta de vidro (Figura 1A)
   1. Trabalhando sob um estereomicroscópio, insira cuidadosamente a fibra óptica cônica da etapa 1.2 na extremidade larga da pipeta de vidro alterada a partir da etapa 1.1 e empurre a fibra até que ~1 mm de fibra nua esteja saindo da extremidade cônica da pipeta.
   2. Usando fita elétrica, prenda a extremidade encamisada da fibra óptica à extremidade larga da pipeta.
   3. Coloque uma gota de adesivo de cianoacrilato em uma agulha de bitola pequena (Tabela de Materiais). Toque cuidadosamente a gota de adesivo na borda cortada da pipeta puxada, evitando a extremidade nua da fibra puxada.
   4. Permitir a ação capilar para prender o adesivo na pipeta, molhando a área entre a parede da pipeta e a fibra óptica. Deixe o adesivo curar por pelo menos 15 minutos antes de mover o conjunto da sonda.
4. Modificação da ponta da fibra com uma esfera de espalhamento (Figura 1C)
   1. Crie a matéria-prima para a ponta da esfera de espalhamento misturando uma gota de adesivo curável por UV com pó de dióxido de titânio (Tabela de Materiais) a ~1:1 v/v.
   2. Conecte a sonda a um micromanipulador com um suporte de haste de montagem (Tabela de Materiais) de modo que a sonda esteja em uma orientação horizontal. Preparar um reservatório de trabalho do material de espalhamento mergulhando a ponta de um fio ou agulha na mistura de adesivo/TiO₂ preparada acima, de modo que uma gota de adesivo se forme. Monte o fio ou agulha com a gota perto da ponta da sonda horizontal. É conveniente fazer isso usando um clipe de jacaré montado no banco.
   3. Deposite uma esfera de espalhamento na ponta da sonda. Use o micromanipulador para empurrar lenta e cuidadosamente a ponta da fibra óptica da sonda para dentro da gota de adesivo/TiO₂. Em seguida, retire rapidamente a ponta da cola. Repita de duas a três vezes até que uma gota esférica de adesivo do tamanho desejado seja depositada na ponta da fibra óptica.
      NOTA: A esfera de espalhamento será estável em diâmetros de duas a oito vezes maiores que o diâmetro da fibra óptica cônica. O tamanho final ótimo depende da aplicação final desejada.
   4. Cure a esfera conectando a extremidade da fibra óptica terminada em SMA a uma fonte de luz UV acoplada à fibra (Tabela de Materiais).
      OBS: A fonte de luz utilizada neste estudo apresentou potência de 5,3 mW. Nesta potência, o tempo de cura recomendado é de pelo menos 12 h ou durante a noite. Após a cura é um bom momento para caracterizar e medir o tamanho da ponta da sonda óptica final.

