Ensayo de punto vacío en tiempo real

Summary

Este artículo describe un nuevo método para estudiar el comportamiento de micción del ratón mediante la incorporación de la supervisión de vídeo en el ensayo convencional de micción de la micción. Este enfoque proporciona información temporal, espacial y volumétrica sobre los eventos de micción y detalles del comportamiento del mouse durante las fases de luz y oscuridad del día.

Abstract

El comportamiento miccional normal es el resultado de la función coordinada de la vejiga, la uretra y los esfínteres uretrales bajo el control adecuado del sistema nervioso. Para estudiar el comportamiento de micción voluntaria en modelos de ratón, los investigadores han desarrollado el ensayo de punto vacío (VSA), un método que mide el número y el área de manchas de orina depositadas en un papel de filtro que recubre el piso de la jaula de un animal. Aunque técnicamente simple y barato, este ensayo tiene limitaciones cuando se usa como un ensayo de punto final, incluida la falta de resolución temporal de los eventos miccionales y las dificultades para cuantificar las manchas de orina superpuestas. Para superar estas limitaciones, desarrollamos un VSA monitoreado por video, que llamamos VSA EN TIEMPO REAL (RT-VSA), y que nos permite determinar la frecuencia de micción, evaluar el volumen vaciado y los patrones de micción, y realizar mediciones durante las ventanas de tiempo de 6 h durante las fases oscura y clara del día. El método descrito en este informe se puede aplicar a una amplia variedad de estudios basados en ratones que exploran los aspectos fisiológicos y neuroconductuales de la micción voluntaria en estados de salud y enfermedad.

Introduction

El almacenamiento de orina y la micción están coordinados por un circuito central (sistema nervioso central) que recibe información sobre el estado de llenado de la vejiga a través de los nervios pélvico e hipogástrico. El urotelio, el epitelio que recubre el tracto urinario desde la pelvis renal hasta la uretra proximal, forma una barrera estrecha contra los productos de desecho metabólicos y patógenos presentes en la orina. Es un componente integral de una red sensorial, que detecta y comunica el estado de llenado de la vejiga a los tejidos subyacentes y nervios aferentes ^1,2. La ruptura de la barrera urotel....

Protocol

Ratones Piezo1 /2 uroteliales de doble knockout (Pz1/2-KO, genotipo: Piezo1 fl^/fl; Piezo2 fl^/fl; Upk2^CRE+/-) y controles (Pz1/2-C, genotipo: Piezo1 fl^/fl; Piezo2 fl^/fl; Upk2^CRE-/-) se generaron internamente a partir de cepas parentales obtenidas de los laboratorios Jax (cepa Piezo1 fl^/fl # 029213; Piezo2 fl^/fl cepa # 027720; Upk2^CRE+/- cepa # 029281). Tanto ratones hembra (1,5-3 meses de edad y 17-20 g de peso) como machos (2-4 meses de edad y 23-29 g de peso) se utilizaron en los experimentos. Para experimentos de ci....

Results

Comportamiento miccional de ratones picos piezo1/2 uroteliales

Durante la fase de almacenamiento del ciclo miccional, se plantea la hipótesis de que el urotelio detecta la tensión ejercida por la orina acumulada en la vejiga y transduce este estímulo mecánico en respuestas celulares como la liberación de ATP seroso ^1,3. Hemos demostrado previamente que los canales PIEZO1 y PIEZO2 activados mecánicamente se exp.......

