Summary
Ett protokoll presenteras för bekväm och hög genomströmningsisolering och anrikning av glandular capitate stalkade och sessila trikomer från Cannabis sativa. Protokollet är baserat på en torr, icke-buffertextraktion av trikomer med endast flytande kväve, torris och nylonsiktar och är lämplig för RNA-extraktion och transkriptomisk analys.
Abstract
Detta dokument presenterar ett protokoll för bekväm och hög genomströmningsisolering och anrikning av glandulär kapitit stjälkad och sessil trikomer från Cannabis sativa. De biosyntetiska vägarna för cannabinoid och flyktig terpenmetabolism är lokaliserade främst i Cannabis trichomes, och isolerade trikomer är fördelaktiga för transkriptomanalys. De befintliga protokollen för isolering av glandulära trikomer för transkriptomisk karakterisering är obekväma och levererar komprometterade trikomhuvuden och en relativt låg mängd isolerade trikomer. Dessutom förlitar de sig på dyra apparater och isoleringsmedier som innehåller proteinhämmare för att undvika RNA-nedbrytning. Det nuvarande protokollet föreslår att man kombinerar tre individuella modifieringar för att erhålla en stor mängd isolerade glandulära kapitita stjälkade och sessila trikomer från C. sativa mogna kvinnliga blomställningar respektive fläktblad. Den första modifieringen innebär att det konventionella isoleringsmediet ersätts med flytande kväve för att underlätta passagen av trikomer genom mikrosiktarna. Den andra modifieringen innebär att man använder torris för att lossa trikomerna från växtkällan. Den tredje modifieringen innebär att växtmaterialet leds i följd genom fem mikrosiktar med minskande porstorlekar. Mikroskopisk avbildning visade effektiviteten av isoleringstekniken för båda trikomtyperna. Dessutom var kvaliteten på RNA extraherad från de isolerade trikomerna lämplig för transkriptomisk analys nedströms.
Introduction
Glandulära trikomer är hårliknande strukturer som finns i växter som innehåller många sekundära metaboliter1 och representerar en värdefull bank av nya biosyntetiska gener och enzymer2. I cannabis är biosyntesen av de viktiga sekundära metaboliterna, cannabinoider3 och terpener4, lokaliserad i trikomerna. Med tanke på trikomernas roll för att bestämma kvaliteten på cannabis både för medicinska och rekreationella användningsområden är studien av trichome-genuttryck av intresse. För att karakterisera uttrycket av trikomspecifika gener måste trikomerna av intresse först isoleras. Trichome-isoleringsprotokoll beskrevs först så tidigt som 19925, och deras senaste utveckling har nyligen granskats2. I allmänhet kan protokoll för extraktion av glandulära trikomer för transkriptomisk karakterisering delas in i två distinkta sekventiella steg. Det första steget innebär en grundlig fysisk separation av trikomerna från växtvävnaden. Detta steg kan utföras genom att använda torris5, glaspärlor med en kommersiell apparat6,7, slipa växtmaterialet mot en masksikt8 eller virvla växtvävnaden i en isoleringsbuffert9. Det andra steget innebär en mer förfinad separation av trikomerna av intresse från de mikroskopiska växtresterna och / eller andra trikomtyper. Detta steg kan utföras med densitetsgradientcentrifugering 8,10 eller siktar av olika storlekar 7,9. På grund av den extrema känsligheten hos RNA i bearbetade vävnader för nedbrytande medel utförs dessa två sekventiella steg vanligtvis i det iskalla isoleringsmediet, ofta i närvaro av proteinhämmare4.
Konventionella trichome-isoleringsprotokoll kräver, förutom de iskalla temperaturerna, stora mängder isoleringsmedium för att säkerställa ett effektivt extraktionsförfarande. Kombinationen av dessa komponenter resulterar i en mödosam, tidskrävande isoleringsprocess som hindrar hög genomströmning. Att presentera ett enkelt, användarvänligt alternativt trichomeisoleringsprotokoll är därför sannolikt fördelaktigt för olika aspekter i samband med trichome-karakterisering. Detta dokument syftar till att erbjuda ett alternativt protokoll för att isolera stalkade och sittande glandulära kapitita trikomer från Cannabis sativa genom att kombinera och integrera flera element från de konventionella protokollen. Dessa element inkluderar torris5, trikomernas passage genom flera mikrosiktar med minskande porstorlekar 7,9 och ersättning av flytande kväve (LN) för isoleringsmediet8.