2. Preparo e montagem do tecido para medidas ópticas (Figura 2 e Figura 3)

1. Prepare os pratos para montar as amostras para um experimento. Aqueça a extremidade grande de uma pipeta de Pasteur usando uma tocha de butano para fazer um soco para derreter um furo de 0,5 cm de diâmetro no fundo de uma placa de Petri de plástico de 35 mm x 10 mm. Sele o orifício no lado inferior do prato com fita elétrica ou fita adesiva. Faça vários de cada vez para eficiência.
2. Preparar gelatina líquida (Tabela de Materiais) de acordo com as instruções da embalagem.
   NOTA: A gelatina sem sabor de grau alimentício comercial do supermercado é melhor para este fim do que a gelatina de grau químico de fornecedores químicos, porque a gelatina de grau químico é menos opticamente clara e menos confiável mecanicamente do que o produto alimentício.
3. Realizar a dissecção e preparo do tecido que será utilizado.
   NOTA: Por experiência, qualquer tecido plano de até 1 cm de espessura pode ser medido com sucesso neste experimento usando qualquer técnica de dissecção apropriada para o sistema de interesse. Para o tecido de moluscos gigantes, um punch de biópsia de 8 mm foi usado para fazer um círculo plano e regular de tecido de molusco para uso no experimento¹². Para este sistema, apenas uma amostra poderia efetivamente ser preparada de cada vez, dado o período de tempo necessário para completar uma medição para garantir que a amostra ainda estivesse em condições de vida no final do experimento.
4. Encha duas placas de Petri do passo 2.1 um quarto do caminho com a gelatina líquida e deixe arrefecer até à temperatura ambiente (RT) logo após a gelificação. Em um prato, coloque a biópsia na almofada de gelatina viscosa que se forma no buraco no fundo do prato. Use uma pipeta de Pasteur para adicionar suavemente gelatina RT ao redor da biópsia até que a placa de Petri esteja cheia (Figura 3). Encha o segundo prato com gelatina para fazer uma amostra em branco.
5. Coloque os pratos de amostra em uma geladeira por cerca de 10-30 minutos até que a gelatina esteja totalmente curada e ligeiramente elástica ao toque.
   NOTA: Em uma sala fria, isso pode não ser necessário; Ao trabalhar nos trópicos, esta etapa é necessária para curar totalmente a gelatina.
6. Montagem da placa de Petri no micromanipulador (Figura 2)
   1. Corte um quadrado de 6 cm x 6 cm de 1/4 em plexiglass grosso (Tabela de Materiais).
   2. Faça ou derreta um furo no quadrado de plástico do mesmo diâmetro da placa de Petri (~35 mm). Certifique-se de que a placa de Petri se encaixe perfeitamente neste orifício e seja mantida no lugar com atrito. Adicione fita adesiva nas bordas do prato para aumentar ligeiramente o tamanho e o contato com o atrito.
   3. Fure ou derreta um furo de 1/4 de diâmetro no canto do quadrado de plástico. Use este orifício para fixar o quadrado ao micromanipulador usando um parafuso e parafuso de 1/4.
   4. Cubra o quadrado de plástico com fita elétrica preta para reduzir a luz perdida que atinge a sonda. Da mesma forma, use fita adesiva para criar uma saia ao redor das laterais do quadrado que se estenda abaixo da parte inferior da placa inserida (>10 mm) para reduzir a luz perdida (Figura 2B).
   5. Use um parafuso e hardware apropriado para fixar o suporte da placa de Petri a um micromanipulador que permita ajustes tridimensionais e movimento vertical bem resolvido em uma extensão maior do que a espessura das amostras (parte 1 e parte 2 do manipulador mencionado na Tabela de Materiais são bons exemplos). Afixe este micromanipulador em uma protoboard óptica.

3. Configuração de medição para biópsias teciduais

1. Monte uma fonte de luz acima da área onde a medição é realizada, de modo que a luz seja colimada quando atingir o plano onde a amostra será colocada (Figura 2A). Por exemplo, anexe uma lente de colimação de 5 cm (Tabela de Materiais) a uma guia de luz líquida de 5 mm (Tabela de Materiais) e eleve acima da amostra em >0,6 m usando um vício e uma estrutura anexados a uma protoboard óptica (Tabela de Materiais). Em seguida, conecte a guia de luz a uma fonte de luz de banda larga, como a fonte de luz de plasma listada na Tabela de Materiais.
2. Conecte a sonda a um suporte orientado verticalmente de tal forma que ele aponte para a fonte de luz. Fixe a sonda com grampos, abraçadeiras de mangueira ou fita adesiva em um poste de mesa óptico.
   NOTA: No experimento de moluscos gigantes, um suporte de haste especificamente projetado, como o micromanipulador listado na Tabela de Materiais, é usado. Neste trabalho, ele foi fixado por ímãs a uma protoboard óptica (Tabela de Materiais). Os graus adicionais de liberdade para alinhamento obtidos por ter a sonda e a amostra em manipuladores são convenientes, mas não necessários. Tenha cuidado para não apertar demais o poste, pois isso pode quebrar a carcaça da pipeta.
3. Posicione o manipulador de amostras perto da sonda montada verticalmente. Use o manipulador de amostra para ajustar a posição do estágio da amostra de modo que a sonda fique centralizada na abertura de 0,5 cm na parte inferior da placa de Petri. Tenha extremo cuidado para evitar tocar ou bater na ponta da sonda montada.
   NOTA: Um estereomicroscópio montado na lança posicionado sobre a área da amostra pode ser útil. Dessa forma, o alinhamento de cima para baixo da ponta da sonda, do estágio e da amostra pode ser visualizado antes de iniciar um experimento (Figura 2A).
4. Conecte a extremidade da fibra óptica da sonda terminada por SMA a um espectrômetro de fibra óptica USB (Tabela de Materiais) e conecte o espectrômetro ao computador usando um cabo USB.