Discussion

La incorporación de la videomonitorización es una modificación rentable que presenta varias ventajas sobre el VSA clásico. En el VSA clásico, que se usa típicamente como un ensayo de punto final, es difícil distinguir puntos vacíos superpuestos. Esta no es una preocupación trivial, ya que los ratones tienden a orinar varias veces en la misma área cuando el ensayo se prolonga durante varias horas, generalmente en las esquinas de su jaula. Por lo tanto, la primera ventaja de RT-VSA es que el investigador puede identificar .......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.00" X 1.00" Perfil con ranuras en T: cuatro ranuras en T abiertas –   corte a 10 pulgadas	80/20	1010	Cantidad: 20
1.00" X 1.00" Perfil con ranuras en T: cuatro ranuras en T abiertas –   corte a 12 pulgadas	80/20	1010	Cantidad: 6
1.00" X 1.00" Perfil con ranuras en T: cuatro ranuras en T abiertas –   corte a 40 pulgadas	80/20	1010	Cantidad: 4
1.00" X 1.00" Perfil con ranuras en T: cuatro ranuras en T abiertas – corte a 14.75 pulgadas	80/20	1010	Cantidad: 12
1.00" X 1.00" Perfil con ranuras en T: cuatro ranuras en T abiertas – Corte a 32 pulgadas	80/20	1010	Cantidad: 5
1/4-20 Tuerca en T Económica Deslizante Doble 80	/20	3280	Cantidad: 16
1/4-20 Tuerca en T Económica Deslizante Triple	80/20	3287	Cantidad: 18
10 & 25 Series 2 Orificios - Soporte de esquina interior ranurado de 18 mm con soporte doble	80/20	14061	Cantidad: 6
10 Serie 3 Orificios - Placa plana recta	80/20	4118	Cantidad: 8
10 Serie 5 Agujero - Placa Plana "L"	80/20	4081	Cantidad: 8
10 Serie 5 Agujero - Placa Plana "T"	80/20	4080	Cantidad: 8
10 Serie 5 Agujero - Placa Plana en T	80/20	4140	Cantidad: 2
Bisagra de desmontaje estándar de la serie 10 - Montaje a la derecha	80/	20 2064	Cantidad: 2
10 a 15 Serie 2 Orificios - Transición Lite Soporte de esquina interior	80/20	4509	Cantidad: 6
luces de tubo UV de 24" de largo	ADJ Products LLC	T8-F20BLB24	Cantidad: 2 bombilla de 20W – 24" Longitud de onda: 365nm
Lámina de espejo acrílico	Plástico Profesional	Cantidad: 1 82,5 cm x 26,5 cm
			Cantidad: 2 4,5 mm de grosor, transparente, 38,5 cm x 26,5 cm
Policarbonato AR (resistencia a los rayos UV)	80/20	65-2641	Cantidad: 4 4,5 mm de grosor, transparente, 38,5 cm x 21,5 cm
Policarbonato AR (resistente a los rayos UV)	80/20	65-2641	Cantidad: 4 4,5 mm de grosor, transparente, 26,5 cm x 21,5 cm
Policarbonato AR (resistencia a los rayos UV)	80/20	65-2641	Cuantía: 4 4,5 mm de grosor, transparente 37,5 cm x 23,9 cm
Policarbonato AR (resistencia a los rayos UV)	80/20	65-2641	Cantidad: 4 4,5 mm de grosor, transparente, 24,4 cm x 23,9 cm
Papel de cromatografía (papel fino)	Thermo Fisher Scientific	57144
Cosmos papel secante (papel grueso)	Blick Art Materials	10422-1005
Excel	Microsoft Corporation
GraphPad Prisma	GraphPad Software	versión 9.4.0	software de gráficos y estadísticas
ImageJ	FIJI NIH
Parafilm	Merck		película transparente
Quick Time Player 10.5 software	Reproductor multimedia	Apple
Espía de seguridad	Ben software		de software de videovigilancia
Cierre de extremo estándar, 1/4-20	80/20	3381	Cantidad: 80
Acrílico de transmisión UV	Spartech	Polycast Solacryl SUVT	Cantidad: 2 38.5 cm x 26.5 cm
Gel de agua: HydroGel	ClearH2O	70-01-5022	(https://www.clearh2o.com/product/hydrogel/)
Webcam	Logitech	C930e	Cantidad: 4