Este estudio demuestra una técnica de trasplante de corazón abdominal heterotópica reproducible en ratas que los principiantes pueden aprender y realizar. Además, se genera un nuevo modelo de regurgitación aórtica en ratas mediante la realización de un trasplante de corazón abdominal heterotópico y el daño de la válvula aórtica del donante utilizando un alambre guía después de la recolección.
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Artículo de método
Trasplante de corazón abdominal heterotópico modificado y un nuevo modelo de regurgitación aórtica en ratas
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Resumen
Resumen
En los últimos 50 años, muchos investigadores han reportado un trasplante de corazón abdominal heterotópico en ratones y ratas, con algunas variaciones en la técnica quirúrgica. La modificación del procedimiento de trasplante para fortalecer la protección miocárdica podría prolongar el tiempo de isquemia y preservar la función cardíaca del donante. Los puntos clave de esta técnica son los siguientes: transectar la aorta abdominal del donante antes de la recolección para descargar el corazón del donante; perfundir las arterias coronarias del donante con una solución cardiopléjica fría; y enfriamiento tópico del corazón del donante durante el procedimiento de anastomosis. En consecuencia, dado que este procedimiento prolonga el tiempo aceptable de isquemia, los principiantes pueden realizarlo fácilmente y lograr una alta tasa de éxito.
Además, en este trabajo se estableció un nuevo modelo de regurgitación aórtica (RA) utilizando una técnica diferente a la existente, que se crea insertando un catéter desde la arteria carótida derecha y perforando la válvula aórtica nativa bajo guía ecocardiográfica continua. Se realizó un trasplante cardíaco abdominal heterotópico utilizando el nuevo modelo AR. En el protocolo, después de que se extrae el corazón del donante, se inserta un alambre guía rígido en la arteria braquiocefálica del donante y se avanza hacia la raíz aórtica. La válvula aórtica se perfora empujando el alambre guía aún más incluso después de sentir la resistencia, induciendo así AR. Es más fácil dañar la válvula aórtica utilizando este método que con el procedimiento descrito en el modelo AR convencional. Además, este novedoso modelo de RA no contribuye a la circulación del receptor; por lo tanto, se espera que este método produzca un modelo de RA más severo que el procedimiento convencional.
Introducción
El trasplante cardíaco abdominal heterotópico en ratas fue reportado por primera vez en 1964 por Abbott et al.1 y se ha utilizado para estudiar el rechazo agudo y crónico del aloinjerto, la vasculopatía del aloinjerto cardíaco, la lesión por isquemia-reperfusión y la remodelación cardíaca 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11 . Se han añadido algunas modificaciones al procedimiento en los últimos 50 años. Los fundamentos del procedimiento actual son los siguientes. La aorta ascendente y la arteria pulmonar (PA) del donante se anastomosan de extremo a lado a la aorta abdominal y la vena cava inferior del receptor, respectivamente. Aunque la aurícula izquierda y el ventrículo del donante no reciben ningún flujo intracavitario, la sangre fluye al sistema coronario del donante; Por lo tanto, el corazón del donante comienza a latir nuevamente después de la despinzamiento.
Algunos expertos con experiencia en cientos o miles de operaciones han reportado una alta tasa de éxito con corto tiempo de isquemia para trasplante cardíaco abdominal heterotópico 2,3,4,5; Sin embargo, es difícil para los principiantes lograr el corto tiempo de isquemia desde el principio. Una cardioprotección suficiente es un factor importante para obtener una buena contracción cardíaca del corazón del donante. Una protección miocárdica insuficiente puede endurecer el corazón del donante. Por lo tanto, modificamos el procedimiento de trasplante para fortalecer la protección del corazón del donante. Uno de los objetivos de este estudio es demostrar un procedimiento de trasplante de corazón abdominal heterotópico reproducible que los principiantes pueden realizar fácilmente, ya que prolonga el tiempo aceptable de isquemia.
Además, algunos investigadores han reportado un modelo de regurgitación aórtica (RA) en ratas, que ha sido utilizado para examinar los efectos de los agentes en la remodelación del ventrículo izquierdo (VI)12,13,14,15. El procedimiento convencional incluye lo siguiente: (1) se realiza una incisión lateral derecha en el cuello para exponer la arteria carótida derecha después de la anestesia; (2) un catéter se canula desde este vaso y se avanza hacia la raíz aórtica; y (3) la RA se induce mediante la punción de la válvula aórtica nativa bajo guía ecocardiográfica continua.
Sin embargo, perforar la válvula aórtica mientras se sostiene la sonda de ecocardiografía y obtener una buena vista de la aorta ascendente, la válvula aórtica y el catéter con un ecocardiograma es un desafío. Además, la insuficiencia cardíaca después de la RA aguda es otra complicación. Por lo tanto, se ha establecido un nuevo modelo de AR, que se puede crear fácilmente y no contribuye a la circulación del receptor, en este trabajo para resolver estos desafíos. El otro objetivo de este estudio es crear un modelo de RA mediante el uso de trasplante cardíaco abdominal heterotópico y dañar la válvula aórtica del donante utilizando un alambre guía después de la recolección.