Nyheten i det nuvarande trichome-isoleringsprotokollet, jämfört med konventionella protokoll, presenteras på ett antal sätt. Detta protokoll är bekvämt eftersom det inte kräver farliga komponenter. Förfarandet kan utföras i labbet med minimala försiktighetsåtgärder och underlättar hög genomströmning. Att ersätta LN för det vanliga vätskeisoleringsmediet säkerställer trikomernas integritet under hela isoleringsprocessen, vilket möjliggör efterföljande transkriptomisk analys. Vid sublimering av LN och torris lämnas de isolerade trikomerna fria från skadliga rester. Vidare tillåter benägenheten hos LN att sublimera vid rumstemperatur dess generösa användning genom hela protokollet. Däremot genererar användningen av stora volymer konventionellt isoleringsmedium praktiska svårigheter vid hanteringen. Slutligen minskar protokollet separationen av skivcellen från den återstående bräckliga huvudstrukturen i glandulär trikom, vilket möjliggör kvarhållandet av huvudutrymmet.
Detta protokoll presenteras på ett detaljerat steg-för-steg-sätt som är utformat för att hjälpa den tekniska praxisen att isolera C. sativa glandular capitate trichomes. Protokollet ger ett hanterbart arbetsflöde som resulterar i isolerade trikomer med hög koncentration och renhet som är lämpliga för molekylär analys nedströms.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Växtmaterialet som användes i denna studie bestod av fyra C. sativa ARO-Volcani-stammar (CS-11, CS-12, CS-13 och CS-14) som odlades i Volcani Center, Israel, som beskrivs någon annanstans11. Glandular capitate stalkade trichomes isolerades från mogna blommande blomställningar, och glandular capitate sessile trichomes isolerades från stora fläktblad från mogna icke-blommande moderplantor. Allt växtmaterial plockades nyligen och lagrades omedelbart vid -80 °C.
VARNING: Torris och LN används i hela protokollet. Dessa ämnen är extremt farliga. De isolerade trikomerna kan innehålla torrispartiklar som kan skapa farligt gastryck när de sätts in i förseglade rör; Därför bör alla lock vara nålpunkterade. Användning av skyddsglasögon, lämpligt laboratorieslitage och handskar för hantering vid extremt låga temperaturer rekommenderas starkt.
1. Inställning för den första separationen av trikomer från växtmaterialet
- Krossa ett torrisblock i små fina flingor med en hammare och ett hårt platt föremål i en 5 L plastbehållare.
- Sikta de fina torrisflingorna (mindre än 5 mm) från den icke-krossade torrisen med en stor sil (via porer mindre än 5 mm) i en annan 5 L plastbehållare. Häll ca 200 cm3 (200 ml markering) av torrisflingorna i en upprätt 1 L glasbägare.
- Tillsätt upp till 10 g frysta C. sativa blomställningar (från och med nu kallat växtmaterial) på det första lagret krossad torris och täck med ytterligare ett lager av 200 cm3 finkrossad torris.
- Täck öppningen på 1 L glasbägare med två till tre lager 1 mm myggnät för skärmdörrar och fäst den på glaskoppens yttre sidor med gummiband (figur 1).
- Häll LN i en stor rundbottnad behållare av rostfritt stål (se materialförteckning), där de isolerade trikomerna kommer att samlas in.
- För in en maskstorlek på 350 μm i en sil av mjöl för att täcka mjölsiktnätet underifrån (figur 2). Om det finns en mjölsikt med en löstagbar plastring sätts den in med en maska på 350 μm så att den fästs under mjölsiktens nät. Om inte, säkra maskan på 350 μm vid mjölsiktens omkrets med gummiband.
- Placera mjölsikten ovanför den stora rundbottnade behållaren av rostfritt stål fylld med LN (figur 3). Se till att behållarens bredd överstiger mjölsiktens för att minimera förlusten av den siktade massan utanför behållaren av rostfritt stål med rundbotten.
2. Separation av trikomer från växtmaterialet
- Skaka 1 L-glaset med öppningen pekande nedåt mot mjölsikten som om du använde en stor saltskakare (figur 4).
- Lägg åt sidan 1 L glasbägare var 2-3: e minut för att möjliggöra siktning av krossad torris och växtmaterial som ackumulerats på mjölsikten.
- Sikta mjölsikten horisontellt för att underlätta växtmaterialets passage in i LN i den runda botten rostfria stålbehållaren nedan.
- Tillsätt LN i behållaren av rostfritt stål och krossad torris i 1 L glasbägaren när nivåerna börjar ta slut. Fyll på det använda växtmaterialet i glasbägaren med ytterligare 10 g färskt växtmaterial när växtmaterialet på mjölsikten är utarmat. Uppfyllningen behöver vanligtvis inte upprepas mer än två gånger.
- Upprepa steg 2.1-2.4 tills en tillräcklig mängd anrikade trikomer har samlats i behållaren av rostfritt stål med rund botten. I allmänhet är 20 g färskt växtmaterial tillräckligt för RNA-extraktion och transkriptomanalys.
