Se presenta un protocolo para el aislamiento y enriquecimiento conveniente y de alto rendimiento de tricomas glandulares capitados y sésiles de Cannabis sativa. El protocolo se basa en una extracción seca y sin tampón de tricomas utilizando solo nitrógeno líquido, hielo seco y tamices de nylon y es adecuado para la extracción de ARN y el análisis transcriptómico.
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Artículo de método
Aislamiento no acuoso y enriquecimiento de tricomas glandulares capitados y sésiles de Cannabis sativa
En este artículo
Resumen
Resumen
Este documento presenta un protocolo para el aislamiento y enriquecimiento conveniente y de alto rendimiento de tricomas glandulares capitados y sésiles de Cannabis sativa. Las vías biosintéticas para el metabolismo de los cannabinoides y los terpenos volátiles se localizan principalmente en los tricomas del cannabis , y los tricomas aislados son beneficiosos para el análisis del transcriptoma. Los protocolos existentes para aislar tricomas glandulares para la caracterización transcriptómica son inconvenientes y proporcionan cabezas de tricomas comprometidas y una cantidad relativamente baja de tricomas aislados. Además, dependen de aparatos costosos y medios de aislamiento que contienen inhibidores de proteínas para evitar la degradación del ARN. El presente protocolo sugiere combinar tres modificaciones individuales para obtener una gran cantidad de tricomas glandulares capitados y sésiles aislados de inflorescencias femeninas maduras de C. sativa y hojas de abanico, respectivamente. La primera modificación consiste en sustituir el nitrógeno líquido por el medio de aislamiento convencional para facilitar el paso de tricomas a través de los microtamices. La segunda modificación consiste en usar hielo seco para separar los tricomas de la fuente vegetal. La tercera modificación consiste en pasar el material vegetal consecutivamente a través de cinco micro-tamices de tamaños de poro decrecientes. Las imágenes microscópicas demostraron la efectividad de la técnica de aislamiento para ambos tipos de tricomas. Además, la calidad del ARN extraído de los tricomas aislados fue apropiada para el análisis transcriptómico posterior.
Introducción
Los tricomas glandulares son estructuras similares a pelos presentes en las plantas que contienen muchos metabolitos secundarios1 y representan un valioso banco de nuevos genes biosintéticos y enzimas2. En el cannabis, la biosíntesis de los metabolitos secundarios importantes, los cannabinoides3 y los terpenos4, se localiza en los tricomas. Teniendo en cuenta el papel de los tricomas en la determinación de la calidad del cannabis tanto para usos medicinales como recreativos, el estudio de la expresión génica de tricomas es de interés. Para caracterizar la ....
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Protocolo
NOTA: El material vegetal utilizado en este estudio consistió en cuatro cepas de C. sativa ARO-Volcani (CS-11, CS-12, CS-13 y CS-14) que se cultivaron en el Centro Volcani, Israel, como se describe en otra parte11. Los tricomas glandulares capitados tallados se aislaron de inflorescencias de floración maduras, y los tricomas sésiles capitados glandulares se aislaron de grandes hojas de abanico de plantas madre maduras sin flores. Todo el material vegetal fue recogido e inmediatamente almacenado a -80 °C.
PRECAUCIÓN: El hielo seco y LN se utilizan en todo el protocolo. Estas sustancias son extremadamente peli....
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Resultados
La principal modificación incluida en este protocolo en comparación con los protocolos convencionales de aislamiento de tricomas es sustituir el medio de aislamiento estándar por LN. El uso de LN como medio de aislamiento permite un flujo de trabajo relajado, porque mientras las muestras estén sumergidas en LN, no es probable que ocurra degradación metabólica. Además, como el protocolo evita los componentes peligrosos (es decir, ácido aurintricarboxílico y β-mercaptoetanol) utilizados en el medio tradicional de aislamien.......
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Discusión
En comparación con los protocolos de aislamiento de tricomas actualmente disponibles, en el presente protocolo se describen dos modificaciones principales. Estos incluyen el desprendimiento de los tricomas del material vegetal utilizando hielo seco en el paso inicial y la sustitución de LN por el medio tampón líquido comúnmente utilizado. La primera modificación para la purificación de tricomas de C. sativa se basa en un protocolo anterior que introdujo el uso de hielo seco picado para separar los tricomas de lo.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses.
Agradecimientos
Los autores reconocen el apoyo financiero de CannabiVar Ltd. Todo el material vegetal fue generosamente proporcionado por el profesor Hinanit Koltai del Centro Volcani, Israel.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Bioanalizador RNA Pico 6000 chip | Agilent, Alemania | Número de pedido 5067-1513 | Sistema Lab-on-a-chip |
| Transsonic-310 | Elma, Alemania | D-78224 | Unidad de limpieza ultrasónica |
| Kit de preparación de muestras de ARN TruSeq v2 | Illumina, EE. UU | RS-122-2001 Preparación de | muestras para la biblioteca de secuenciación de ARN |
| Kit de ARN total de la planta de espectro | SIGMA-ALDRICH, EE. UU. | de planta STRN50-1KT | |
| Microtamiz de nylon con un tamaño de malla de 350 y micro; m (40 x 40 cm o más grande que la circunferencia del tamiz de harina) | Sinun Tech, Israel | r0350n350210 | Nylon apertura de la pantalla |
| Microtamiz de nailon con tamaño de malla de 150 y micro; m (tamaño de 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0150n360465 | Nylon apertura de la pantalla |
| Microtamiz de nylon con tamaño de malla ø 105 y micro; m (tamaño de 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0105n320718 | Nylon apertura de la pantalla |
| Microtamiz de nylon con tamaño de malla ø 80 y micro; m (tamaño de 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon apertura de la pantalla |
| Microtamiz de nylon con tamaño de malla ø 65 y micro; m (tamaño de 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0065n340715 | Nylon apertura de la pantalla |
| Microtamiz de nylon con tamaño de malla ø 50 y micro; m (tamaño de 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon Apertura de la pantalla |
| Hasta 10 g de material vegetal congelado (almacenado en -80 oC o nitrógeno líquido) | |||
| Guantes adecuados para manejar bajas temperaturas | |||
| Gafas de | |||
| Puerta mosquitera de 1 mm (mosquitera) Malla (tira de 30 x 100 cm) | |||
| Colador grande (colador) con agujeros de aproximadamente 5 mm | |||
| Vaso de precipitados | |||
| 1 bloque de hielo seco (0,5-1 kg) | |||
| Martillo y objeto | |||
| Dos recipientes | |||
| L Bandas | |||
| Tamiz de harina grande o colador de tamiz, preferiblemente uno con un anillo de plástico desmontable en la circunferencia | |||
| Varios contenedores de acero inoxidable de fondo redondo grandes y pequeños. Uno de ellos debe ser más grande que la circunferencia del tamiz de harina (aproximadamente 40 cm de diámetro), para minimizar la pérdida de la masa tamizada fuera del recipiente | |||
| Cuchara, espátula y cuchara | |||
| Plato | |||
| Varias pinzas para | |||
| la ropaTubos de 1,5 ml etiquetados previamente enfriados (a través de nitrógeno líquido) con agujeros en la tapa con una aguja | |||
| Dos recipientes de nitrógeno | |||
| Pincel |
Referencias
- Schilmiller, A. L., Last, R. L., Pichersky, E. Harnessing plant trichome biochemistry for the production of useful compounds. Plant Journal for Cell & Molecular Biology. 54 (4), 702-709 (2008).
- Liu, Y., Jing, S. X., Luo, S. H., Li, S. H.
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Reimpresiones y permisos
