Detección de poro de nodo mecánico: una plataforma rápida y sin etiquetas para mediciones viscoelásticas unicelulares multiparamétricas

Las células individuales son materiales dinámicos y viscoelásticos¹. Una multitud de procesos internos y externos, (por ejemplo, el inicio de la mitosis o la remodelación de la matriz extracelular [MEC]), influyen en su estructura y composición ^2,3,4, a menudo resultando en distintas propiedades biofísicas que complementan su estado actual. En particular, las propiedades mecánicas han demostrado ser biomarcadores importantes del desarrollo celular, la fisiología y la patología, produciendo información cuantitativa valiosa que puede complementar los enfoques moleculares y genéticos canónicos ^5,6,7. Por ejemplo, Li et al. describieron recientemente las diferencias mecánicas entre las células de leucemia promielocítica aguda resistentes a los medicamentos y las que responden a los medicamentos, mientras que también utilizaron RNA-seq para descubrir genes asociados al citoesqueleto expresados diferencialmente⁸. Al comprender la compleja interacción entre la mecánica unicelular y la función celular, el mecanofenotipado tiene aplicaciones más amplias en la transformación de la ciencia básica y el diagnóstico clínico⁹.

La herramienta más ampliamente adoptada para medir la mecánica unicelular es la microscopía de fuerza atómica (AFM). Si bien AFM permite una medición localizada de alta resolución de las propiedades mecánicas celulares, permanece limitado a un rendimiento de <0.01 células / s¹⁰. Alternativamente, las camillas ópticas, que utilizan dos rayos láser divergentes para atrapar y deformar celdas individuales suspendidas¹¹, están limitadas a rendimientos marginalmente más altos de <1 celdas¹². Los avances recientes en las tecnologías microfluídicas han permitido una nueva generación de dispositivos para la evaluación mecánica rápida de una sola célula^12,13. Estas técnicas emplean canales de constricción estrechos 14,15^, flujo de cizallamiento¹⁶ o estiramiento hidrodinámico 17 para deformar las células rápidamente a rendimientos de 10-1.000 células/s ¹⁸. Si bien la tasa de medición de estos enfoques es considerablemente más rápida que las técnicas convencionales, a menudo intercambian capacidades de alto rendimiento por lecturas mecánicas limitadas (Tabla suplementaria 1). Todos los métodos microfluídicos rápidos mencionados anteriormente se centran en métricas básicas de un solo parámetro, como el tiempo de tránsito o las relaciones de deformabilidad, que solo reflejan las propiedades elásticas de una célula. Sin embargo, dada la naturaleza viscoelástica intrínseca de las células individuales, una caracterización mecánica robusta y exhaustiva de las células requiere considerar no solo los componentes elásticos sino también las respuestas viscosas.

La detección mecano-nodo-poro (mecano-NPS)^2,8 (Figura 1A) es una plataforma microfluídica que aborda las limitaciones existentes con el mecanofenotipado unicelular. Este método permite la medición de múltiples parámetros biofísicos simultáneamente, incluido el diámetro celular, la deformabilidad relativa y el tiempo de recuperación de la deformación, con un rendimiento moderado de 1-10 células / s. Esta técnica se basa en la detección nodo-poro (NPS)19,20,21,22,23,24, que consiste en utilizar una sonda de medición de cuatro puntos para medir el pulso de corriente modulada producido por una célula que transita un canal microfluídico que ha sido segmentado por regiones más amplias^, denominadas "nodos". El pulso de corriente modulada es el resultado de que la célula bloquea parcialmente el flujo de corriente en los segmentos (es decir, "poros") y nodos, con más corriente bloqueada en los primeros que en los segundos. En mecano-NPS, un segmento, el "canal de contracción", es más estrecho que el diámetro de una célula; en consecuencia, una célula debe deformarse para transitar todo el canal (Figura 1B). El diámetro celular puede determinarse por la magnitud del subpulso producido cuando la célula transita por los poros del nodo antes del canal de contracción (Figuras 1B, C). Aquí, |ΔI_np|, la caída de corriente cuando la celda está en el poro, es proporcional a la relación volumen de la celda al poro, _{V célula} /_{V poro} 2,8,19. La rigidez celular puede determinarse mediante ΔT_c, la duración del subpulso dramáticamente mayor producido cuando la célula transita por el canal de contracción (Figuras 1B, C). Una célula más rígida tardará más en transitar por el canal que una más blanda ^2,8. Finalmente, la "recuperación" celular, la capacidad de la célula para volver a su tamaño y forma originales después de la deformación, puede determinarse por la serie de subpulsos producidos a medida que la célula transita por los poros del nodo después del canal de contracción (Figuras 1B, C). El tiempo de recuperación, ΔT_r, es el tiempo que tardan los subpulsos actuales en volver a la magnitud de los subpulsos anteriores, antes de que la célula sea comprimida. En general, los pulsos de corriente modulada producidos cuando una célula transita por el canal microfluídico se registran y analizan para extraer los parámetros mecánicos unicelulares relevantes (Figura 1D)^2,8.

La reproducibilidad y facilidad de uso de esta plataforma microfluídica basada en electrónica han sido demostradas previamente²⁵. Además, la plataforma presenta una baja barrera de entrada para el mecanofenotipado unicelular. La litografía blanda estándar se emplea para fabricar dispositivos microfluídicos. El hardware de medición consta de componentes económicos, que incluyen una placa de circuito impreso simple (PCB), fuente de alimentación, preamplificador, placa de adquisición de datos (DAQ) y computadora. Finalmente, el código fácil de usar está disponible para la adquisición y el análisis de datos, lo que permite una implementación sencilla. Esta técnica de mecanofenotipado puede distinguir poblaciones de líneas celulares epiteliales de mama y pulmón no malignas y malignas, discriminar entre sublinajes en células epiteliales mamarias humanas primarias y caracterizar los efectos de las perturbaciones citoesqueléticas y otros agentes farmacológicos ^2,8. En general, esta plataforma es un enfoque efectivo para el mecanofenotipado de células individuales.