4. Coleta de dados

1. Arranjo experimental
   1. Tenha a sonda e os manipuladores na posição exata alinhada em que os dados serão coletados, como na etapa 3.4.
   2. Use um cotonete ou agulha de calibre fino para aplicar cuidadosamente uma pequena quantidade de lubrificante de silicone (Tabela de Materiais) na parte da sonda que será inserida no tecido para diminuir o atrito entre os lados da sonda e a amostra de tecido. Reaplique o lubrificante de silicone antes de cada medida basal ou tecidual.
   3. Retire a fita que cobre o orifício da placa de Petri da amostra em branco e coloque-a no suporte da amostra (passo 2.7), certificando-se de que é mantida firmemente no lugar por atrito.
   4. Use o micromanipulador para abaixar a amostra na sonda. Deixe a sonda entrar na gelatina através do orifício na parte inferior da placa de Petri. Continue até que a sonda esteja a aproximadamente 5 mm do fundo da camada de gelatina.
   5. Ligue a fonte de luz. Usando o software do espectrômetro, ajuste o tempo de integração do espectrômetro até que o sinal seja o mais alto possível, mas não esteja saturando. Defina o número de varreduras médias entre dois e cinco e o valor de pixels de suavização como seis. Os tempos de integração utilizáveis neste estágio podem variar entre 1-50 ms para essa linha de base.
2. Coletando os espectros de referência
   1. Colete uma medida escura.
      1. Uma vez que os parâmetros do espectrômetro tenham sido definidos com a amostra em branco, desconecte a fibra da sonda do espectrômetro e cubra a porta com a tampa metálica opaca que acompanha o espectrômetro.
      2. Obtenha uma medição escura do espectrômetro (geralmente usando o ícone de lâmpada escura na GUI) para caracterizar o ruído do espectrômetro sem luz de entrada. Salve essa medição de acordo com a estratégia de aquisição de dados.
   2. Coletar uma medida de lâmpada. Reconecte a fibra da sonda ao espectrômetro, aguarde o sinal se estabilizar e adquira outro espectro. Essa medida caracteriza a luz que atinge a sonda através da gelatina na ausência de tecido.
3. Coletando os espectros teciduais
   1. Retire a fita no fundo da placa de Petri da amostra e coloque-a no suporte da amostra.
   2. Alinhe a placa da amostra com a sonda usando manipulação tridimensional para que a biópsia de tecido fique centralizada acima da ponta da sonda.
   3. Aplicar gel de silicone na sonda (ver ponto 4.1.2) e abaixar lentamente a amostra sobre a sonda até que a ponta da sonda tenha passado através da gelatina que suporta a amostra de tecido e tenha acabado de entrar na amostra de tecido.
      NOTA: Alguns espectrômetros e programas de computador permitem o monitoramento em tempo real da luz detectada. Use isso para determinar quando a sonda entra no tecido. A intensidade do espectro diminuirá abruptamente assim que a ponta da sonda estiver em contato direto com o tecido.
   4. Verifique se o tempo de integração é apropriado para a medição, garantindo que o espectro medido não seja nem muito barulhento nem saturado. Altere o tempo de integração, se necessário.
      1. Sempre que o tempo de integração for ajustado, execute e armazene uma nova medição escura (etapa 4.2.1). Não altere o número de varreduras médias ou o número de pixels suavizados.
      2. Depois de encontrar parâmetros de medição adequados, faça as medições e salve o espectro.
   5. Mova a amostra para uma distância especificada usando o micromanipulador. Para o manipulador utilizado neste estudo, cada pequena marca de carrapato foi de 0,001 pol ou 25,4 μm. A amostra foi movida para baixo através de cinco marcas de carrapato, ou 127 μm, para cada medida. Repita a etapa 4.3.4.
   6. Continue a salvar os espectros em cada posição vertical dentro do tecido.
      NOTA: Para o sistema aqui descrito, os tempos de integração necessários variaram entre 1 ms a 5 s para as medições dentro de uma única amostra de tecido. Eventualmente, a ponta da sonda sairá do topo do tecido e ficará visível ali (Figura 4A). Esta é a medida final e caracteriza a luz incidente no topo do tecido.
4. Carregamento e processamento dos dados
   1. Use o software do espectrômetro para converter todos os espectros coletados (espectros escuros, espectros de lâmpadas e medidas de tecido) em arquivos de texto delimitados.
   2. Usando o Matlab ou uma linguagem de codificação de sua escolha, carregue todos os arquivos de medição de uma amostra. Para cada espectro de medição de tecido, subtraia o espectro escuro com o tempo de integração correspondente e, em seguida, divida pelo tempo de integração.
      OBS: Neste estudo, foi utilizado um script Matlab para carregamento e processamento dos dados (Arquivo Suplementar 1).
   3. Calcular a porcentagem de luz incidente atingindo cada posição no tecido dividindo os espectros obtidos com a sonda dentro do tecido pelo espectro basal obtido na gelatina vazia.
      NOTA: A medida no topo do tecido (passo 4.3.6) deve ser muito semelhante à medida basal em gelatina (passo 4.1) e, quando dividida, deve ser próxima de 100%. Dependendo do contexto experimental, o espectro da lâmpada (o espectro da gelatina vazia ou do topo do tecido) pode ser usado como referência. No entanto, ainda é importante coletar um espectro de lâmpada antes de iniciar o experimento. Isso ocorre porque, se a sonda quebrar ou o experimento falhar antes de atingir o topo do tecido, os dados obtidos antes da falha ainda são utilizáveis, o que não é o caso se não houver espectro de referência de lâmpada inicial correspondente.
   4. Visualize os dados; gráficos de contorno podem ser úteis (Figura 4B).

