Summary
Detta protokoll kombinerar ex vivo-stimulering och flödescytometri för att analysera polyfunktionella T-cellprofiler (TPF) i mononukleära celler i perifert blod (PBMC) inom japanskt encefalitvirus (JEV) -vaccinerade barn. Detektionsmetoden och flödescytometrifärgschemat för JEV-specifika TPF testades för att ge en referens för liknande studier.
Abstract
T-cellmedierad immunitet spelar en viktig roll för att kontrollera flavivirusinfektion, antingen efter vaccination eller efter naturlig infektion. "Kvaliteten" på en T-cell måste bedömas efter funktion, och högre funktion är förknippad med kraftfullare immunskydd. T-celler som samtidigt kan producera två eller flera cytokiner eller kemokiner på encellsnivå kallas polyfunktionella T-celler (TPFs), som förmedlar immunsvar genom en mängd olika molekylära mekanismer för att uttrycka degranuleringsmarkörer (CD107a) och utsöndra interferon (IFN) -γ, tumörnekrosfaktor (TNF) -α, interleukin (IL) -2 eller makrofaginflammatoriskt protein (MIP) -1α. Det finns ökande bevis för att TPFs är nära besläktade med upprätthållandet av långsiktigt immunminne och skydd och att deras ökade andel är en viktig markör för skyddande immunitet och är viktig för effektiv kontroll av virusinfektion och reaktivering. Denna utvärdering gäller inte bara specifika immunsvar utan också bedömningen av korsreaktiva immunsvar. Här, med det japanska encefalitviruset (JEV) som exempel, testades detektionsmetoden och flödescytometrifärgschemat för JEV-specifika TPF-ssom produceras av mononukleära celler i perifert blod hos barn vaccinerade mot japansk encefalit för att ge en referens för liknande studier.
Introduction
Japanskt encefalitvirus (JEV) är ett viktigt myggburet virus som tillhör släktet Flavivirus inom familjen Flaviviridae 1. Många länder i Asien och Stillahavsområdet har länge mött enorma folkhälsoutmaningar på grund av den enorma sjukdomsbördan som orsakas av japansk encefalit (JE), men detta har förbättrats dramatiskt med den ökande tillgängligheten av olika typer av vaccinationer2. Adaptiva skyddande immunsvar som framkallas av naturlig infektion eller vaccination bidrar till förebyggande och antiviral reglering. Humoral immunitet och cellmedierad immunitet klassificeras som adaptiv immunitet, och induktion av den förra har alltid betraktats som en nyckelstrategi i vaccindesign, om än med relativt begränsad förståelse under de senaste3. Den roll som T-cellsmedierad immunitet spelar för att begränsa spridningen av flavivirus och virusclearance har emellertid i allt högre grad fokuserats på och studerats i stor utsträckning4. Dessutom är T-cellsimmunitet inte bara oumbärlig vid JEV-specifika antivirala svar utan spelar också en framträdande roll i korsskydd mot sekundär infektion med heterologa flavivirus, vilket har visats i tidigare studier5. Det spekuleras i att denna effekt kan kringgå potentiella antikroppsmedierade förbättringseffekter vid infektion5. Observera att sådan korsreaktiv T-cellimmunitet är viktig, särskilt i frånvaro av vacciner och antivirala läkemedel mot flavivirus. Även om många studier har utförts för att bestämma bidraget från T-celler vid JEV-infektion med avseende på CD4 + och CD8 + T-celler 6,7, förblir respektive släktlinjer som utsöndrar cytokiner och deras funktionella diversifiering obestämda, vilket innebär att belysningen av de exakta funktionerna hos hjälpar- och mördar-T-celler hindras.
Omfattningen av deras antivirala försvar bestämmer kvaliteten på T-cellsvar. CD4 + eller CD8 + T-celler som kompatibelt kan ge två eller flera funktioner, inklusive cytokinsekretion och degranulering, karakteriseras som polyfunktionella T-celler (TPFs) vid specifik stimulering på encellsnivå8. CD4 + T-celler som producerar enstaka eller flera cytokiner kan ha olika effekter och immunminnen. Till exempel är IL-2 + IFN-γ + CD4 + T-celler mer benägna att bilda ett långsiktigt effektivt skyddssvar än IL-2 + CD4 + T-celler9, som kan användas som en viktig parameter vid utvärdering av vaccinationseffekten. Frekvensen av IL-2 + IFN-γ + CD4 + T-celler ökar hos patienter med långvarig icke-progression av förvärvat immunbristsyndrom (AIDS), medan CD4 + T-celler hos patienter med AIDS-progression är mer benägna att producera IFN-γ ensam på grund av den främjande effekten av IL-2 på T-cellproliferation10. Dessutom visade sig en delmängd av IL-2+ IFN-γ+ TNF-α+ överleva långsiktigt in vivo och synergistiskt främja dödande funktion11. Även om CD8 + T-celler är mer benägna att uppvisa cytotoxisk aktivitet, är vissa CD4 + T-celler också utrustade med cytotoxisk aktivitet som ett indirekt detekterat uttryck av CD107a-molekylerpå ytan 12. Dessutom uttrycker vissa T-cellundergrupper kemokin MIP-1α, som ofta utsöndras av monocyter för att delta i T-cellmedierad neutrofil rekrytering13. På samma sätt kan CD8 + TPFs också användas för att karakterisera mångsidigheten hos ovanstående markörer. Studier har visat att prime-boost-strategin effektivt kan inducera en längre period av TPF-skyddande effekter13, vilket kan förbättra skyddet som framkallas av vaccination. En central funktion i att undersöka immunsystemet är förmågan hos minnes-T-celler att underlätta starkare, snabbare och effektivare svar på sekundära virala utmaningar än naiva T-celler. Effektorminne T-celler (TEM) och centrala minnes-T-celler (TCM) är viktiga T-cellundergrupper som ofta differentieras av det sammansatta uttrycket av CD27/CD45RO eller CCR7/CD45RA14. TCM (CD27+ CD45RO+ eller CCR7+ CD45RA-) tenderar att lokaliseras i sekundära lymfoida vävnader, medan TEM (CD27- CD45RO+ eller CCR7- CD45RA-) lokaliseras i lymfoida och perifera vävnader15,16. TEM ger omedelbart men inte ihållande försvar, medan TCM upprätthåller svaret genom att sprida sig i de sekundära lymfoida organen och generera nya effektorer17. Således, med tanke på att minnesceller kan förmedla specifika och effektiva återkallningssvar på virus, uppstår frågor om bidraget från denna delmängd av polyfunktioner.