1. Diseño de la geometría del dispositivo

1. Elija el ancho de los segmentos de tamaño y recuperación para que sea más ancho que el diámetro de las celdas más grandes a medir, pero también mantenga una relación señal-ruido (SNR) suficiente. Consulte la Tabla complementaria 2 para obtener ejemplos de diferentes anchos de segmentos de tamaño y recuperación para varias líneas celulares.
2. Elija el ancho del segmento de contracción para aplicar una cepa del 30% al 40% al tamaño promedio de las células que se someterán al mecanofenotipado. La deformación se define como , donde d es el diámetro celular y w_c es el ancho del canal de contracción ^2,8. Véase la Tabla suplementaria 2 para conocer los diferentes anchos de segmento de contracción para varias líneas celulares.
   NOTA: Si se desea comparar tipos de células o condiciones con diámetros sustancialmente diferentes, se deben usar diseños de dispositivos separados con anchos de segmento de contracción específicos para cada tipo / condición de célula.
3. Diseñe un dispositivo de referencia para cada geometría de dispositivo única. Esto es necesario para determinar D_e, el diámetro efectivo del segmento de poro de tamaño del canal microfluídico.
   NOTA: El dispositivo de referencia utiliza la misma geometría que el dispositivo principal. La única modificación es que el segmento de contracción debe ser igual en anchura al segmento de poro de tamaño para permitir la calibración con perlas de poliestireno de un tamaño conocido. La ampliación de la contracción evita que las perlas de poliestireno obstruyan el canal de contracción durante la calibración. El proceso de calibración se describe con más detalle en los pasos 4.1 y 5.3.1. La calibración también se puede lograr utilizando un contador de celdas disponible comercialmente, en cuyo caso, no se necesita ningún dispositivo de referencia. Este proceso se describe en el paso 4.2.
4. Elija la altura del canal de tal manera que las celdas de interés más grandes puedan alargarse completamente sin restricciones dentro del segmento de contracción². Asegúrese de que la altura del canal sea mayor que h_min (esto supone que la celda es una predeformación esférica y que la deformación isométrica ocurre a lo largo de la longitud y altura del canal durante la deformación).
   NOTA: Dada la magnitud de un subpulso de corriente, , cuanto mayor sea el h_min, menor será la SNR general.
5. Diseñe y cree una fotomáscara utilizando un software de diseño asistido por computadora con los anchos de canal elegidos. Se proporciona un archivo de ejemplo en el archivo complementario 1. Escale el diseño de la máscara microfluídica en un 1,5% para tener en cuenta la contracción del polidimetilsiloxano (PDMS) después de pelar el maestro negativo.
   NOTA: Se puede incluir una matriz de dispositivos en una sola máscara siempre que la matriz general no exceda el tamaño de la oblea (Figura suplementaria 1A).
6. Diseñar y crear una fotomáscara con electrodos que se utilizará para realizar una medición de sonda de cuatro puntos de la corriente del dispositivo microfluídico (Figura 1D). Se proporciona un archivo de ejemplo en el archivo complementario 1.
   NOTA: Se puede incluir una matriz de electrodos en una sola máscara siempre que la matriz no exceda el tamaño del portaobjetos de vidrio (Figura suplementaria 1B).