Representative Results

Este protocolo descreve o procedimento para a construção de uma sonda micro-óptica que pode ser usada para medir a irradiância de ressurgência (a luz atingindo um ponto de uma direção) ou, com a adição de uma ponta esférica de espalhamento de luz, para medir a irradiância escalar (a luz atingindo um ponto de todas as direções). Essas sondas podem medir a irradiância em resoluções espaciais que se aproximam das escalas de comprimento de células isoladas dentro do tecido vivo. Este protocolo também descreve um método representativo para preparar uma amostra de tecido para medidas de irradiância usando a sonda descrita e um método representativo para visualização e análise de dados.

A Figura 1 mostra a saída da produção de microssondas. Quando puxada, a fibra óptica deve afinar por cerca de 3 cm e não ter riscos ao longo da conicidade. Também deve ser plano na extremidade e ter um diâmetro de 15-30 μm (Figura 1D). A planicidade da ponta pode ser melhorada lixando a extremidade com papel carborundum ou marcando e quebrando novamente. Da mesma forma, a pipeta de vidro puxada usada como carcaça da fibra não deve ter bordas afiadas ou quebradas. Quando a esfera de espalhamento é formada na extremidade da ponta plana e cortada da fibra, ela deve ser esférica (Figura 1C). Antes de curar, os disformes podem ser removidos por outra rodada de inserção da bola na gota adesiva pai e puxando rapidamente a fibra para fora. Uma velocidade rápida de movimento puxará a bola de cola da extremidade da fibra. Movimentos mais lentos resultam em construção adicional de adesivo na fibra. Observar o processo usando um microscópio dissecante enquanto a fibra está conectada a uma fonte de luz é útil para visualizar o trabalho e determinar se o processo está funcionando. É importante fixar a fibra dentro da pipeta de vidro com cola e fita elétrica antes de aplicar o adesivo espalhador; caso contrário, a fibra pode se romper, ou o adesivo pode manchar com a fibra deslocante (Figura 1).

A Figura 2 mostra o aparelho de medição. Neste exemplo, os suportes para a amostra de tecido e a sonda têm capacidade de ajuste em três dimensões (Figura 2). Anexar a amostra e a sonda aos manipuladores ajuda no alinhamento, mas não é essencial; a sonda poderia ser acoplada a um poste estacionário. Os movimentos mais resolvidos dos manipuladores devem ser orientados na direção vertical, z, para que a posição no tecido e/ou a quantidade de movimentos das sondas possam ser determinadas com precisão (Figura 2A). Um estereomicroscópio montado na lança pode ser útil quando colocado de tal forma que se possa visualizar o estágio, a sonda e a amostra através da ocular para verificar o alinhamento da sonda com o estágio, a placa e a amostra (Figura 2B). Observar os espectros em tempo real enquanto abaixa a amostra na sonda é útil porque, se o espectro medido pela sonda mudar repentinamente, isso sugere que a amostra está localizada com sucesso dentro do tecido altamente espalhador ou absorvente ou que a sonda está dobrando ou quebrando. Mudanças abruptas na forma e intensidade do espectro provavelmente indicam entrada de tecido, enquanto mudanças abruptas de intensidade sem uma mudança na forma sugerem que a sonda está dobrando ou quebrando. Na parte superior do tecido do molusco, há uma membrana fina e clara que a sonda não pode penetrar sem quebrar. Em um caso como este, a parte superior do tecido deve ser monitorada para ver quando a sonda está prestes a sair, e as medições devem ser interrompidas nesse ponto para que a sonda não quebre.