Med utvecklingen av flödescytometriteknik har det blivit vanligt att samtidigt upptäcka markörer av mer än 10 kluster, fenotyper och differentieringsantigener, vilket är fördelaktigt för att rikligare kommentera de funktionella immunologiska egenskaperna hos enskilda T-celler för att minska misstolkning och svårigheter att förstå T-cellfenotyper. Denna studie använde ex vivo-stimulering och flödescytometri för att analysera TPF-profiler i mononukleära celler i perifert blod (PBMC) hos JEV-vaccinerade barn. Genom att tillämpa detta tillvägagångssätt kommer förståelsen av kort- och långsiktig JEV-specifik och till och med korsreaktiv T-cellimmunitet inducerad av vaccination att utökas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etiskt godkännande för den aktuella studien erhölls av etikkommittén vid Beijing Children's Hospital, Capital Medical University (godkännandenummer: 2020-k-85). Volontärer rekryterades från Beijing Children's Hospital, Capital Medical University. Perifera venösa blodprover erhölls från till synes friska barn (2 år) som tidigare hade fått en förstklassig och förstärkt vaccination med levande försvagad JE SA14-14-2-vaccin i mindre än ett halvt år (JE-vaccinerade barn, n = 5) och ovaccinerade barn (6 månader, n = 5). Informerat samtycke från försökspersoner frångicks eftersom endast restproverna, efter att ha testats kliniskt, användes i denna studie. För att skydda volontärernas integritet anonymiserades och avidentifierades alla uppgifter helt.
1. Isolering av PBMC från perifert venöst blod
- Samla in perifera venösa blodprover (2 ml) från JE-vaccinerade och ovaccinerade barn i EDTA-K 2-antikoagulerade rör (se materialförteckning) med standardvenipunkturteknik18.
- Tillsätt 2 ml fosfatbuffrad saltlösning (1x PBS) för att späda ut det perifera blodet.
OBS: Processen hanteras så snart som möjligt för att bibehålla maximal överlevnadsförmåga. - Tillsätt 4 ml av densitetsgradientmediet (se materialtabellen) till ett 15 ml centrifugrör och överför långsamt det utspädda blodet till det övre lagret av separationsmediet.
OBS: Blanda inte blodet med separationsmediet eller förstör kontaktytan som bildas av de två vätskorna; Annars kommer separationseffekten inte att uppnås. - Centrifugera vid 800 × g i 20 min vid rumstemperatur. Observera de signifikanta skikten efter centrifugering.
- Överför PBMC (mellanskiktet) till ett annat 15 ml centrifugrör och tvätta PBMC: erna med 10 ml RPMI-1640-medium som innehåller 10% fetalt bovint serum (FBS, se materialtabell).
- Centrifugera vid 800 × g i 10 min vid rumstemperatur och kasta övernappen försiktigt med pipett.
- Återsuspendera PBMC: erna med 1 ml RPMI-1640-medium som innehåller 10% FBS och räkna cellerna med en trypan blåbaserad automatiserad räknare (se Materialförteckning).
2. Stimulering av PBMC av inaktiverade JEV-partiklar för att inducera cytokinuttryck
- Ställ in två undergrupper av JEV-stimulerings- och kontrollgrupperna i de JE-vaccinerade respektive ovaccinerade proverna.
- Justera antalet PBMC till 2 × 10 6 celler / ml med RPMI-1640-medium som innehåller 10% FBS och frö PBMC: erna i 24-brunnsplattor (2 × 106 celler / 1 ml medium per brunn); Inokulera tre brunnar för varje grupp.
- Stimulera PBMC i JEV-stimuleringsgruppen med koncentrerade inaktiverade JEV-partiklar 5 (2 × 105 PFU) i 16 timmar vid 37 °C i närvaro av monoklonala antikroppar CD28 (1 μg/ml, 1:1 000) och CD49d (1 μg/ml), GolgiPlug (1 μg/ml, 1:1 000) och monensin (1 μg/ml, 1:1 000). För ytfärgning, använd BV605-anti-CD107a (1 μg/ml, 1:1 000) (se materialförteckning).
OBS: JEV inaktiverades genom UV-bestrålning som beskrivits tidigare19. - Stimulera PBMC i kontrollgruppen utan koncentrerade viruspartiklar i 16 timmar vid 37 °C i närvaro av monoklonala antikroppar CD28 (1 μg/ml, 1:1 000) och CD49d (1 μg/ml, 1:1 000), GolgiPlug (1 μg/ml, 1:1 000) och monensin (1 μg/ml, 1:1 000). Färga ytan med BV605-anti-CD107a (1 μg/ml, 1:1 000).