- Kontrollera att det finns ett vitt pulverliknande ämne (bestående av växtskräp, glandulära trikomer och krossad torris) i botten av behållaren av rostfritt stål nedsänkt i LN. En mikroskopisk observation hjälper till att avgöra om en tillräcklig mängd trikomer har samlats in; Det här steget kan dock hindra protokollets flöde. Vanligtvis räcker 10-20 g initialt växtmaterial för de flesta isoleringar; Det kan dock finnas skillnader i växternas trikomdensitet.
Från och med nu kan experimentet pausas och startas om senare. Om det pausas under en kort tid bör tillräckliga mängder LN läggas till så att trikomerna förblir nedsänkta. Alternativt kan trikomerna samlas in och förvaras vid −80 °C i upp till 3 månader för senare användning, enligt beskrivningen i steg 5.
3. Separation av glandulära kapita trichomes (stalkade och sessila) från andra trikomtyper, såsom bulbous och cystolithic trichomes, och skräp
- Tillsätt en liten mängd LN till en ren liten rundbottnad behållare av rostfritt stål.
- Vik en mikrosikt på 40 x 40 cm med en maskstorlek på 150 μm två gånger för att få en vikning på 20 x 20 cm och öppna den. Se till att den liknar en konliknande form (figur 5).
- Fäst nätkonen på kanten av den runda botten rostfria stålbehållaren med en eller två klädnypor så att den öppnade delen av konen är upprätt och dess spetsiga del är delvis nedsänkt i LN.
- Häll försiktigt LN och det vita pulverliknande ämnet från steg 2.6 i mikrosiktkonen.
- Applicera försiktigt en bred borste för att samla och överföra eventuellt kvarvarande växtmaterial från den första behållaren till 150 μm maskkonen.
- Tillsätt mer LN i den första behållaren och upprepa borstningsrörelsen tills allt växtmaterial överförs till mikrosiktkonen.
- Lossa försiktigt klädnypan från behållarens lock och öppna mikrosiktkonen så att trikomerna ligger i mitten av den öppnade mikrosikten. Håll ihop mikrosiktens alla fyra hörn så att den mellersta delen som innehåller trikomerna förblir nedsänkt i LN (figur 6).
- Medan du håller alla fyra hörnen av mikrosikten, doppa och skaka försiktigt mikrosikten i LN i stålbehållaren som om du infunderar en tepåse. Fortsätt denna doppning/skakning (vertikal och horisontell) rörelse i 1 min. Det finns en kompromiss mellan isoleringskvalitet och kvantitet. Längre doppningsrörelser kan resultera i större mängder trikomer, men deras isoleringsgrad kan vara sämre. Sammantaget rekommenderas 1 min som tillräcklig för både kvalitet och kvantitet.
OBS: Denna siktningsrörelse är den mest kritiska delen av protokollet och bör utföras i enlighet därmed. - Valfritt: Skopa det icke-siktade växtskräpet och större trikomer (fortfarande nedsänkt i LN) som är inslagna i mitten av mikrosikten i ett 13 ml eller 50 ml provrör och förvara vid -80 ° C för framtida användning.
VARNING: För att undvika uppbyggnad av tryckgas (från torris och LN-rester), punktera ett hål i provrörets lock med en steriliserad nål. Locket kan bytas ut när trycket har minskat, vilket vanligtvis är efter 24 timmar.
4. Passerar trikomer genom mikrosiktar med minskande porstorlek
- Överför de siktade trikomerna nedsänkta i LN i botten av den lilla rundbottnade behållaren av rostfritt stål sekventiellt genom mikrosiktar med minskande porstorlekar (105 μm, 80 μm, 65 μm och 50 μm), på samma sätt som presenteras i steg 3.
5. Insamling av önskade trikomer
- Ta bort önskade trikomer nedsänkta i LN och lindade in i 50 μm mikrosikten med en förkyld (i LN) sked. Lägg dem på en ren tallrik.
OBS: I detta sista isoleringssteg samlas de önskade trikomerna från sikten. - Överför snabbt de pulverliknande trikomerna till ett märkt förkylt 1,5 ml rör via en förkyld spatel eller en skopa insatt i röret (figur 7). Förvara rören omedelbart vid −80 °C för vidare studier.
Ett schematiskt arbetsflödesschema som visar hela isoleringsprotokollet visas i figur 8.
6. Observation och analys av de renade trikomerna
- Placera en liten mängd (10 mg) isolerade trikomer på ett mikroskopglas med en förkyld (via LN) spatel. Tillsätt en droppe vatten och observera direkt på ett ljusmikroskop utan färgning. Utvärdera den övergripande isolerings- och föroreningsgraden med låga (10x) och höga (40x) förstoringar. Anrikning uppskattas visuellt av den relativa mängden trikomer med avseende på icke-trikomvävnad, som visas i figur 9.