2. Fabricar dispositivos (Figura 2)

1. Prepare patrones de electrodos en un sustrato de vidrio.
   1. Gire el recubrimiento, el patrón y procese una fotorresistencia positiva en un portaobjetos de vidrio liso de acuerdo con la hoja de datos del producto. Un ejemplo de este procedimiento se describe en el Archivo complementario 2.
   2. Realice la deposición de metal, el despegue y el grabado en oro.
      1. Realice una deposición de película delgada de 75 Å Ti, 250 Å Pt y 250 Å Au en la diapositiva. Un ejemplo de este procedimiento que utiliza la evaporación del cañón de electrones se describe en el Archivo Suplementario 3.
      2. Sumerja el portaobjetos en acetona durante 15 minutos para realizar un despegue del exceso de metal.
      3. En una campana extractora, utilice una pipeta desechable para colocar grabado de oro fundido en la región de los electrodos que estarán expuestos al canal microfluídico, como se muestra en la Figura complementaria 2. Tenga cuidado de evitar dejar caer el grabador en otra parte del tobogán.
         PRECAUCIÓN: El grabador de oro puede causar irritación de la piel y los ojos. No respirar vapores, y no ingerir. Manipule con cuidado, use el equipo de protección personal (EPP) adecuado y deseche los desechos de acuerdo con las regulaciones locales de eliminación.
      4. Enjuague el portaobjetos con agua desionizada (DI) y séquelo con nitrógeno seco (_N2).
   3. Si se imprimen varios electrodos en el mismo portaobjetos de vidrio, corte la diapositiva en fichas individuales.
      1. Use una herramienta de corte de vidrio para marcar la diapositiva a lo largo de los límites del electrodo estampado.
      2. Rompe el vaso a lo largo de la partitura para dividir la diapositiva en fichas individuales.
   4. Inspeccione visualmente los electrodos bajo un microscopio. Asegúrese de que los electrodos individuales no estén abiertos eléctricamente o que los electrodos no estén cortocircuitados juntos.
2. Fabrica un molde maestro negativo para canales.
   1. Escurra la capa, el patrón y procese una resistencia epoxi SU-8 sobre una oblea de silicio pulido de acuerdo con la hoja de datos del producto. Un ejemplo de este procedimiento se describe en el Archivo complementario 2.
   2. Mida las alturas de las características con un perfilómetro e inspeccione visualmente las características bajo un microscopio (Figura complementaria 3). Asegúrese de que las geometrías deseadas estén bien definidas.
3. Moldear canales PDMS con litografía blanda.
   1. Prepare el PDMS pesando un elastómero y un reticulante con una relación de masa de 10:1 en un vaso desechable.
      NOTA: Para una oblea con un diámetro de 3, 30 g de PDMS es suficiente.
   2. Mezclar el PDMS vigorosamente durante 30 s con un tenedor desechable, hasta que el PDMS quede opaco con burbujas.
   3. Desgasifique el PDMS en una cámara de vacío durante aproximadamente 30-90 min, o hasta que el PDMS sea transparente sin burbujas visibles.
   4. Coloque la oblea con el molde maestro SU-8 en una placa de Petri desechable y vierta PDMS sobre el centro de la oblea.
   5. Coloque la placa de Petri que contiene el PDMS y la oblea en una cámara de vacío y desgasifieste durante aproximadamente 30 minutos, o hasta que no queden burbujas en el PDMS.
   6. Hornear el PDMS a 80 °C durante 2 h en un horno o en una placa caliente.
   7. Con una cuchilla afilada, corte y retire el PDMS del maestro negativo SU-8.
   8. Corte la losa PDMS moldeada en moldes individuales usando una cuchilla afilada
   9. Coloque el núcleo de los orificios de acceso de entrada y salida con un punzón de biopsia desechable. Para obtener los mejores resultados, utilice un nuevo punzón para cada losa PDMS. Un punzón más afilado produce agujeros de bordes lisos, minimizando las partículas que podrían obstruir el canal de contracción.
      NOTA: El diámetro de los orificios de acceso debe ser ligeramente menor que el diámetro exterior del tubo. Por ejemplo, si se utiliza un tubo de politetrafluoroetileno (PTFE) con un diámetro exterior de 1/32 pulgada, se debe perforar un orificio de 1,5 mm.
4. Unir un sustrato de vidrio/electrodo a los canales PDMS.
   1. Limpie los portaobjetos de vidrio del electrodo con metanol (≥99,8%). Secar con N₂ seco.
   2. Limpie el dispositivo PDMS con cinta adhesiva, seguido de un enjuague con alcohol isopropílico (IPA) y agua desionizada (DI; 18 MΩ/cm²). Secar con N₂ seco. Luego, limpie con cinta adhesiva una vez más.
   3. Coloque el sustrato de vidrio con electrodos prefabricados y el molde PDMS preparado (con el lado de la característica hacia arriba) en un limpiador de plasma.
   4. Exponer ambos al plasma de oxígeno durante 2 min (100-300 mTorr, 30 W).
   5. Alinee y coloque el molde PDMS con el lado de la característica boca abajo sobre el sustrato de vidrio con electrodos prefabricados.
      NOTA: La unión es instantánea una vez que el PDMS tratado con plasma y el vidrio entran en contacto; En consecuencia, no serán posibles más modificaciones de alineación. Para facilitar la alineación, se pueden pipetear 20 μL de una dilución 2:1 de metanol en agua DI sobre la superficie de vidrio tratada con plasma. La solución de metanol actúa como una barrera física entre el vidrio tratado y el PDMS, lo que permite ajustes de alineación. Si utiliza metanol, hornee el dispositivo alineado y acoplado a 50 °C durante 2 h para evaporar la solución y completar el proceso de unión.
   6. Inspeccione visualmente el dispositivo unido bajo un microscopio. Asegúrese de que los electrodos y las geometrías del canal estén correctamente alineados.