3. Ex vivo intracellulär färgning
- Samla cellsuspensionen från varje grupp i ett 1,5 ml mikrocentrifugrör, centrifugera vid 500 × g i 5 minuter vid rumstemperatur och avlägsna supernatanten med en pipett.
- Återsuspendera cellerna i 1 ml 1x PBS, tillsätt fixerbart viabilitetsfärgämne (1 μL / ml, 1: 1 000, se materialtabell) till cellsuspensionen och inkubera i 10 minuter vid rumstemperatur i mörkret. Centrifugera vid 500 × g (vid rumstemperatur) i 5 minuter och ta bort supernatanten.
- Återsuspendera cellerna i 1 ml 1x PBS. Centrifugera vid 500 × g (vid rumstemperatur) i 5 minuter. Kassera supernatanten försiktigt.
- Utför cellytemarkörfärgning.
- Återsuspendera cellerna i 100 μL 1x PBS och tillsätt 2 μL av varje ytmarkörantikropp (BV650-anti-CD3, BUV395-anti-CD4, BV421-anti-CD8, BUV737-anti-CD27 och BV480-anti-CD45RO, utspädningsfaktor: 1:50, se materialtabell) till cellsuspensionen i varje rör.
OBS: Färgfluorescerande antikroppsfärgningsprotokoll visas i tabell 1. - Inkubera rören (steg 3.4.1) i 30 minuter vid rumstemperatur och skydda dem från ljus. Centrifugera vid 500 × g i 5 min och ta bort supernatanten.
OBS: Antikroppen av BUV737-anti-CD27 och BV480-anti-CD45RO kan ersättas med BUV737-anti-CCR7 och BV480-anti-CD45RA som anteckning av minnets T-celler.
- Återsuspendera cellerna i 100 μL 1x PBS och tillsätt 2 μL av varje ytmarkörantikropp (BV650-anti-CD3, BUV395-anti-CD4, BV421-anti-CD8, BUV737-anti-CD27 och BV480-anti-CD45RO, utspädningsfaktor: 1:50, se materialtabell) till cellsuspensionen i varje rör.
- Återsuspendera cellerna i 1 ml 1x PBS. Centrifugera vid 500 × g i 5 min vid rumstemperatur. Kassera supernatanten försiktigt.
- Utför fixering och membranbrytning.
- Återsuspendera cellerna med 500 μl membranbrytande fixativ lösning (se materialtabell) och fixera cellerna i 20 minuter i mörker vid rumstemperatur. Centrifugera vid 500 × g i 5 min och ta bort supernatanten.
- Återsuspendera cellerna i 1 ml 1x PBS. Centrifugera i 5 minuter vid 500 × g vid rumstemperatur och ta försiktigt bort supernatanten.
- Utför intracellulär cytokinfärgning.
- Återsuspendera cellerna i 100 μL 1x PBS och tillsätt 2 μL av varje cytokinantikropp (FITC-anti-IFN-γ, PE-anti-TNF-α, BV785-anti-IL-2 och APC-anti-MIP-1α, utspädningsfaktor: 1:50, se materialtabell) till cellsuspensionen i varje rör.
ANMÄRKNING: Volymerna och informationen om fluoroforkonjugerade antikroppar visas i tabell 1. - Inkubera rören (steg 3.8.1) i 30 minuter vid rumstemperatur i mörker. Centrifugera vid 500 × g i 5 min och ta bort supernatanten.
- Återsuspendera cellerna i 100 μL 1x PBS och tillsätt 2 μL av varje cytokinantikropp (FITC-anti-IFN-γ, PE-anti-TNF-α, BV785-anti-IL-2 och APC-anti-MIP-1α, utspädningsfaktor: 1:50, se materialtabell) till cellsuspensionen i varje rör.
- Återsuspendera cellerna i 1 ml 1x PBS. Centrifugera vid 500 × g i 5 min vid rumstemperatur och ta försiktigt bort supernatanten. Tillsätt 500 μL 1x PBS för att återsuspendera cellerna.
4. Inställning av flödescytometri
- Isolera PBMC-provet ensamt enligt de förfaranden som beskrivs i steg 1 som kontrollprovet. Dela cellsuspensionen i 12 lika delar i 1,5 ml mikrocentrifugrör (100 μl/rör) enligt nedan.
- Ställ in ofärgad, APC-Cy7-levande / död fixerbar färgad, BV650-anti-CD3 enkelfärgad, BUV395-anti-CD4 enkelfärgad, BV421-anti-CD8 enkelfärgad, BUV737-anti-CD27 enkelfärgad, BV480-anti-CD45RO färgad, BV605-anti-CD107a, FITC-anti-IFN-γ färgad, PE-anti-TNF-α enkelfärgad, BV785-anti-IL-2 enkelfärgad och APC-anti-MIP-1α enkelfärgade prover.
- Tillsätt cellytemarkörerna och intracellulär cytokinfärgning enligt beskrivningen i steg 3. För varje enkelfärgningsprov, tillsätt endast en av fluoroforerna från färgningssteget. Tillsätt 500 μL 1x PBS för att återsuspendera cellerna och virveln med låg hastighet.
- Använd ett ofärgat prov och justera framåtspridningen (FSC), sidospridningen (SSC) och olika fluorescerande färgspänningar.