A Figura 3 mostra a amostra de biópsia de tecido embebida em uma placa de Petri de gelatina, conforme descrito na seção 2. Há um orifício no fundo da placa de Petri para permitir a inserção da sonda óptica no tecido por baixo. A biópsia tem 8 mm de diâmetro e é centralizada sobre o orifício na placa de Petri (Figura 3A). Há uma pequena quantidade de gelatina abaixo da amostra de tecido, e a gelatina é preenchida até o topo da placa acima do tecido (Figura 3B).

A Figura 4A mostra a sonda quando ela começa a sair do topo do tecido e a Figura 4B mostra os dados representativos. Um script Matlab (Arquivo Suplementar 2) foi usado para gerar os traços na Figura 4B. O eixo x é o comprimento de onda, e o eixo y é a porcentagem de luz a uma profundidade de tecido em relação ao espectro basal. Medidas individuais para profundidade do tecido são indicadas pelas linhas com coloração em escala de cinza. As medidas tomadas mais profundamente no tecido são representadas por uma linha mais escura. O espectro basal é a medida em uma amostra somente gelatina e é usado para caracterizar a lâmpada e a resposta da sonda à lâmpada. A gelatina tem ligeira absorção e espalhamento, o que significa que o sinal para a absorção da gelatina contra o comprimento de onda não é completamente plano. Portanto, os espectros obtidos em todo o tecido são divididos pelo espectro da sonda em gelatina ou pelo espectro da sonda no topo do tecido, de modo que os dados espectrais mostrados na Figura 4B representam a porcentagem de luz apenas para a amostra de tecido e, portanto, são independentes da fonte de luz, a gelatina, e as especificidades de cada sonda individual.

Figura 1: Etapas de fabricação da sonda de radiometria micro-óptica intratecidual . (A) Um esquema da sonda óptica. (B) Uma visão da sonda óptica acabada. (C) Um close-up da esfera de espalhamento presa à fibra óptica puxada dentro do suporte da pipeta de vidro. (D) A fibra óptica puxada e limpa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Imagens e diagramas do arranjo experimental para medição da irradiância escalar no interior do tecido . (A) Um esquema geral e imagem do arranjo experimental. (B) Um close-up do porta-placas de Petri da amostra. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Biópsia de tecido de moluscos. (A) Vistas superior e (B) lateral de uma biópsia de tecido de moluscos pronta para ser medida na placa de Petri alterada preenchida com gelatina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Dados representativos . (A) Imagem do microscópio de como a sonda se parece ao subir através do tecido. (B) Dados representativos obtidos com a sonda de radiometria intratecidual. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Arquivo suplementar 1: script Matlab usado para carregar e processar os dados. Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo suplementar 2: script Matlab usado para gerar os rastreamentos na Figura 4B. Clique aqui para baixar este arquivo.

Discussion

Este protocolo descreve uma técnica para caracterizar sistematicamente o ambiente óptico através de um grande volume de tecido vivo com resolução espacial aproximadamente na escala de células únicas. Este método barato, flexível e tratável em campo poderia ser útil para qualquer pesquisador que estudasse a propagação da luz dentro de sistemas vivos. Pela experiência, em comparação com os métodos existentes⁷, essas sondas requerem um pouco mais de prática e habilidade para serem construídas, mas resultam em menos dano tecidual e na capacidade de caracterizar de forma mais abrangente maiores volumes de tecido denso.