3. Medir celdas (Figura 1D)

1. Prepare la fuente de presión, la PCB, el hardware de sobremesa y el software de adquisición de datos.
   1. Conecte el dispositivo microfluídico a la PCB usando la abrazadera. Un ejemplo de la PCB se proporciona en el Archivo complementario 4 (archivos GERBER) y el Archivo complementario 5 (archivos de lista de piezas de PCB, esquemáticos, de placa y de PCB).
      1. Alinee los pines accionados por resorte de la abrazadera con las almohadillas de contacto del electrodo en el dispositivo microfluídico y alinee los pines del cabezal de la abrazadera con los orificios de la PCB.
      2. Inserte firmemente los pines del cabezal de la abrazadera en los orificios de PCB, asegurándose de que los pines accionados por resorte permanezcan alineados con las almohadillas de contacto del electrodo.
   2. Configure y conecte el hardware electrónico.
      1. Conecte dos de los puertos de salida de la fuente de alimentación al puerto de voltaje de alimentación de la PCB con un adaptador hembra doble banana plug-to-Bayonet Neill-Concelman (BNC) y un cable BNC.
      2. Encienda la fuente de alimentación. Ajuste la salida conectada al conductor interno del BNC a +15 V y ajuste la otra salida a -15 V. Habilite ambas salidas para alimentar el circuito.
      3. Conecte el tercero de los puertos de salida de la fuente de alimentación al puerto de voltaje de entrada de la PCB con un cable BNC. Establezca la salida en el voltaje aplicado deseado, pero no lo habilite hasta que comience el experimento.
      4. Conecte el puerto de corriente de salida de la PCB a la entrada del preamplificador de corriente con un cable BNC.
      5. Conecte la salida del preamplificador de corriente a una entrada analógica en el bloque de terminales BNC del sistema de adquisición de datos con un cable BNC. Opcionalmente, conecte un filtro analógico de paso bajo en línea con el cable BNC para filtrar las interferencias de alta frecuencia.
         NOTA: Para mejorar la SNR, la PCB y el dispositivo pueden estar alojados dentro de una carcasa metálica gruesa. Todos los cables BNC y tubos fluídicos se pueden enrutar a través de orificios perforados en el gabinete.
   3. Instalar y configurar el software necesario en el ordenador personal (PC)
      1. Encienda y conecte el controlador de presión al PC. Instale cualquier software de control de presión requerido según las instrucciones del fabricante.
      2. Instale MATLAB y Data Acquisition Toolbox en el PC. Asegúrese de que los controladores necesarios para el sistema de adquisición de datos estén instalados para que la interfaz de MATLAB Data Acquisition Toolbox pueda detectarlos.
      3. Descargue el script de adquisición de datos incluido, "NPS.m", desde https://github.com/sohnlab/node-pore-sensing-public.
   4. Abra y configure el script de adquisición de datos.
      1. Establezca los valores correctos para inicializar la sesión de adquisición de datos, que incluye el ID de proveedor, el ID de dispositivo del DAQ y el número de canal de entrada analógica (líneas 34-36 en el script incluido).
         NOTA: El ID del dispositivo se puede encontrar utilizando la función "daq.getDevices" o "daqlist".
      2. Establezca la frecuencia de muestreo deseada para la adquisición (línea 23 en el script incluido). Para obtener resultados óptimos, debe ajustarse a al menos 10 kHz.
2. Prepare la suspensión celular.
   1. Preparar una solución de suero bovino fetal al 2% (FBS) en solución salina tamponada con fosfato 1x (PBS) y filtrar con un filtro de 0,22 μm.
   2. Cultivar y preparar las células de acuerdo con el protocolo de cultivo celular apropiado de la línea celular de elección. Suspender las células en la solución preparada de FBS al 2% en 1x PBS a una concentración de 1-5 x 10⁵ células/ml. Mantenga las células en hielo durante la duración de los experimentos.
3. Medir las propiedades físicas de las células.
   1. Cargue la muestra de celda en el tubo y conéctela a la entrada del dispositivo.
      1. Corte 30 cm de tubo de PTFE con una cuchilla de afeitar o un cuchillo afilado.
      2. Conecte un extremo del tubo a una jeringa luer lock. Use la jeringa para extraer la muestra celular en el otro extremo del tubo.
      3. Inserte cuidadosamente el tubo en la entrada del dispositivo.
      4. Conecte el extremo opuesto del tubo al controlador de presión microfluídica.
         NOTA: Se puede agregar un filtro entre el controlador de presión microfluídica y el tubo para evitar el reflujo de líquido en el controlador de presión.
   2. Ejecute el experimento.
      1. Ajuste la presión de conducción constante deseada en el software del controlador de presión y permita que la muestra llene el dispositivo.
         NOTA: La presión es típicamente de 2-21 kPa. La velocidad de flujo debe ser lo suficientemente lenta como para permitir pulsos claramente definidos, pero lo suficientemente rápida como para permitir un rendimiento adecuado.
         1. Si se forman burbujas en los canales microfluídicos, use un llenado sin salida: enchufe la salida del dispositivo y aplique una presión baja a la entrada para forzar la salida de aire a través del PDMS permeable al gas. Dejar burbujas en el canal conducirá a una línea de base actual inestable e impedirá mediciones precisas.
         2. Si los residuos obstruyen el canal microfluídico, desalojarlo presionando ligeramente la parte superior del dispositivo PDMS mientras aplica la presión de conducción, "pulsando" una presión más alta activando y apagando la presión, o retirando el tubo y volviéndolo a insertar. Si los residuos permanecen, puede ser necesario cambiar a un nuevo dispositivo.
      2. Ajuste el voltaje deseado girando la perilla de voltaje en la fuente de alimentación y habilite el voltaje presionando el botón On .
         NOTA: El voltaje suele ser de 1-5 V. Elija el voltaje más bajo necesario para una SNR adecuada. Se debe usar el mismo voltaje en todas las condiciones a comparar.
      3. Encienda el preamplificador de corriente y ajuste la sensibilidad (A/V) lo más baja posible; alternativamente, ajuste la ganancia (V / A) lo más alta posible sin sobrecargar el preamplificador o exceder el voltaje de entrada analógico máximo del DAQ. En este estudio, la sensibilidad se estableció en ^10-7 A/V.
         NOTA: El valor adecuado de sensibilidad/ganancia dependerá tanto del voltaje aplicado como de la resistencia de referencia del canal microfluídico.
      4. Pulse el botón verde Ejecutar en el menú de la cinta de opciones de MATLAB para iniciar el script de adquisición de datos NPS.m y comenzar a muestrear y guardar los datos.
      5. Para finalizar el experimento, presione el botón Detener en la esquina inferior izquierda de la ventana de la figura para detener el script de adquisición de datos. Desactive la salida de la fuente de alimentación pulsando el botón On . Ajuste la fuente de presión a presión cero en el software del controlador de presión.
      6. En este punto, el experimento se puede pausar para realizar una o varias de las siguientes acciones:
         1. Reemplace el dispositivo actual por uno nuevo.
         2. Vuelva a cargar el tubo con más muestras de células.
            NOTA: Para evitar la contaminación cruzada de muestras, utilice nuevos dispositivos para medir células de diferentes tipos o condiciones.
         3. Desenganche el dispositivo de la PCB y examine la condición del canal bajo un microscopio. Para reiniciar el experimento utilizando el mismo dispositivo, se debe tener cuidado de no introducir burbujas de aire. Puede ser necesario aplicar una presión suave al émbolo de la jeringa para mantener la muestra de la célula en el extremo del tubo mientras se inserta en la entrada del dispositivo.