OBS: För den aktuella studien ställdes följande spänningar in. FSC: 440 V, SSC: 233 V, BV650: 575 V, APC-Cy7: 449 V, BUV395: 500 V, BV421: 402 V, BUV737: 585 V, BV480: 444 V, BV605: 457 V, FITC: 475 V, PE: 469 V, APC: 623 V och BV785: 725 V. - Använd de enstaka färgningsproverna och justera flödescytometrikompensationen för att eliminera föroreningssignalerna mellan de olika fluoroforerna.
OBS: Kompensationsparametrarna visas i tabell 2.
5. Gating strategi och dataanalys
OBS: I den aktuella studien, för denna analys, definierades de centrala minnes-T-cellerna (TCM för CD8 + eller CD4 + T-celler som CD27 + CD45RO + eller CCR7 + CD45RA- och effektorminnet T-celler (TEM) för CD8 + eller CD4 + T-celler som CD27- CD45RO + eller CCR7- CD45RA- respektive16.
- Rita en polygonport genom punktdiagrammet FSC-området (FSC-A)/SSC-området (SSC-A) för att välja den intakta lymfocytpopulationen samtidigt som skräpet exkluderas (figur 1A).
- Rita en rektangulär grind genom punktdiagrammet FSC-A/FSC-bredd (FSC-W) för att markera de enskilda cellerna (bild 1B).
- Rita en rektangulär grind genom punktdiagrammet live/dead/SSC-A för att välja de levande cellerna (figur 1C).
- Rita en rektangulär grind genom CD3/SSC-A-punktdiagrammet för att identifiera CD3+ T-cellerna (figur 1D).
- Rita en fyrkant genom CD4/CD8-punktdiagrammet för att identifiera CD4+- eller CD8+ T-cellerna (bild 1E).
- Rita en fyrkantig grind genom CD45RO/CD27-punktdiagrammet för att dela upp CD4+- eller CD8+ T-cellerna i TCM (CD27+ CD45RO+) och TEM (CD27- CD45RO+) (bild 1F-I).
- Rita grindarna till CD107a, IFN-γ, TNF-α, IL-2 och MIP-1α från TCM eller TEM i CD8 + eller CD4 + T-cellerna för att bestämma frekvensen för olika svarsmönster.
- Ladda proverna på cytometrin i följd. Använd en stoppgrind20 för att få 1 × 106 lymfocyter.
OBS: Den enskilda användaren kan samla in mer än 1 × 106 celler. Detta nummer var en kompromiss mellan den tid det tog och insamlingen av tillräckligt med celler för att ge meningsfulla resultat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 1 visar den grindstrategi som används för att dela TCM- eller TEM för CD8+ eller CD4+ T-celler från en representativ JEV-stimuleringsgrupp av JE-vaccinerade barn. FSC-A/SSC-A-punktdiagrammet används för att identifiera lymfocyter, och punktdiagrammet FSC-A/FSC-W används för att identifiera enskilda celler. Livskraftiga celler väljs på punktdiagrammet levande / döda / SSC-A. CD3/SSC-A-punktdiagrammet används för att identifiera CD3+ T-cellerna. CD4/CD8-punktdiagrammet används för att identifiera CD3+ CD4+ respektive CD3+ CD8+ T-cellerna. TCM (CD27+ CD45RO+) och TEM (CD27- CD45RO+) för CD8+- eller CD4+ T-cellerna väljs separat på punktdiagrammet CD45RO/CD27. Celler med fenotypen CD107a+, IL-2+, TNF-α+, IFN-γ+ och MIP-1α+ från CD8+ T CM (figur 1F), CD8+ T EM (figur 1G), CD4+ T CM (figur 1H) och CD4+ TEM (figur 1I) väljs separat genom att rita motsvarande rektangulära grind.
Den polyfunktionella karakteriseringen av CD4+ och CD8+ T-cellsvar i central- och effektorminne (inklusive degranulering, cytokiner och kemokiner) till JEV hos JE-vaccinerade och ovaccinerade barn visas i tabell 3. Dessa resultat indikerar att ökade nivåer av CD107a, IFN-γ, TNF-α och IL-2 upptäcktes i CD8 + TCM-cellerna hos de vaccinerade barnen efter JEV-stimulering jämfört med dem hos ovaccinerade barn. Nivån på MIP-1α skilde sig inte mellan de två grupperna. TEM-celler tros utöva antivirala effekter direkt vid restimulering med JEV. Högre nivåer av CD107a och IFN-γ upptäcktes i CD8 + TEM-cellerna i den vaccinerade gruppen under JEV-stimulering jämfört med den ovaccinerade gruppen. TNF-α, IL-2 och MIP-1α var emellertid inte signifikant förhöjda i dessa positiva celler.
JEV-antigenet inducerade framgångsrikt högre nivåer av CD107a, IFN-γ, TNF-α och MIP-1α i CD4 + TCM-cellerna i den vaccinerade gruppen jämfört med den ovaccinerade gruppen. Andelen IL-2+ celler skilde sig dock inte mellan de två grupperna under JEV-stimulering. Andelen CD107a+, IFN-γ+ och TNF-α+ delmängder av CD4+ T EM-celler i den vaccinerade gruppen var högre i närvaro av JEV än i den ovaccinerade gruppen.