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Protocolo
Todos los procedimientos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con "Un esquema de la Ley sobre el bienestar y la gestión de los animales" y "Normas relativas al cuidado, mantenimiento y reducción del dolor de los animales de laboratorio" por el Ministerio de Medio Ambiente, Gobierno de Japón y las "Directrices para la realización adecuada de experimentos con animales" por el Consejo Científico de Japón16, 17,18. Los protocolos con animales fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Tokio (M-P19-065).
1. Trasplante cardíaco abdominal heterotópico en ratas
NOTA: Se realizaron trasplantes cardíacos abdominales heterotópicos en ratas macho Jcl:Wistar de 7 a 9 semanas de edad. Se utilizó un microscopio con un aumento de 6,7x a 45x para realizar el procedimiento. Los instrumentos quirúrgicos fueron esterilizados en autoclave para su esterilización.
- Extracción de corazón de donante
- Anestesiar a la rata donante mediante una inyección intraperitoneal de medetomidina (0,15 mg/kg), midazolam (2,0 mg/kg) y butorfanol (2,5 mg/kg).
- Coloque a la rata en posición supina sobre una almohadilla térmica sobre la placa operatoria y fije las extremidades con bandas elásticas. Retire la mayor cantidad de pelaje posible con una afeitadora eléctrica y crema depilatoria. Posteriormente, limpie el área de operación con yodo y un exfoliante con alcohol al 70% tres veces para la desinfección.
- Haga una pequeña incisión de aproximadamente 1 cm con tijeras, seguida de la administración de heparina en el abdomen (100 U).
- Extienda la incisión abdominal longitudinalmente desde arriba del meato uretral externo hasta el proceso subxifoide con tijeras.
- Exponga la aorta abdominal con hisopos de algodón esterilizados y transecto con tijeras para descargar el corazón del donante.
- Incise el diafragma a lo largo de la pared torácica anterior y abra la pared torácica con una incisión en forma de V con tijeras. Eleve la pared torácica anterior al lado de la cabeza y fíjela con alfileres.
- Iniciar el enfriamiento tópico del corazón usando hielo granizado.
- Tape la vena cava inferior con una sutura de seda 5-0.
- Retire el timo con tijeras y, posteriormente, identifique la aorta ascendente y la PA que se originan en el corazón. La aorta ascendente y la AF están a la derecha y a la izquierda, respectivamente.
- Transecto la arteria braquiocefálica que se origina en el arco aórtico con tijeras de Potts para una exanguinación adicional.
- Insertar una aguja de 23 G en la vena cava inferior y administrar 2-3 ml de solución cardiopléjica de Krebs-Henseleit modificada en frío. Después de la administración, el corazón deja de latir gradualmente. Al mismo tiempo, asegúrese de que la sangre dentro del corazón se drene tanto como sea posible.
- Ligate la vena cava inferior con seda 5-0, y divídela distalmente a la ligadura usando tijeras Potts.
- Después de diseccionar el tejido conectivo entre el pulmón derecho y el esófago con tijeras, ligar el hilio del pulmón derecho con seda 5-0 y dividirlo distalmente a la ligadura con tijeras.
- Ligate la vena cava superior derecha con seda 5-0, y divídela distalmente a la ligadura con tijeras Potts.
- Inserte una hoja de las tijeras de Potts en el seno transverso y divida la aorta ascendente y la PA en bloque lo más distalmente posible.
- Ligate la vena cava superior izquierda con una sutura de seda 5-0, y divídela distalmente a la ligadura y proximalmente a la vena ácigos con tijeras de Potts.
- Después de diseccionar el tejido conectivo entre el pulmón izquierdo y el esófago con tijeras, liga el hilio del pulmón izquierdo con una sutura de seda 5-0 y divídelo distalmente a la ligadura con tijeras.
- Ligate la base del corazón con una sutura de seda 5-0, y divídela distalmente a la ligadura con tijeras. Esta seda se utiliza para retraer el corazón del donante durante la anastomosis del corazón del donante. En este momento, retire el corazón del donante de la cavidad pericárdica.
- Después de colocar el corazón del donante en la placa llena de hielo granizado y solución salina normal fría, disecciona el tejido conectivo entre la aorta ascendente y la PA usando micropinzas.
- Perfundir 2-3 ml de solución cardiopléjica de Krebs-Henseleit modificada en frío de la aorta ascendente hacia las arterias coronarias sujetando el ostium de la aorta ascendente con pinzas hasta que disminuya el color rojo de las arterias coronarias.
- Guarde el corazón del donante en una solución cardiopléjica de Krebs-Henseleit modificada en frío.