4. Calibre el dispositivo microfluídico

1. Opción 1: Medir las perlas de poliestireno en dispositivos de referencia.
   1. Elija un tamaño de perla de poliestireno que sea más pequeño que el canal de tamaño.
   2. Agregue 1.5% de perlas de Tween y poliestireno a la solución filtrada de PBS y FBS utilizada durante los experimentos celulares, a una concentración de 1-3 x 10⁵ perlas/ml.
   3. Continuar con el experimento como se describe en la sección 3, utilizando el dispositivo de referencia descrito en el paso 1.3, y aplicar el mismo voltaje utilizado durante la experimentación. Utilice la magnitud media de la caída de corriente producida a medida que las perlas transitan por los poros de tamaño y el diámetro conocido de las perlas para calcular D_e, como se describe en la sección 5.
2. Opción 2: Mida de forma independiente el tamaño de la celda con un dispositivo de medición separado.
   1. En lugar de seguir el protocolo del paso 4.1, utilice un instrumento de medición del tamaño celular disponible comercialmente para medir el tamaño promedio de las células en la muestra. En este caso, no se necesita ningún dispositivo de referencia. Utilice la caída media de corriente producida a medida que las células transitan por el poro de tamaño y el diámetro medio de la célula medido para calcular D_e como se describe en la sección 5.

5. Analizar datos para extraer fenotipos celulares

NOTA: El procesamiento de datos se puede realizar utilizando el archivo de programa de interfaz de línea de comandos de MATLAB mNPS_procJOVE.m en https://github.com/sohnlab/NPS-analysis-JOVE. Consulte el Archivo complementario 6 para obtener más instrucciones.

1. Preprocesar los datos (Figura 3A).
   1. Calcule la corriente eléctrica medida aplicando el valor de ganancia utilizado en el preamplificador de corriente a voltaje a los datos sin procesar adquiridos por el DAQ.
   2. Elimine el ruido de alta frecuencia aplicando una función de suavizado rectangular y/o un filtro de paso bajo a la medición de corriente bruta. A continuación, vuelva a muestrear los datos filtrados a una frecuencia de muestreo más baja. Además, calcule los datos de marca de tiempo correspondientes a esta frecuencia de muestreo más baja.
   3. Calcule una señal de corriente de referencia ajustada aplicando un método como el suavizado asimétrico de mínimos cuadrados²⁶.
   4. Calcule la primera derivada aproximada (señal de diferencia) de los datos de corriente preprocesados tomando la diferencia entre los puntos de datos posteriores.
2. Identificar eventos celulares y extraer datos de subpulso (Figura 3B).
   1. Busque eventos de celdas candidatas examinando los datos preprocesados. Rechazar eventos celulares que se superponen con otros eventos celulares (es decir, eventos de coincidencia) (Figura complementaria 4), exhiben un ajuste basal deficiente o tienen una forma de pulso inesperada o errónea (por ejemplo, donde una obstrucción puede haber estado presente en el canal).
   2. Extraiga los datos de subpulso para cada evento celular.
      1. Cada segmento nodo-poro aparecerá como un subpulso correspondiente dentro del pulso de señal general (Figuras 1B, C). Identifique el inicio de cada subpulso calculando el punto de tiempo cuando la señal de diferencia alcanza un valor mínimo local. Identifique el final de cada subpulso calculando el punto de tiempo cuando la señal de diferencia alcanza un valor máximo local.
      2. Determine el ancho de cada subpulso como el tiempo transcurrido entre los puntos de tiempo de inicio y finalización. Determine la amplitud de cada subpulso calculando la media de la diferencia entre la corriente medida y la corriente de referencia para todos los puntos de datos entre los puntos de tiempo inicial y final.
3. Determine el mecanofenotipo celular para cada evento celular basándose en los datos de subpulso.
   1. Determine el diámetro de celda d basado en la ecuación definida por Deblois y Bean²⁴:
      
      donde ΔI/I es la relación media entre la amplitud del subpulso y la corriente de referencia en los subpulsos de tamaño, D_e es el diámetro efectivo del canal (medido en el paso 4) y L es la longitud total del canal nodo-poro.
      1. D e se determina calculando el promedio de ΔI/I producido por un conjunto de partículas de un diámetro conocido (ya sean células o cuentas, ver paso 4), usando ese diámetro conocido como d, y resolviendo Eq. 1 para D_e.
   2. Cuantificar la resistencia de la célula a la deformación.
      1. Determine el _flujo de la velocidad del fluido U calculando la velocidad media de la célula en los subpulsos de tamaño, utilizando las longitudes de segmento conocidas y la duración medida de cada subpulso.
      2. Determinar el índice de deformabilidad de toda la célula (wCDI), definido por Kim et ^al.2 como:
         
         donde L c es la longitud del segmento de contracción, el canal h es la altura del _canal y ΔT _c es la duración del subpulso de contracción.
   3. Identificar el tiempo de recuperación de la célula a partir de la deformación, definido como el primer subpulso de recuperación con una amplitud dentro del 8% de la amplitud media del subpulso de tamaño².
   4. Calcule la deformación transversal de la célula dentro del segmento de contracción.
      1. Calcule el diámetro efectivo del segmento de contracción (D_e,c) según lo definido por Kim et al.2: , donde w _c es el ancho del segmento de contracción y w_np es el ancho de todos los demás segmentos.
      2. Calcule el diámetro esférico equivalente d_c de la celda dentro de la contracción usando nuevamente la ecuación definida por Deblois y Bean²⁴:
         
         donde ΔI c/I c es la relación entre la amplitud del subpulso y la corriente basal en el subpulso de contracción y L_c es la longitud del segmento de contracción.
      3. Calcule la longitud de elongación de la célula L_deformarse como se describe en Kim et al.2:
         