Figur 1: Illustration av grindstrategin för att identifiera TCM eller TEM för CD8+ eller CD4+ T-celler och deras delmängder. (A) Lymfocyter identifierades med hjälp av punktdiagrammet FSC-A/SSC-A. (B) Enstaka celler identifierades med hjälp av punktdiagrammet FSC-A/FSC-W. (C) Levande celler identifierades med hjälp av punktdiagrammet levande/död/SSC-A. (D) CD3+ T-celler identifierades med hjälp av CD3/SSC-A-punktdiagrammet. (E) CD3+ CD4+ T- och CD3+ CD8+ T-celler identifierades med hjälp av CD4/CD8-punktdiagrammet. (F) CD8+ TCM med fenotypen CD107a+, IL-2+, TNF-α+, IFN-γ+ och MIP-1α+delades upp separat. (G) CD8 + TEM med de fem fenotyperna delades upp separat. (H) CD4 + TCM med de fem fenotyperna delades upp separat. (I) CD4 + TEM med de fem fenotyperna delades upp separat. Siffrorna på varje panel representerar procentandelen celler i grindarna. Färgkodningen representerar frekvensen av förekomst av cellerna, där rött är den högsta frekvensen och blått är det lägsta. Förkortningar: SSC-A = sidospridningsområde; FSC-A = framåtspridningsområde; FSC-W = spridningsbredd framåt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Antikroppsmål | Konjugerad fluorofor | Dosering | Klon | Isotyp | Excitation laserlinje | Ex-Max (nm) | Em-Max (nm) |
| CD3 | BV650 | 2 μl | SK7 | Mus IgG1, κ | Violett | 407 | 650 |
| CD4 | BUV395 | 2 μl | SK3 | Mus IgG1, κ | UV | 348 | 39 |
| CD8 | BV421 | 2 μl | SK1 | Mus IgG1, κ | Violett | 407 | 421 |
| CD27 | BUV737 | 2 μl | L128 | Mus IgG1, κ | UV | 350 | 737 |
| CD45RO | BV480 | 2 μl | UCHL1 | Mus IgG2a, κ | Violett | 436 | 478 |
| CCR7 | BUV737 | 2 μl | 3D12 | Råtta IgG2a, κ | UV | 350 | 737 |
| CD45RA | BV480 | 2 μl | HI100 | Mus IgG2b, κ | Violett | 436 | 478 |
| CD107a | BV605 | 2 μl | H4A3 | Mus IgG1, κ | Violett | 407 | 602 |
| IL-2 | BV785 | 2 μl | MQ1-17H12 | Råtta IgG2a, κ | Violett | 407 | 786 |
| IFN-γ | FITC | 2 μl | 4S. B3 | Mus IgG1, κ | Blå | 494 | 520 |
| TNF-α | PE | 2 μl | MAb11 | Mus IgG1, κ | Gulgrön | 496, 564 | 578 |
| MIP-1α | APC | 2 μl | 11A3 | Mus IgG2a, κ | Röd | 650 | 660 |
| Zombie NIR | APC-CY7 | 1 μL | - | - | Röd | 650 | 779 |
Tabell 1: Färgfluorescerande antikroppsfärgningsprotokoll för flödescytometriska analyser. Förkortningar: BV = lysande violett; BUV = lysande ultraviolett; FITC = fluoresceinisotiocyanat; PE = phycoerythrin; APC = allophycocyanin.
| Kompensationsreferens för flödescytometri (%) | ||||||||||||
| FITC | APC | APC-CY7 | BV421 | BV480 | BV605 | BV560 | BV785 | BUV395 | BUV737 | PE | ||
| FITC | 100 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| APC | 0 | 100 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| APC-CY7 | 0 | 0 | 100 | 0 | 0 | 0 | 0 | 65 | 0 | 44 | 0 | |
| BV421 | 0 | 0.6 | 0 | 100 | 10.5 | 3 | 15 | 3 | 0.4 | 0 | 0 | |
| BV480 | 3 | 0 | 0 | 46 | 100 | 19 | 0 | 6.1 | 0 | 0 | 0 | |
| BV605 | 0 | 0 | 0 | 3.6 | 0 | 100 | 94 | 10 | 0 | 9 | 14 | |
| BV560 | 0 | 5.5001 | 0 | 2 | 1 | 7.1 | 100 | 9 | 0 | 10 | 0 | |
| BV785 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 100 | 0 | 30 | 0 | |
| BUV395 | 0 | 0 | 0 | 1.7 | 0 | 0 | 0 | 0 | 100 | 0 | 0 | |
| BUV737 | 0 | 0 | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 3.7001 | 3 | 100 | 0 | |
| PE | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 100 | |
Tabell 2: Kompensationsparametrarna för flödescytometriska analyser. Förkortningar: BV = lysande violett; BUV = lysande ultraviolett; FITC = fluoresceinisotiocyanat; PE = phycoerythrin; APC = allophycocyanin.