- Utför RNA-extraktion och kvalitetsanalys från 50 mg isolerad C. sativa , glandulär kapitit, stjälkad och sessil trikomer.
OBS: Ett kommersiellt extraktionskit (se materialförteckning) som använder en poly-A-baserad strategi för mRNA-rening användes för RNA-extraktionen.- Resuspendera 50 mg av de isolerade trikomerna i lyslösningen, virvel i 30 s, ultraljudsbehandling i en iskall ultraljudsrengöringsenhet vid 35 kHz i 5 minuter och extrahera mRNA från proverna enligt tillverkarens protokoll (se materialförteckning).
- För att uppskatta integriteten hos RNA extraherat från trikomerna, bestäm RNA-koncentrationen, den totala mängden och RNA-integritetsnummervärdena (RIN) med hjälp av ett lab-on-a-chip-system (se materialtabell).
- Utför RNAseq-analys av trikomfraktionerna (valfritt). RNAseq-analys och bioinformatikanalyser av sekvenserade läsningar kan utföras av standard outsourcingtjänster
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den huvudsakliga modifieringen som ingår i detta protokoll jämfört med konventionella trichomeisoleringsprotokoll ersätter standardisoleringsmediet med LN. Att använda LN som ett isoleringsmedium möjliggör ett avslappnat arbetsflöde, eftersom så länge proverna är nedsänkta i LN är det inte troligt att metabolisk nedbrytning uppstår. Eftersom protokollet dessutom undviker de farliga komponenterna (dvs. aurintrikarboxylsyra och β-merkaptoetanol) som används i traditionella trikomisoleringsmedium, är arbetet inte begränsat till en kemisk huva. Det är dock viktigt att vidta nödvändiga försiktighetsåtgärder vid hantering av torris och LN.
För att bedöma fördelarna med detta protokoll jämfördes trikomisoleringsresultaten från detta protokoll med de som erhölls med användning av ett konventionellt trikomisoleringsförfarande (som använde en vattenhaltig buffert, glaspärlor och en fin sil för trikomisolering)12, ursprungligen med hjälp av ett ljusmikroskop. En jämförelse av komponenterna från olika isoleringsfaser via ljusmikroskopinspektion illustrerar den ökande trikomisoleringsgraden när isoleringsprocessen fortskrider. I det inledande skedet av isoleringsprocessen (105–150 μm mikrosikt) dominerade bitar av bladvävnad i den isolerade delen (figur 9A), i motsats till den slutliga isoleringsprodukten, som nästan helt bestod av isolerade trikomer (figur 9C). Försiktighet bör iakttas för att validera att de isolerade proverna är kontamineringsfria (figur 9B).
Även om trikomdensiteten inte kvantifierades i denna studie, kan kvaliteten på de isolerade glandulära kapitita förföljda och sittande trikomerna i det slutliga isoleringssteget observeras i figur 10. Renheten kan jämföras med den som erhålls med trikomisolering med ett konventionellt protokoll12 (figur 10C). I det nuvarande protokollet behålls den känsliga stalkade trichomehuvudstrukturen och hela huvudet på den isolerade stalkade trichome är synliga (figur 10D), medan med det konventionella protokollet saknas hela trichomehuvudstrukturen och endast skivcellerna är närvarande (figur 10E). Utbytet kan också ökas kraftigt eftersom användningen av torris och LN undanröjer gränsen för växtmaterial som kan extraheras. En ytterligare fördel med vårt icke-vattenhaltiga protokoll är att det endast använder torris och LN, och därför finns inga kvarvarande komponenter i isoleringsmediet kvar när de avdunstar. Användning av LN förhindrar frisättning av klibbiga sekundära metaboliter som kan leda till aggregering av trikomerna13. I det nuvarande protokollet återvanns de isolerade trikomerna i det slutliga isoleringssteget som ett torrt fint pulver.
De extremt låga temperaturer som upprätthålls genom hela detta protokoll kommer sannolikt att räcka för att uppfylla målen för konventionella buffertmedier som förhindrar RNA-nedbrytning (så länge proverna hålls under vatten) och underlättar molekylära tillämpningar nedströms. För att validera detta antagande extraherade vi RNA från de isolerade trikomerna och uppskattade RNA-integriteten med hjälp av kommersiellt tillgängliga kit. De erhållna höga RIN-värdena (9,4 till 10) och distinkt gelkromatografi (figur 11) indikerar tydligt en hög RNA-integritet. RNA-proverna analyserades vidare med RNAseq och >20 M högkvalitativa läsningar erhölls från alla bibliotek.