      4. Finalmente, calcule la deformación transversal δ_deformación de la célula, que Kim et al.2 define como .

La plataforma de mecanofenotipado presentada aquí es un enfoque simple y versátil para medir las propiedades biofísicas de células individuales con un rendimiento moderado. Las células fluyen a través del canal microfluídico (Figura 1A) utilizando un flujo constante impulsado por presión. A medida que las células transitan, la longitud del canal microfluídico y los pulsos de corriente producidos se registran utilizando el hardware de adquisición de datos. La señal adquirida (Figura 1B, C) se procesa utilizando un software personalizado en MATLAB para extraer las propiedades mecánicas relevantes de una sola célula. La Figura 1D presenta una descripción gráfica del protocolo experimental.

Para fabricar dispositivos, inicialmente se crea un molde maestro negativo y se utiliza para fundir PDMS (Figura 2). Los moldes maestros exitosos, que se muestran en la Figura complementaria 3, contienen paredes laterales lisas y verticales y no tienen defectos en el canal microfluídico (Figura 4Ai). Se debe tener cuidado al fabricar este molde maestro inicial porque, en obleas mal fabricadas (Figura suplementaria 3), cualquier defecto se transferirá a todos los moldes de PDMS posteriores (Figura 4Aii), haciéndolos inutilizables. Los moldes PDMS exitosos se unen por plasma a portaobjetos de vidrio con electrodos estampados (Figura 1A).

Para los experimentos, las almohadillas de electrodos de un dispositivo están conectadas a la PCB (Figura 1D) para permitir la medición de corriente. El tubo, que contiene una muestra de célula, se inserta en la entrada del dispositivo y se conecta a un controlador de flujo microfluídico, lo que permite un flujo de células impulsado por la presión a través del canal microfluídico. Es importante destacar que se muestra una lectura en vivo de la medición actual durante un experimento. Esto permite a los usuarios asegurarse de que su dispositivo funciona según lo previsto. Los eventos de tránsito celular exitosos consisten en subpulsos fácilmente distinguibles (Figura 4Bi). Las complicaciones, como la obstrucción, pueden ocurrir durante la experimentación y pueden identificarse por la lectura en vivo de eventos con formas de pulso anormales (Figura 4Bii).

Para el análisis de datos, los parámetros críticos de señal que deben extraerse para cada evento de tránsito celular se detallan en la Figura 1B y se describen en el paso 5.2.2. La señal bruta debe tener una SNR suficiente para filtrar el ruido y extraer los componentes significativos (Figura 3A). Críticamente, el aumento de la señal de corriente de cada nodo debe ser lo suficientemente robusto como para que los subpulsos puedan identificarse fácilmente a partir de la señal de diferencia ∂ I / ∂t (Figura 3B).

El wCDI medido y los tiempos de recuperación se pueden utilizar para hacer comparaciones directas entre células o condiciones. Específicamente, wCDI es un indicador relativo de rigidez celular que es inversamente proporcional al módulo elástico (Figura complementaria 5); por lo tanto, un mayor valor de wCDI corresponde a un fenotipo mecánico más suave. Por ejemplo, en la Figura 5A, las células malignas MCF-7 tienen una mayor distribución wCDI que las células MCF-10A no malignas, lo que indica que las células MCF-7 malignas son más blandas que sus contrapartes MCF-10A no malignas. Esto es consistente con numerosos estudios empíricos que han demostrado que las células cancerosas son más suaves que sus contrapartes no malignas27. Asimismo, en la Figura 5B, las células MCF-10A y MCF-7 tratadas con latruculina muestran un aumento de wCDI. La latruculina es un potente agente farmacológico que altera el citoesqueleto de actina28. En consecuencia, es consistente observar una mayor wCDI , y por lo tanto un fenotipo más suave, en las células tratadas con este fármaco. Finalmente, en la Figura 5C, se compara wCDI entre dos sublinajes de células epiteliales mamarias humanas, epitelial luminal (LEP) y mioepitelial (MEP). En esta comparación, hay una vez más una distribución distinta de wCDI que diferencia los dos tipos de células primarias, lo que indica que las células LEP son más blandas que las células MEP. Más allá de wCDI, los tiempos de recuperación también se pueden cuantificar para proporcionar un indicador relativo de la viscosidad celular. Un tiempo de recuperación más largo indica un fenotipo más viscoso. La Figura 5D presenta los tiempos de recuperación, agrupados en tres categorías distintas, para cada una de las condiciones en las Figuras 5A-C. Los MCF-10As y MCF-7 no tratados tienen una mayor proporción de células que se recuperan instantáneamente (ΔTr = 0), lo que indica una viscosidad más baja que su contraparte tratada con latruculina.

wCDI y el tiempo de recuperación son métricas relativas de elasticidad y viscosidad de una sola célula. Por lo tanto, el método presentado aquí es el más adecuado para caracterizar la respuesta diferencial entre múltiples muestras de interés. En su forma actual, el protocolo presentado aquí no proporciona cuantificaciones absolutas de parámetros mecánicos definidos, como el módulo de Young.