| Grupp av TPF | Polyfunktionell karakterisering (%) | |||||||
| Stimulus | CD107a | IFN-γ | TNF-α | IL-2 | MIP-1α | |||
| CD8+ T-celler | TCM | Vaccinerade | JEV | 1.50±0.48 | 1,60±0,69 | 0,66±0,32 | 0,54±0,27 | 0.16±0.11 |
| Ctrl | 0,51±0,38 | 0,31±0,13 | 0.28±0.13 | 0,37±0,20 | 0,02±0,05 | |||
| Ovaccinerade | JEV | 0,38±0,19 | 0,20±0,03 | 0.19±0.09 | 0,16±0,04 | 0.19±0.09 | ||
| Ctrl | 0,50±0,28 | 0,27±0,09 | 0,19±0,05 | 0,23±0,14 | 0,08±0,11 | |||
| P-värde* | - | 0.00 | 0.00 | 0.02 | 0.01 | 0.70 | ||
| TEM | Vaccinerade | JEV | 1.47±0.58 | 1.21±0.22 | 0,49±0,36 | 0,33±0,31 | 0,24±0,17 | |
| Ctrl | 0,82±0,48 | 0,39±0,15 | 0,16±0,18 | 0,23±0,256 | 0,09±0,21 | |||
| Ovaccinerade | JEV | 0,41±0,25 | 0.14±0.09 | 0.15±0.11 | 0,20±0,07 | 0,15±0,13 | ||
| Ctrl | 0,34±0,13 | 0.21±0.15 | 0.17±0.10 | 0,19±0,19 | 0,01±0,02 | |||
| P-värde* | - | 0.01 | 0.00 | 0.08 | 0.13 | 0.36 | ||
| CD4+ T-celler | TCM | Vaccinerade | JEV | 1.55±0.43 | 1.16±0.24 | 0,57±0,25 | 0,29±0,18 | 0,19±0,07 |
| Ctrl | 0,44±0,27 | 0,26±0,20 | 0,15±0,06 | 0.12±0.06 | 0,04±0,07 | |||
| Ovaccinerade | JEV | 0,28±0,08 | 0.21±0.08 | 0.17±0.03 | 0.21±0.16 | 0.10±0.03 | ||
| Ctrl | 0,31±0,13 | 0,26±0,06 | 0.14±0.04 | 0,25±0,13 | 0,04±0,04 | |||
| P-värde* | - | 0.00 | 0.00 | 0.01 | 0.47 | 0.04 | ||
| TEM | Vaccinerade | JEV | 1.54±0.58 | 1.33±0.15 | 0,89±0,25 | 0,37±0,22 | 0.21±0.05 | |
| Ctrl | 0,46±0,49 | 0,35±0,30 | 0.13±0.08 | 0.14±0.09 | 0,05±0,11 | |||
| Ovaccinerade | JEV | 0,27±0,09 | 0.23±0.10 | 0,30±0,15 | 0,23±0,03 | 0.14±0.06 | ||
| Ctrl | 0,35±0,21 | 0.24±0.14 | 0.19±0.20 | 0.25±0.08 | 0,05±0,07 | |||
| P-värde* | - | 0.00 | 0.00 | 0.00 | 0.19 | 0.08 | ||
| * Mann–Whitney U-test, PBMC från vaccinerad individ stimulerad av JEV vs. PBMC från ovaccinerad individ stimulerad av JEV visades endast. | ||||||||
Tabell 3: Polyfunktionell karakterisering av TCM och TEM för CD4 + eller CD8 + T-cellsvar på JEV. Vaccinerad, n = 5; ovaccinerad, n = 5. Resultaten uttrycks som medelvärde ± SD. P < 0,05 indikerade en signifikant skillnad. * PBMC från vaccinerade individer stimulerade av JEV kontra PBMC från ovaccinerade individer stimulerade av endast JEV visas. Förkortningar: TPFs = polyfunktionella T-celler; IFN-γ = interferon-γ; TNF-α = tumörnekrosfaktor-α; IL-2 = interleukin-2; MIP-1α = makrofaginflammatoriskt protein-1α; TCM = centrala minnes-T-celler; TEM = effektorminne T-celler.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll representerar en genomförbar flödescytometribaserad detektionsmetod för TPF-profiler i PBMC hos barn som vaccinerats med JEV-vaccinet SA14-14-2. Denna studie använde venösa blod-PBMC från både vaccinerade och ovaccinerade barn som forskningsmaterial. Med stimulering av PBMC med JEV-antigenet kan de förstärkta antigenspecifika TPF-skarakteriseras av flerfärgad flödescytometriantikroppsfärgning. Jämfört med den konventionella enzymbundna immunospotanalysmetoden är flödescytometrins enastående fördel att presentera de funktionella egenskaperna hos PBMC på encellsnivå så mångsidigt som möjligt, vilket minskar antalet PBMC som krävs för detektion, vilket är särskilt lämpligt för barn.
En tydlig vaccinationshistorik, bibehållen cellviabilitet, stimulatorns T-cellimmunogenicitet och kompatibla färgmatchningsstrategier är kritiska steg i detta protokoll. Kina har införlivat vaccinationen av JEV SA14-14-2 i det nationella utökade immuniseringsprogrammet sedan 2008 och har inkluderat vaccinationshistoriken i enhetlig hantering, som har blivit tillgänglig för tillgängligheten av vaccinhistorien3. PBMC: erna som undersöktes i detta protokoll hölls experimentellt på is för att upprätthålla maximal cellviabilitet. Användningen av specifika stimuli har tidigare allmänt visat sig vara effektiv 4,5,21,22. Färgmatchningsstrategin är den viktigaste begränsningen i den här metoden, och användbarheten av denna strategi har presenterats i den kontinuerliga förfinings- och instrumentparametermatchningen. Dessutom tillhandahöll detta protokoll två alternativ för att kommentera minnes-T-cellerna. Genom ovanstående konfiguration och optimering av de experimentella parametrarna kan det vara möjligt att mäta specifik och till och med korsreaktiv immunitet genom att bedöma skalan och frekvensen av TPF-svar på vaccination genom flödescytometri. De fem representativa indikatorerna för att karakterisera TPFs är dock en begränsning av denna studie; de för närvarande vanliga funktionella molekylerna (CD107a, IFN-γ, TNF-α, IL-2 och MIP-1α) kan utökas för att detektera spektrumet för att mer fullständigt karakterisera mångsidigheten hos TPFs baserat på det presenterade protokollet.