För att validera att mRNA från den isolerade trikomfraktionen verkligen är anrikad i trikomuttryckta gener, jämförde vi våra genuttrycksresultat för blomställningen och motsvarande isolerade stjälkade trikomer med tidigare resultat som presenterades av Livingston et al.14, som karakteriserade genuttrycket av renade trikomer av cannabis (anpassat från deras kompletterande tabell 1 ). Deras protokoll bestod av blandning i vattenhaltig buffert, filtrering genom siktar och slutligen trikomrening med användning av en Percoll-gradient. Trikomuttryckta gener karakteriserades som de mest korrelerade (p > 0,95) med genuttrycket av cannabidiolsyrasyntas (CBDAS), en trikomspecifik genmarkör14. Jämförelsen av genuttryck mellan de resultat som erhållits med detta protokoll och de som presenteras i Livingston et al.14 visar att de 12 mest anrikade generna i vår trikomfraktion också anrikades i Livingston et al. studie 14, inklusive trichomemarkörgenen CBDAS (tabell 1). I synnerhet erhölls en betydligt högre anrikningsgrad från det nuvarande protokollet. Dessa resultat bekräftar giltigheten av detta protokoll för studier av trikomberikat genuttryck.
Dessutom jämförde vi uttrycksdata för fem aktinggener av cannabis, eftersom aktin ofta används som referensgen för transkriptomstudier (tabell 2). Våra resultat för både isolerade stalkade och sessila trikomer var jämförbara med de som rapporterades av Livingston et al. studie14.
Slutligen beräknade vi expressions- och trikomanrikningsdata för klorofyll a-b-bindande proteinfamiljegener, som förmodligen inte är trikomanrikade (tabell 3). Faktum är att de 12 medlemmarna i denna genfamilj visade en trikomanrikningsfaktor på <1, som fungerade som en negativ kontroll för trikomanrikning. Dessa kombinerade resultat indikerar de unika uttrycksmönstren för blomställningen och isolerade trikomfraktioner och stöder trikomintegriteten och kvaliteten hos den isolerade trikomfraktionen.
Figur 1: Inställning för laddning av 1 L glasbägare. Dörrnätet på 1 mm är fäst vid glasbägarens sidor med några gummiband (visas inte). 1 L glasbägaren ska belastas i upprätt läge. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Inställning av mjölsikten. Mjölsikten är försedd med en 350 μm mikrosikt via gummiband i botten (visas inte). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Inställning av det första steget i trikomisolering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Inställning av glasbägaren. Glasbägaren försedd med tre lager 1 mm skärmdörr (mygga) nät säkrat med gummiband vid öppningen. Bägarens öppning pekar nedåt. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Inställning av mikrosiktkonstrukturen som används för trikomisolering. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Inställning för doppnings- och skakningsrörelse hos mikrosikten som innehåller isolerade trikomer. Den horisontella/vertikala rörelsen ska likna en tepåseinfusion. Inställningen är identisk för varje maskstorlek som används. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Inställning för överföring av de slutliga isolerade trikomerna. De slutliga isolerade trikomerna överförs till ett märkt 1,5 ml rör. Alla redskap ska förkylas med LN. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 8: Flödesschema som beskriver protokollet. Isoleringen av glandulära kapita trichomes från C. sativa innefattar tre steg: (1) den initiala avskiljningen av trikomerna från växtkällan och passage via två siktar (1 mm och 350 μm), (2) passage av växtmaterialet via fem mikrosiktar med minskande porstorlekar (150 μm, 105 μm, 80 μm, 65 μm och 50 μm) och (3) insamling av de isolerade trikomerna i ett förkylt 1,5 ml rör. Kvarhållen vävnad från något av mikrosiktningsstadierna kan på liknande sätt samlas in. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 9: Mikroskopibilder av de isolerade trikomerna med det aktuella protokollet. (A,B,C) Glandular capitate sessile trichomes från C. sativa fläktblad. a) Mellanisolering från mikrosiktar med porstorlekar mellan 105 μm och 150 μm. Observera kvarhållandet av stora mängder grönt, icke-trikommaterial. b) Slut på isoleringen från mikrosiktar med porstorlekar mellan 50 μm och 65 μm, kontaminerad med växtkällan (röd pil), och C) fri från kontaminering. Skalstreck = (A) 100 μm, (B,C) 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 10: Mikroskopibilder av de isolerade trikomerna. (A,B) Glandular capitate trichomes från C. sativa: (A) stalkad typ, isolerad med det aktuella protokollet, och (B) sittande typ, isolerad med det aktuella protokollet. (C) Stalkade trikomer isolerade med ett konventionellt protokoll. Det låga utbytet och bristen på kompromisslösa huvuden på trikomerna är uppenbara. (D,E) Stalkade glandulära kapita trikomer isolerade med (D) det nuvarande protokollet och (E) det konventionella protokollet. F) Glandulära stjälkade trikomer isolerade från 65 μm till 105 μm mikrosiktar (närbild). Observera den höga isoleringen av stalkade trikomer, med fristående huvuden och stjälkdelar. De röda pilarna indikerar cystolitiska trikomer, de blå pilarna indikerar några stjälkdelar från de glandulära kapitita stalkade trikomerna och de gula pilarna indikerar separerade skivceller. Skalstreck = (A,C,D,E,F) 100 μm, (B) 50 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 11: Analys av integriteten hos RNA extraherat från trikomerna. Kromatografer och geler av extraherade RNA-prover från glandulärt kapitat, stjälkat och sittande trikomer isolerade med användning av detta protokoll. Resultat för RNA från (AD) de förföljda trikomerna i de fyra sortlinjerna som användes i denna studie, CS-11, CS-12, CS-13 respektive CS-14, och (E-H) de sittande trikomerna, CS-11, CS-12, CS-13 och CS-14. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tabell 1: Jämförelse av det trikomberikade genuttrycket erhållet med RNAseq med användning av detta protokoll med resultaten erhållna av Livingston et al.14. De 12 gener som uppvisar den högsta korrelationen med cannabidiolsyrasyntas (CBDAS) uttryck av Livingston et al.14 (från deras kompletterande tabelldata S4, anpassade med tillstånd från Wiley-förlag), betraktade som en trikomspecifik genmarkör, valdes för jämförelse. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 2: Jämförelse av genuttrycket (FPKM) av fem cannabisaktingener av isolerade stalkade och sittande trikomer från det nuvarande protokollet (våra genuttrycksdata från cannabissort CS-11 11 (Var CS-11)) med tidigare publicerade resultat anpassade från Livingston etal.14. Resultaten av Livingston et al.14 presenterades baserat på Finola FN-referensgenomet, och deras data översattes till CS10.2-referensgenomet. Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Tabell 3: Genuttryck (FPKM) av cannabisklorofyll a-b-bindande gener av hela blomställningar och isolerade stalkade trikomer från det nuvarande protokollet (våra genuttrycksdata från Var CS-11). Klicka här för att ladda ner denna tabell.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Jämfört med de för närvarande tillgängliga trichomeisoleringsprotokollen beskrivs två huvudsakliga modifieringar i detta protokoll. Dessa inkluderar avlägsnande av trikomerna från växtmaterialet med torris i det första steget och ersättning av LN för det vanliga flytande buffertmediet. Den första modifieringen för C. sativa trichome rening är baserad på ett tidigare protokoll som introducerade användningen av krossad torris för att lossa trikomerna från pelargon pediceller5. Medan traditionella trichomeisoleringsprotokoll i allmänhet använder ett litet (50 ml) provrör, användes en 1 L glasbägare i denna studie med en generös mängd krossad torris, vilket möjliggjorde en större volym initialt växtmaterial (upp till 10 g) som skulle bearbetas. I det nuvarande protokollet infördes dessutom ytterligare två passager av trikomerna genom mikrosiktar i det första isoleringssteget. Det första steget använder en vertikal upp-och-ner kraftfull saltskakarliknande rörelse, och det andra använder en horisontell siktningsrörelse genom mikrosikten i mjölsikten. De kombinerade horisontella och vertikala siktrörelserna föreslås för att främja en förbättrad separation baserat på trikomets storlek och form.
Den andra, mest signifikanta modifieringen behandlar isoleringsmediet i vilket passagen genom mikrosiktarna genomförs. I detta protokoll ersätts det konventionella vattenisoleringsmediet helt av LN. Ett tidigare protokoll8 använde också LN i det första steget för trikomisolering, separerade trikomer från växtmaterialet (genom att riva blommaterialet mot en nätsikt), men fortsatte med en flytande buffertextraktion och Percoll-densitetsseparation. Att ersätta LN med det konventionella isoleringsmediet eliminerar behovet av speciella procedurer associerade med de toxiska komponenterna i det konventionella isoleringsmediet, vilket möjliggör ett avslappnat arbetsflöde och hög genomströmning.
Ett viktigt inslag i detta protokoll är beroende av benägenheten hos torris och LN att sublimera snabbt vid rumstemperatur. Denna funktion möjliggör deras generösa tillämpning under hela isoleringsprocessen. Däremot skulle användningen av en stor del av den konventionella isoleringsbufferten leda till tekniska komplikationer när det gäller hanteringen av dess stora volymer.
Medan isoleringsprocessen i detta protokoll främjar kvarhållandet av den bräckliga huvudstrukturen hos den glandulära kapitita stalkade trichome, främjar de konventionella protokollen separationen av skivcellerna från det återstående körtelmaterialet, som lätt tvättas bort och lämnar endast skivcellerna. Detta fenomen kan tydligt ses i våra resultat som jämför ett konventionellt isoleringsprotokoll med vårt nya protokoll (figur 10D, E). Förutom den mikroskopiska observationen indikerar kvalitetsanalysen av RNA extraherat från trikomerna (isolerat med detta protokoll) tydligt att RNA-integriteten bibehålls under isoleringsprocessen och att den är lämplig för transkriptomisk analys.