Este método compreende quatro partes. A primeira parte, a construção da sonda, foi inspirada em projetos anteriores de dispositivos^10,11. A abordagem atual foi desenvolvida para varreduras sistemáticas e menos destrutivas da totalidade do tecido espesso, pois a agulha de vidro puxada pode deslizar suavemente entre as células. Também é passível de uso em laboratório de campo^12,13,14. Este protocolo resulta em sondas com pontas de ~20 μm de diâmetro para medir a radiância de ressurgência e uma esfera de espalhamento opcional de 50-100 μm de diâmetro para medir a irradiância escalar. Esferas de irradiância escalar maiores ou menores poderiam ser desenvolvidas modificando os materiais usados, por exemplo, um adesivo curável por UV com viscosidade inicial diferente. O peso na tração da pipeta e no processo de fibra pode ser ajustado para resultar em mais ou menos conicidade. A taxa de aquecimento também pode ser modificada através da distância da chama da tocha para ajustar o processo de tração e a conicidade resultante.

A técnica de construção da sonda requer alguma habilidade manual e tentativa e erro para aperfeiçoar, mas pode se tornar confiável e rápida com a prática. Aqui, algumas nuances de solução de problemas desenvolvidas ao longo do tempo são apresentadas. Puxar a fibra óptica para baixo da extremidade encamisada resulta em conies mais consistentes. É importante aplicar a caneta opaquing antes de adicionar a ponta de espalhamento esférico, uma vez que as propriedades umectantes da tinta opaca influenciam favoravelmente a formação de uma bola arrumada de adesivo na ponta da fibra. Se a bola adesiva resultante estiver deformada, é possível retirá-la e tentar novamente. Para fazer isso, o micromanipulador pode ser usado para deslizar toda a esfera para dentro do reservatório adesivo e, em seguida, retirado muito lentamente. Isso geralmente puxa a primeira tentativa disforme, deixando-a no reservatório adesivo e tornando possível tentar novamente.

Tratadas com cuidado, essas sondas podem ser usadas repetidamente para diferentes amostras. O maior perigo é bater acidentalmente a ponta da sonda em algo enquanto a move. Entre as medições, eles devem ser limpos de restos celulares usando álcool isopropílico e ar comprimido. As sondas também podem ser armazenadas por semanas, desde que a ponta da sonda não esteja tocando em nada e não haja forças no conjunto de fibra óptica que possam separar a fita e a cola que mantém a sonda dentro da manga de vidro. Isso pode ser feito apertando a pipeta de fibra e vidro em vários lugares até a borda de uma prateleira alta.

A segunda e a terceira partes deste método envolvem os aspectos mecano-ópticos do experimento e a fixação do tecido para medição. Esta parte do método foi desenvolvida especificamente para medir a irradiância escalar intratecidual dentro do tecido de moluscos gigantes¹². Aqui, detalhes para solucionar esses aspectos do método são apresentados. Primeiro, a biópsia deve ser grande em relação à sonda. Isso impede que a sonda mova o tecido enquanto ele transita. Além disso, o tecido deve ficar no fundo da placa de Petri para que a elasticidade e o peso da gelatina se combinem para manter o tecido no lugar durante a medição. Também é importante que a sala esteja fria o suficiente para manter a gelatina em um estado sólido elástico sob a fonte de luz experimental. Da mesma forma, ajuda a usar um LED ou outra fonte com relativamente pouca geração de calor em relação à luz visível.

Os parâmetros geométricos e optomecânicos do método são muito flexíveis. Por exemplo, a sonda de irradiância escalar foi usada para medir a irradiância dentro do cérebro e tecido adiposo de um camundongo intacto^13,14. Para fazer isso, a sonda foi montada nos manipuladores em uma estrutura estereotáxica padrão de roedores, e a fonte de luz foi montada apontando para o rostro do rato. Em qualquer geometria, a chave para o uso bem-sucedido deste método é sempre coletar espectros de referência escuros e lâmpadas apropriados no início de qualquer medição. Se uma sonda se rompe durante uma medição do tecido e não há caracterização inicial sem o tecido no lugar, os dados serão difíceis ou impossíveis de interpretar, e será necessário começar de novo com uma nova sonda. Em contraste, com referências apropriadas no início, as medições parciais são dados utilizáveis.

A última parte desse método diz respeito à aquisição de dados. O uso de um espectrômetro de fibra óptica para monitorar sinais da sonda é descrito, o que garante a facilidade de acoplamento SMA e fornece informações de comprimento de onda totalmente espectral. No entanto, para sistemas com menor fluxo de fótons, também é possível acoplar essas sondas a tubos fotomultiplicadores ou fotodiodos de avalanche. Em qualquer caso, todos os detectores requerem medições de referência para cada nova medição. Portanto, com apenas pequenos ajustes nos métodos de coleta de dados descritos, todos os diferentes tipos de parâmetros ópticos podem ser caracterizados.