JEV-infektion anses vara en sjukdom som kan förebyggas genom vaccination där vaccinationsframkallat minnes-T-cellsvar kan vara avgörande för att upprätthålla långvarigt immunskydd, särskilt eftersom antikroppssvaren avtar med tiden4. Som den huvudsakliga totipotenta skyddskomponenten i minnes-T-celler bör TPFs föreslås som ett rutinmässigt testobjekt för utvärdering av vaccinets effektivitet och omvänt vägleda utformningen och utvecklingen av riktade T-cellvacciner. Faktum är att T-cellimmunitetens roll i flavivirusinfektionskontroll alltmer uppskattas, och det kan till och med kringgå antikropparnas roll på gott och ont5. Förtydligandet av TPF-profilen kommer utan tvekan att ytterligare begränsa repertoaren för antigena epitoper, vilket kommer att minska kostnaden för vacciner genom att förbättra inriktningen. De synergistiska effekterna av CD4 + och CD8 + T-celler kompletterar varandra och är utan tvekan mer framträdande på TPFs. Därför föreslås att studier på T PF s fokuserar på(1) profilskillnader mellan lång- och kortvariga TPFs; 2. Identifiering av HTA-begränsade T PF-epitoper. och (3) utforskning och forskning av mer polyfunktionella delpopulationer.
Identifiering av TPF-celler i immunkontrollen av virusinfektion hade rapporterats23,24,25. Beskrivningen av den fullständiga detektionsstrategin och processen för TPFs har dock inte varit välorganiserad. Dessutom gäller denna metods färgschema för flera flödescytometermodeller. Markörerna kan också justeras för att upptäcka andra funktionella undergrupper baserat på denna färgmatchning.
Denna studie gav en T PF-detektionsstrategi genom att kombinera ex vivo-specifik stimulering och flödescytometri för att analysera TPF-delmängdsprofiler i PBMC: erna för JEV-vaccinmottagare. De isolerade PBMC: erna stimulerades först med JEV-antigenet och färgades sedan med motsvarande fluorescerande märkta antikroppar, och JEV-specifikt CD4 + och CD8 + minne TPFs kännetecknades av flödescytometri. Baserat på detta resultat kan T PF-frekvenserna för dubbla, tredubbla, fyrdubbla och femdubbla funktioner beräknas ytterligare för att beskriva TPF s mer detaljerat och mer omfattande. Rutinmässiga venösa blodvolymer (2 ml) hos barn har visat sig vara tillräckliga för TPF-studier. Därför förväntas detektionsmetoderna för virusspecifika TPFs användas för att utforska mått på T-cellmedierad adaptiv immunitet associerad med vaccination eller infektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
R.W. stöddes av National Natural Science Foundation of China (82002130), Beijing Natural Science Foundation of China (7222059). ZD.X. stöddes av CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (2019-I2M-5-026).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| anti-human CD28 | Biolegend | 302934 | Antibody |
| anti-human CD49d | Biolegend | 304339 | Antibody |
| APC anti-human MIP-1α | BD | 551533 | Fluorescent antibody |
| Automated cell counter | BIO RAD | TC20 | Cell count |
| BD FACSymphony A5 | BD | A5 | flow Cytometry |
| BUV395 anti-human CD4 | BD | 563550 | Fluorescent antibody |
| BUV737 anti-human CCR7 | BD | 741786 | Fluorescent antibody |
| BUV737 anti-human CD27 | BD | 612829 | Fluorescent antibody |
| BV421 anti-human CD8 | Biolegend | 344748 | Fluorescent antibody |
| BV480 anti-human CD45RA | BD | 566114 | Fluorescent antibody |
| BV480 anti-human CD45RO | BD | 566143 | Fluorescent antibody |
| BV605 anti-human CD107a | Biolegend | 328634 | Fluorescent antibody |
| BV650 anti-human CD3 | BD | 563999 | Fluorescent antibody |
| BV785 anti-human IL-2 | Biolegend | 500348 | Fluorescent antibody |
| Centrifuge Tube | BD Falcon | BD-35209715 | 15 mL centrifuge tube |
| Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Solution Kit | BD | 554714 | Cell fixation and permeabilization |
| Density gradient medium | Dakewe | DKW-KLSH-0100 | Ficoll-Paque, human lymphocyte separation medium |
| FITC anti-human IFN-γ | Biolegend | 502506 | Fluorescent antibody |
| Gibco Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | Fetal Bovine Serum |
| Gibco RPMI-1640 medium | Thermo Fisher Scientific | 22400089 | cell culture medium |
| High-speed centrifuge | Sigma | 3K15 | Cell centrifugation for 15 mL centrifuge tube |
| High-speed centrifuge | Eppendorf | 5424R | Cell centrifugation for 1.5 mL Eppendorf (EP) tube |
| Microcentrifuge tubes | Axygen | MCT-150-C | 1.5 mL microcentrifuge tube |
| PE anti-human TNF-α | Biolegend | 502909 | Fluorescent antibody |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | BI | 02-024-1ACS | PBS |
| Protein Transport Inhibitor (Containing Brefeldin A, GolgiPlug) | BD | 555029 | blocks intracellular protein transport processes |
| Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) | BD | 554724 | blocks intracellular protein transport processes |
| Round-bottom test tube | BD Falcon | 352235 | 5 mL test tube |
| Trypan Blue Staining Cell Viability Assay Kit | Beyotime | C0011 | Trypan Blue Staining |
| Zombie NIR Fixable Viability Dye | Biolegend | 423106 | Dead cell stain |
References
- Vanden Eynde, C., Sohier, C., Matthijs, S., De Regge, N. Japanese encephalitis virus interaction with mosquitoes: A review of vector competence, vector capacity and mosquito immunity. Pathogens. 11 (3), 317 (2022).