Dessutom indikerar genuttrycksresultaten från vår isolerade trikomfraktion att fraktionen är höganrikad i etablerade trikomuttryckta gener (tabell 1) och ömsesidigt att icke-trikomuttryckta gener är orepresenterade (tabell 3).
Den huvudsakliga begränsningen i detta protokoll är dess exklusiva lämplighet för att isolera trikomer beroende på deras benägenhet att passera genom mikrosiktar. Även om protokollet inte kan tillämpas direkt på trikomisolering med hjälp av en densitetsgradient, är det lämpligt för att isolera trikomerna före densitetsgradientsteget, om det behövs. I denna studie genomgick de trikomer som isolerats med detta protokoll inte en proteomisk karakterisering, och deras lämplighet för en sådan applikation måste verifieras. Eftersom RNA-proverna extraherade från både stjälkade och sittande trikomer inte uppvisade någon nedbrytning, vilket indikeras av chomatograferna och höga RIN-värden, kan det antas att de trikomer som isolerats med det nuvarande protokollet sannolikt uppfyller de krav som krävs för proteomisk analys.
Isoleringsgraden (från den ursprungliga växtkällan och andra typer av trikomer) för glandular capitate sessile trichomes från fläktbladen är mycket hög, eftersom fläktbladen saknar glandular capitate stalkad trichome typ15,16, och cystolitiska och bulbous trichomes isoleras lätt från de sittande trikomerna på grund av deras strukturella och storleksskillnader. Men när det gäller isoleringen av glandulära kapitita stjälkade typ trichomes, är det bäst att ta itu med deras isoleringsgrad som anrikning, eftersom växtkällan, den mogna kvinnliga blomställningen, innehåller alla fyra trikomtyper, förutom pre-stalk typ14. Det är självklart att de flesta av de isolerade glandulära kapititattrikomerna är av den förföljda typen, eftersom deras upphöjda position (i förhållande till de epidermalbundna sittande trikomerna) ökar sannolikheten för att de kolliderar med en torrispartikel och lossnar från växten. Vidare anses skärningspunkten som förbinder huvud- och stjälkdelarna i den stalkade trichome vara en svaghetspunkt i samband med abscission av körtelhuvudet17. Således skulle det vara korrekt att hänvisa till den stalkade trichome-delen som en högberikad fraktion med potentiellt låg förorening av den sittande typen. Ytterligare analys gjordes dock inte för att validera detta antagande.
Lämpligheten av det nuvarande protokollet för att extrahera glandulära trikomer från andra växtarter är ännu inte fastställt. Den höga trikomtätheten hos C. sativa bidrar förmodligen till framgången för detta protokoll. Det verkar dock osannolikt att detta är den enda anledningen, eftersom en relativt stor växtmaterialkälla (upp till 10 g per isoleringscykel) kan bearbetas effektivt. Andra studier har presenterat detaljerade protokoll för att isolera olika trikomtyper från andra växter, till exempel rosettbladtrikomer från Arabidopsis thaliana18,19. Medan tillämpligheten av det nuvarande protokollet för isolering av andra trikomtyper inte studerades i detta arbete, kommer element som presenteras i detta arbete, särskilt substitutionen av LN för isoleringsbufferten, sannolikt att förbättra trikomisoleringsprocessen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Författarna erkänner ekonomiskt stöd från CannabiVar Ltd. Allt växtmaterial tillhandahölls generöst av professor Hinanit Koltai från Volcani Center, Israel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bioanalyzer RNA Pico 6000 chip | Agilent, Germany | Reorder number 5067-1513 | Lab-on-a-chip system |
| Transsonic-310 | Elma, Germany | D-78224 | Ultrasonic cleaning unit |
| TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 | Illumina, USA | RS-122-2001 | Sample preperation for RNA sequencing library |
| Spectrum Plant Total RNA Kit | SIGMA-ALDRICH, USA | STRN50-1KT | Plant Total RNA Kit |
| Nylon micro-sieve with a mesh size of 350 µm (40 x 40 cm or larger than the circumference of the flour sifter) | Sinun Tech, Israel | r0350n350210 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size of 150 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0150n360465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 105 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0105n320718 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 80 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 65 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0065n340715 | Nylon screen aperture |
| Nylon micro-sieve with mesh size o 50 µm (size of 30 x 30 cm) | Sinun Tech, Israel | r0080n370465 | Nylon screen aperture |
| Up to 10 g of frozen plant material (stored in -80 oC or liquid nitrogen) | |||
| Suitable gloves for handling low temperatures | |||
| Safety goggles | |||
| 1 mm screen door (mosquito) mesh (strip of 30 x 100 cm) | |||
| Large strainer (colander) with holes approximately 5 mm | |||
| 1 L glass beaker | |||
| 1 block of dry ice (0.5-1 kg) | |||
| Hammer and hard flat object | |||
| Two 5 L plastic containers | |||
| Rubber bands | |||
| Large flour sifter or sieve strainer- preferably one with a detachable plastic ring on the circumference | |||
| Several large and small round bottom stainless steel containers. One of them should be larger than the flour sifter's circumference (approximately 40 cm in diameter), to minimize the loss of the sifted mass outside the round bottome stainless steel container | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) stainless steel spoon, spatula, and scoopula | |||
| Clean plate | |||
| Several clothespins | |||
| Pre-chilled (via liquid nitrogen) labeled 1.5 mL tubes with holes poked on the lid with a sterile needle | |||
| Two containers of liquid nitrogen | |||
| 1 cm wide painting brush |
References
- Schilmiller, A. L., Last, R. L., Pichersky, E. Harnessing plant trichome biochemistry for the production of useful compounds. Plant Journal for Cell & Molecular Biology. 54 (4), 702-709 (2008).