Figura 1: Descripción general de la plataforma de mecanofenotipado. (A) Imagen del dispositivo microfluídico. (B) Geometría de canal, con un pulso de corriente representativo de un evento de tránsito de una sola celda. Δ Inp representa la caída de corriente de la celda que entra en el poro, y ΔIc representa la caída de corriente de la célula que entra en la contracción. Δ T p representa el tiempo necesario para que la célula transite el poro, Δ Tc representa el tiempo necesario para que la célula transite el canal de contracción y ΔTr representa el tiempo necesario para que la célula se recupere. (C) Pulso de corriente real de un evento de tránsito celular. (D) Flujo de trabajo experimental: (1) las células están suspendidas en PBS y (2) se conducen a través del dispositivo microfluídico con presión constante. A medida que las células transitan por el canal microfluídico, (3) los pulsos de corriente se miden utilizando hardware de adquisición de datos. (4) Los pulsos de corriente se analizan para extraer múltiples propiedades mecánicas de una sola célula. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Descripción general de la fabricación de dispositivos . (A) Los moldes maestros negativos son (1) fabricados mediante fotolitografía. (2) PDMS se echa sobre los moldes maestros negativos. (3) Los dispositivos moldeados están cortados en cubitos, con orificios de entrada y salida perforados. (B) Simultáneamente, las guías de vidrio están (1) modeladas para fabricar electrodos metálicos. (2) La evaporación del haz E se utiliza para depositar metal en el portaobjetos, seguido de un (3) proceso de despegue para eliminar el exceso de metal, dejando atrás los electrodos metálicos deseados. (C) El dispositivo PDMS y el vidrio con electrodos metálicos se unen utilizando plasma de oxígeno para completar el proceso de fabricación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Procesamiento y análisis de datos. (A) Los datos de corriente sin procesar (izquierda) se preprocesan (derecha) aplicando una función de suavizado rectangular y un filtro de paso bajo, seguido de un remuestreo a una frecuencia de muestreo más baja. La señal de corriente de referencia se ajusta posteriormente con un suavizado asimétrico de mínimos cuadrados26. (B) Los puntos de tiempo al inicio y al final de cada subpulso se identifican como mínimos y máximos locales, respectivamente, en la señal de diferencia ∂ I/∂t (izquierda). Para cada subpulso, el ancho Δt está determinado por el tiempo transcurrido entre el inicio y el final, y la amplitud ΔI está determinada por la diferencia media entre la corriente medida y la corriente de referencia. Los datos de subpulso extraídos se pueden representar como una señal rectangularizada (derecha); Cada subpulso corresponde a un segmento en la geometría del dispositivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Ejemplos de resultados exitosos y defectuosos durante la fabricación y la experimentación . (A) Imágenes de moldes PDMS de segmentos de contracción tomados de dos moldes maestros negativos diferentes. (i) es un ejemplo de un canal bien fabricado con paredes laterales lisas, geometría bien definida y sin defectos notables. (ii) es un ejemplo de un canal mal fabricado con defectos significativos en el canal de contracción (delineado en rectángulos rojos), que obstruiría total o parcialmente el flujo de partículas (barras de escala = 150 μm). (B) Ejemplos de pulsos de corriente filtrados generados por "NPS.m" durante la adquisición de datos. i) Ejemplo de un evento de celda exitoso, donde una celda transita el canal según lo previsto. ii) Ejemplo de pulsos de corriente producidos cuando el dispositivo está "obstruido". En este caso, los desechos obstruyen el flujo celular en el segundo poro del canal. Esto conduce a eventos celulares que aparecen "cortados" (indicados por la línea roja) a mitad del segundo pulso de tamaño. Las disminuciones en la corriente (indicadas por las líneas azules) después del "corte" son causadas por partículas (desechos o células) que se acumulan alrededor del bloqueo y, por lo tanto, bloquean una porción mayor del flujo de corriente. Un fuerte pico descendente en la corriente (indicado por el rectángulo verde) refleja una partícula que puede transitar alrededor del bloqueo y, por lo tanto, solo bloquea temporalmente una porción más grande de la corriente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Ejemplos de wCDI y recuperación celular entre diversas condiciones. (A) distribución de wCDI entre dos líneas celulares epiteliales de mama, MCF-10A no maligno y MCF-7 maligno. (B) wCDI de MCF-10A o MCF-7, donde cada tipo de célula no fue tratada, tratada con Lat-A y tratada con Lat-B. (C) distribución wCDI entre dos sublinajes epiteliales mamarios humanos primarios: células mioepiteliales (MEP) y epiteliales luminales (LEP). (D) Los tiempos de recuperación correspondientes a las cuatro condiciones entre A, B y C. Los tiempos de recuperación se agruparon para facilitar la visualización. Todas las condiciones tenían un tamaño de muestra de n = 99 células. Esta figura se reproduce con permiso de Kim et al.2. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1: Ejemplos de matrices de dispositivos tanto para los canales microfluídicos como para los electrodos. Ambas imágenes, representadas como las máscaras de transparencia, deben diseñarse con blanco (que representa transparente) en las regiones donde la fotorresistencia estará expuesta a los rayos UV y negro en las regiones donde se bloqueará la exposición a los rayos UV. (A) Una matriz de canales microfluídicos, con dos canales paralelos por "dispositivo" (rectángulo), dispuestos en una oblea de Si de 3 pulgadas. El dispositivo en el extremo derecho está etiquetado como "ref" y está diseñado, como se describe en el paso 1.3, para su uso en calibración. (B) Una matriz de electrodos, con dos electrodos por dispositivo, de modo que ambos canales en un dispositivo de (A) se alinearán sobre cada diseño de electrodo de (B). Esta matriz se organizó para una diapositiva de vidrio de 2 pulgadas x 3 pulgadas. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 2: Esquemas que ilustran las regiones del diseño del electrodo y cómo grabar el oro correctamente (paso 2.1.2.3). La capa superior de oro debe eliminarse de los electrodos de medición, o se producirá bioincrustación y electrólisis durante la medición. Sin embargo, el oro debe permanecer en las almohadillas de contacto, porque el oro suave proporciona una conexión eléctrica superior con los pines del conector del pin pogo. (A) Esquema que muestra cómo el canal microfluídico (en azul) se cruza con el metal estampado (negro). Como se indicó, el metal perpendicular al canal microfluídico y directamente debajo de él están los electrodos de medición, donde el oro debe ser grabado, mientras que los grandes rectángulos metálicos al lado del canal son las almohadillas de contacto, donde el oro debe permanecer. (B) Esquema que muestra dónde se debe aplicar el grabador de oro al metal estampado, así como dónde no. La región verde indica dónde es necesario el grabado, la región amarilla indica dónde puede ocurrir el grabado y no afectará la efectividad del dispositivo, y la región roja indica dónde no se debe grabar el oro. (C) Esquema que muestra un dispositivo típico, grabado con éxito. El amarillo indica las regiones donde el oro todavía está presente, y el gris indica las regiones donde la capa de platino ha sido expuesta. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 3: Imágenes de canales de contracción fabricados con éxito y mal fabricados. (A) Imágenes de canales de contracción en moldes maestros negativos de dos obleas de Si individuales. (i) Un ejemplo de un molde maestro bien fabricado que produciría un canal PDMS ideal como el que se muestra en la Figura 4Ai. (ii) Un ejemplo de un molde maestro mal fabricado, que se utilizó para crear el canal PDMS que se muestra en la Figura 4Aii. Las regiones delineadas en rectángulos rojos corresponden a los defectos indicados en la Figura 4Aii, lo que demuestra la transferencia de defectos del molde maestro a los microcanales PDMS (barras de escala = 150 μm). (B) Imágenes de la sección transversal de los canales de contracción de PDMS, mostrando la altura y el ancho de diferentes moldes. Estas secciones transversales se adquirieron cortando el canal de contracción PDMS perpendicular a la dirección del flujo. (i) Un ejemplo de un molde PDMS bien fabricado creado utilizando la oblea que se muestra en (Ai), que demuestra paredes laterales verticales lisas. (ii) Un ejemplo de un molde PDMS mal fabricado creado utilizando la oblea que se muestra en (Aii) que demuestra paredes laterales inclinadas (barras de escala = 20 μm). Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 4: Ejemplo de un evento celular coincidente (producido cuando más de una celda está transitando el canal a la vez). La señal se procesó de acuerdo con los pasos 5.1.1-5.1.3 en la sección 5 del protocolo. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 5: Relación entre wCDI y el módulo elástico 20,29,30,31,32,33,34,35. (A) Comparación de las células Jurkat, MCF7 y MCF10A medidas por esta técnica versus la aspiración de micropipetas. wCDI es inversamente proporcional a la tensión cortical. (B) Comparación de las células MCF7 y MCF10A medidas por esta técnica versus los datos publicados de AFM. (C) Comparación de las células A549 y BEAS-2B medidas por esta técnica con los datos publicados de AFM. En múltiples tipos de células, wCDI es inversamente proporcional al módulo elástico. Esta cifra ha sido reproducida con permiso de Kim et al.2. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla complementaria 1: Ejemplos de técnicas de mecanofenotipado unicelular y cómo se comparan con el mecano-NPS. Las técnicas se enumeran en orden de aumento del rendimiento 12,2,36,37. La información mecánica se refiere a si el dispositivo puede medir las propiedades mecánicas elásticas y viscosas de cada celda. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla complementaria 2: Ejemplo de anchos de segmentos de tamaño, contracción y recuperación para diferentes líneas celulares. MEP y LEP se refieren a dos linajes de células epiteliales mamarias humanas primarias, donde MEP se refiere a las células mioepiteliales y LEP se refiere a las células epiteliales luminales 2,8. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Archivo complementario 1: Ejemplo de diseño de AutoCAD. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 2: Protocolo de ejemplo para el procesamiento de fotolitografía. Se describen dos protocolos de ejemplo para el modelado y procesamiento de fotorresistencia o epoxi SU-8. El primero describe la aplicación de fotorresistencia positiva en un portaobjetos de vidrio para actuar como una capa de sacrificio para la fabricación de electrodos. El segundo describe la aplicación del epoxi SU-8 en una oblea de silicio para crear estructuras de relieve para moldear canales microfluídicos PDMS. Estos protocolos fueron adaptados de las hojas de datos MF-321 y SU8 3000 del fabricante. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 3: Protocolo de ejemplo para la deposición de película delgada de 75 Å Ti, 250 Å Pt y 250 Å Au utilizando evaporación por haz de electrones. Se describe un protocolo de ejemplo para realizar una deposición de película delgada de 75 Å Ti, 250 Å Pt y 250 Å Au utilizando un evaporador de haz de electrones. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 4: Archivos GERBER Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 5: Esquema, placa y archivos de lista de piezas de PCB Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo complementario 6: interfaz de línea de comandos de MATLAB. Este archivo incluye instrucciones detalladas para el procesamiento de datos utilizando la interfaz de línea de comandos26 de MATLAB. Haga clic aquí para descargar este archivo.

L. L. S posee la patente estadounidense No. 11,383,241: "Detección de poro de nodo mecánico", J. Kim, S. Han y L. L. Sohn, emitida el 12 de julio de 2022.