- Wang, R., et al. The epidemiology and disease burden of children hospitalized for viral infections within the family Flaviviridae in China: A national cross-sectional study. PLoS Neglected Tropical Diseases. 16 (7), 0010562 (2022).
- Wang, R., et al. Decreases in both the seroprevalence of serum antibodies and seroprotection against Japanese encephalitis virus among vaccinated children. Virologica Sinica. 34 (3), 243-252 (2019).
- Wang, R., et al. Neutralizing antibody rather than cellular immune response is maintained for nearly 20 years among Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccinees in an endemic setting. Infection, Genetics and Evolution. 85, 104476 (2020).
- Wang, R., et al. T cell immunity rather than antibody mediates cross-protection against Zika virus infection conferred by a live attenuated Japanese encephalitis SA14-14-2 vaccine. Applied Microbiology and Biotechnology. 104 (15), 6779-6789 (2020).
- Redant, V., Favoreel, H. W., Dallmeier, K., Van Campe, W., De Regge, N. Japanese encephalitis virus persistence in porcine tonsils is associated with a weak induction of the innate immune response, an absence of IFNgamma mRNA expression, and a decreased frequency of CD4(+)CD8(+) double-positive T cells. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 12, 834888 (2022).
- Jain, N., et al. CD8 T cells protect adult naive mice from JEV-induced morbidity via lytic function. PLoS Neglected Tropical Diseases. 11 (2), 0005329 (2017).
- Khakhum, N., Bharaj, P., Walker, D. H., Torres, A. G., Endsley, J. J. Antigen-specific antibody and polyfunctional T cells generated by respiratory immunization with protective Burkholderia DeltatonB Deltahcp1 live attenuated vaccines. NPJ Vaccines. 6 (1), 72 (2021).
- Weaver, J. M., et al. Increase in IFNgamma(-)IL-2(+) cells in recent human CD4 T cell responses to 2009 pandemic H1N1 influenza. PloS One. 8 (-), 57275 (2013).
- Boaz, M. J., Waters, A., Murad, S., Easterbrook, P. J., Vyakarnam, A. Presence of HIV-1 Gag-specific IFN-gamma+IL-2+ and CD28+IL-2+ CD4 T cell responses is associated with nonprogression in HIV-1 infection. Journal of Immunology. 169 (11), 6376-6385 (2002).
- Gui, L., et al. IL-2, IL-4, IFN-gamma or TNF-alpha enhances BAFF-stimulated cell viability and survival by activating Erk1/2 and S6K1 pathways in neoplastic B-lymphoid cells. Cytokine. 84, 37-46 (2016).
- Terahara, K., et al. Vaccine-induced CD107a+ CD4+ T cells are resistant to depletion following AIDS virus infection. Journal of Virology. 88 (24), 14232-14240 (2014).
- Tanyi, J. L., et al. Personalized cancer vaccine strategy elicits polyfunctional T cells and demonstrates clinical benefits in ovarian cancer. NPJ Vaccines. 6 (1), 36 (2021).
- Ammirati, E., et al. Effector memory T cells are associated with atherosclerosis in humans and animal models. Journal of the American Heart Association. 1 (1), 27-41 (2012).
- Rizk, N. M., Fadel, A., AlShammari, W., Younes, N., Bashah, M. The immunophenotyping changes of peripheral CD4+ T lymphocytes and inflammatory markers of class III obesity subjects after laparoscopic gastric sleeve surgery - A follow-up study. Journal of Inflammation Research. 14, 1743-1757 (2021).
- Zhang, Y., et al. Phenotypic and functional characterizations of CD8(+) T cell populations in malignant pleural effusion. Experimental Cell Research. 417 (1), 113212 (2022).
- Shin, H., Iwasaki, A.
- Birnie, K. A., Noel, M., Chambers, C. T., Uman, L. S., Parker, J. A. Psychological interventions for needle-related procedural pain and distress in children and adolescents. Cochrane Database of Systematic Reviews. 10 (10), (2018).
- Lin, R. J., Liao, C. L., Lin, Y. L. Replication-incompetent virions of Japanese encephalitis virus trigger neuronal cell death by oxidative stress in a culture system. Journal of General Virology. 85, 521-533 (2004).
- Byford, E., Carr, M., Pinon, L., Ahearne, M. J., Wagner, S. D. Isolation of CD4+ T-cells and analysis of circulating T-follicular helper (cTfh) cell subsets from peripheral blood using 6-color flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (143), e58431 (2019).
- Zheng, X., et al. Immune responses and protective effects against Japanese encephalitis induced by a DNA vaccine encoding the prM/E proteins of the attenuated SA14-14-2 strain. Infection, Genetics and Evolution. 85, 104443 (2020).
- Zheng, X., et al. Complete protection for mice conferred by a DNA vaccine based on the Japanese encephalitis virus P3 strain used to prepare the inactivated vaccine in China. Virology Journal. 17 (1), 126 (2020).
- Lam, J. K. P., et al. Emergence of CD4+ and CD8+ polyfunctional T cell responses against immunodominant lytic and latent EBV antigens in children with primary EBV infection. Frontiers in Microbiology. 9, 416 (2018).
- Meckiff, B. J., et al. Imbalance of regulatory and cytotoxic SARS-CoV-2-reactive CD4(+) T cells in COVID-19. Cell. 183 (5), 1340-1353 (2020).
- Ning, R. J., Xu, X. Q., Chan, K. H., Chiang, A. K. Long-term carriers generate Epstein-Barr virus (EBV)-specific CD4(+) and CD8(+) polyfunctional T-cell responses which show immunodominance hierarchies of EBV proteins. Immunology. 134 (2), 161-171 (2011).