- Liu, Y., Jing, S. X., Luo, S. H., Li, S. H. Non-volatile natural products in plant glandular trichomes: chemistry, biological activities and biosynthesis. Natural Product Reports. 36 (4), 626-665 (2019).
- Fairbairn, J. W. The trichomes and glands of Cannabis sativa L. UN Bulletin on Narcotics. 23, 29-33 (1972).
- Booth, J. K., Page, J. E., Bohlmann, J. Terpene synthases from Cannabis sativa. PLoS One. 12 (3), 0173911 (2017).
- Yerger, E. H., et al. A rapid method for isolating glandular trichomes. Plant Physiology. 99 (1), 1-7 (1992).
- Gershenzon, J., Maffei, M. M., Croteau, R. Biochemical and histochemical localization of monoterpene biosynthesis in the glandular trichomes of spearmint (Mentha spicata). Plant Physiology. 89 (4), 1351-1357 (1989).
- Gershenzon, J., et al. Isolation of secretory cells from plant glandular trichomes and their use in biosynthetic studies of monoterpenes and other gland products. Analytical Biochemistry. 200 (1), 130-138 (1992).
- Conneely, L. J., Mauleon, R., Mieog, J., Barkla, B. J., Kretzschmar, T. Characterization of the Cannabis sativa glandular trichome proteome. PLoS One. 16 (4), 0242633 (2021).
- Liu, Y., Zhu, P., Cai, S., Haughn, G., Page, J. E. Three novel transcription factors involved in cannabinoid biosynthesis in Cannabis sativa L. Plant Molecular Biology. 106 (1-2), 49-65 (2021).
- Slone, J. H., Kelsey, R. G. Isolation and purification of glandular secretory cells from Artemisia tridentata (ssp. vaseyana) by Percoll density gradient centrifugation. American Journal of Botany. 72 (9), 1445-1451 (1985).
- Namdar, D., et al. Terpenoids and Phytocannabinoids Co-Produced in Cannabis Sativa Strains Show Specific Interaction for Cell Cytotoxic Activity. Molecules. 24 (17), 3031 (2019).
- McDowell, E. T., et al. Comparative functional genomic analysis of Solanum glandular trichome types. Plant Physiology. 155 (1), 524-539 (2011).
- Bergau, N., Santos, A. N., Henning, A., Balcke, G. U., Tissier, A. Autofluorescence as a signal to sort developing glandular trichomes by flow cytometry. Frontiers in Plant Science. 7, 949 (2016).
- Livingston, S. J., et al. Cannabis glandular trichomes alter morphology and metabolite content during flower maturation. The Plant Journal. 101 (1), 37-56 (2019).
- Turner, J. C., Hemphill, J. K., Mahlberg, P. G. Gland distribution and cannabinoid content in clones of Cannabis sativa L. American Journal of Botany. 64 (6), 687-693 (1977).
- Turner, J. C., Hemphill, J. K., Mahlberg, P. G. Quantitative determination of cannabinoids in individual glandular trichomes of Cannabis sativa L. (Cannabaceae). American Journal of Botany. 65 (10), 1103-1106 (1978).
- Hammond, C. T., Mahlberg, P. G. Morphology of glandular hairs of Cannabis sativa from scanning electron microscopy. American Journal of Botany. 60 (6), 524-528 (1973).
- Marks, M. D., et al. A new method for isolating large quantities of Arabidopsis trichomes for transcriptome, cell wall, and other types of analyses. The Plant Journal. 56 (3), 483-492 (2008).
- Huebbers, J. W., et al. An advanced method for the release, enrichment and purification of high-quality Arabidopsis thaliana rosette leaf trichomes enables profound insights into the trichome proteome. Plant Methods. 18 (1), 12 (2022).