Futuros usos interessantes deste método poderiam ser a quantificação de luz nas profundezas dos corpos de mamíferos maiores e dentro de plantas com propriedades complexas de transferência radiativa, como suculentas.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1" travel ball bearing center+D11+A2:D31+A2:A2:D31	Edmond Optics	37-935	Part 2 of manipulator for lowering sample
1/4" thick acrylic sheet	McMaster-Carr	8505K754	For making Petri dish holder
3/4" mini spring clamp	Anvil	99693	Use as weight for pulling optical fiber
8 mm biopsy punch	Fisher Scientific	NC9324386	For tissue sample
Butane Torch	McMaster-Carr	MT-51	Heat source for pulling fiber and pipette
Collimating lens	Thorlabs	LLG5A1-A	To collimate light source through liquid light guide
Compressed air	McMaster-Carr	7437K35	For drying pulled fiber and pipette
Cyanoacrylate glue - liquid	McMaster-Carr	66635A31	For securing tapered fiber end at top of pulled pipette
Electrical tape	McMaster-Carr	76455A21	For securing fiber in pipette and for adding grip to clamps
Fine grade carborundum paper	McMaster-Carr	4649A24	Small triangle on exacto knife holder works well
Gelatin	Knox	10043000048679	For securing the tissue biopsy in the petri dish
Glass Pasteur Pipete	Fisher Scientific	13-678-20B	Disposable glass pipette 5.75" in length
Insulin syringes, 31G needle	BD	320440	For applying glue
Isopropanol	McMaster-Carr	54845T42	For cleaning pulled fiber and pipette
Kimwipe	Cole-Parmer	SKU 33670-04	For wiping optical fiber and glass pipette clean
LED driver	Thorlabs	LEDD1B	For powering the UV LEDs
Light source for measurements	Cole-Parmer	UX-78905-05	Low heat white light source for measurements
Linear metric X-Y-Z axis rack and pinion stage	Edmond Optics	55-023	Part 1 of manipulator for lowering sample
Liquid light guide	Thorlabs	LLG5-4T	For light source in measurements
Magnetic feet	Siskiyou	MGB 8-32	For use with magnetic strips
Magnetic strips	Siskiyou	MS-6.0	For mounting magnetically to breadboard
Manipulator #1	Siskiyou	MX10R	4-axis manipulator with pipette holder
Opaquer pen, small	WindowTint	TOP01	For opaquing side of optical fiber to prevent stray light from enter probe
Optical breadboard	Edmond Optics	03-640	For stable affixation of probe holder, sample, microscope and light source
Optical fibers	Ocean Optics	P-100-2-UV-VIS	About 4 fibers are good to have
Plasma light source	Thorlabs	HPLS345	For tissue radiometry measurements
Plastic plier clamp	McMaster-Carr	5070A11	Plier clamp used for weight in pulling pipette
Polystyrene Petri dishes	Thomas scientific	3488N10	Sample holders, enough volume to hold sample thickness plus ~10 mm of gelatin on top
Razor blades	McMaster-Carr	3962A3	For stripping jacketing from optical fiber
Silicone oil lubricant	Thomas scientific	1232E30	For reducing friction between probe and tissue
Software for analyzing data	Matlab		Chosen software for data analysis
Spectrometer + spectrometer software	Avantes	AvaSpec-2048L	Spectrometer can be any brand, this one is compatible with sma-terminated optical fibers and comes with its own software for running the spectrometer
Titanium dioxide powder	Sigma Aldrich	718467-100G	For making scattering sphere
Toolour tabletop clip	Toolour	Toolour0004	For holding pipette while pulling and for holding finished probes
Trigger-action bar clamps	mcMaster-Carr	51755A2	Good for holding optical fibers while pulling or curing
UV curable adhesive	Delo Photobond	GB368	For making scattering sphere
UV light source	Thorlabs	M365FP1	Light source for curing adhesive in scattering ball, this one is sma-fiber compatible, higher intensity = less cure time
White LED light source	Thorlabs	MCWHF2	For characterizing pulled fiber and scattering sphere