- Preparación del destinatario
NOTA: Antes de extraer el corazón del donante, complete la preparación del receptor.- Anestesiar a la rata receptora mediante una inyección intraperitoneal de medetomidina (0,15 mg/kg), midazolam (2,0 mg/kg) y butorfanol (2,5 mg/kg). Después de la intubación endotraqueal con catéter intravenoso de 16 G, mantener la anestesia por inhalación de sevoflurano (inducción al 5,0% y mantenimiento al 2,5% con un caudal deO2 de 0,3 L/min).
- Coloque a la rata en posición supina sobre una almohadilla térmica colocada sobre la placa operatoria y fije las extremidades con bandas elásticas. Retire la mayor cantidad de pelaje posible con una afeitadora eléctrica y crema depilatoria. Además, limpie el sitio quirúrgico con yodo y un exfoliante con alcohol al 70% tres veces para la desinfección.
- Usando tijeras, haga una incisión abdominal en la línea media de aproximadamente 6-7 cm por encima del meato uretral externo al proceso subxifoide.
- Retraiga el intestino delgado hacia el lado superior derecho del recipiente con hisopos de algodón esterilizados y envuélvalo con una gasa empapada con solución salina normal tibia.
- Diseccionar el tejido conectivo entre el intestino delgado y el colon con tijeras.
- Diseccionar el área avascular del colon con tijeras y pegar con cinta adhesiva dos piezas de gasa en forma de tira para retraer el colon hacia la izquierda.
- Exponga la aorta abdominal y la vena cava inferior con hisopos de algodón esterilizados. Ligate las ramas relativamente grandes de ambos recipientes con nylon 9-0, y divide.
- Trasplante cardíaco heterotópico
- Administrar heparina en el abdomen del receptor (100 U) antes de iniciar el trasplante de corazón del donante.
- Pinza la aorta abdominal y la vena cava inferior en bloque con pinzas de pinza de mordida lateral.
- Perfore la aorta abdominal con una aguja de 23 G doblada de 90° y extienda el orificio longitudinalmente con tijeras de Potts hasta al menos el diámetro de la aorta ascendente del donante. Posteriormente, enjuague la luz con solución salina normal heparinizada (10 U/mL) para eliminar los coágulos.
- Coloque la placa pequeña esterilizada en el lado derecho de la aorta abdominal y la vena cava inferior del receptor. Coloque el corazón del donante en el plato lleno de hielo granizado y solución salina normal fría, que debe reponerse cada 5 minutos.
- Ate la aorta ascendente del donante a la aorta abdominal del receptor con dos suturas de nylon 9-0 en las posiciones de las 12 en punto y las 6 en punto.
- Gire la placa operativa 90° en el sentido de las agujas del reloj.
- Anastomosar el lado izquierdo de la aorta abdominal del receptor y la aorta ascendente del donante utilizando una sutura de nylon 9-0 desde la dirección caudal hasta la craneal, y atar con una sutura de estancia de nylon 9-0 en la posición de las 12 en punto (total de siete a ocho suturas).
- Gire la placa operativa en sentido contrario a las agujas del reloj 180°. Translocar el corazón del donante a la izquierda de la aorta abdominal y la vena cava inferior del receptor. Es fácil retraer el corazón del donante hacia el lado izquierdo con la sutura de seda 5-0 que se utilizó al ligar la base del corazón del donante (paso 1.1.18).
- Anastomosar el lado derecho de la aorta abdominal del receptor y la aorta ascendente del donante usando una sutura de nylon 9-0 desde la dirección craneal hasta la caudal, y atar con una sutura de nylon 9-0 en la posición de las 6 en punto (total de siete a ocho suturas).
- Perforar la vena cava inferior con una aguja de 23 G doblada a 90° distalmente a la anastomosis entre la aorta ascendente del donante y la aorta abdominal del receptor, y extender el orificio longitudinalmente con tijeras de Potts a mayor que el diámetro de la PA del donante. Posteriormente, enjuague la luz con solución salina normal heparinizada para eliminar coágulos.
- Ate el PA del donante a la vena cava inferior del receptor con una sutura de nylon 9-0 en la posición de las 6 en punto.
- Anastomosar el lado izquierdo de la vena cava inferior del receptor y la PA del donante con una sutura de nylon 9-0 desde la dirección caudal hasta la dirección craneal (total de siete a ocho suturas).
- Ate el PA del donante a la vena cava inferior del receptor con una sutura de nylon 9-0 en la posición de las 12 en punto. Además, ate esta sutura de estancia al nylon 9-0 en el lado izquierdo de la anastomosis entre la PA del donante y la vena cava inferior del receptor.
- Anastomosar el lado derecho de la vena cava inferior del receptor y la PA del donante utilizando una sutura de nylon 9-0 desde la dirección craneal hasta la caudal, y atar con la sutura de estancia de las 6 en punto (total de 10-12 suturas).
- Aplique agentes hemostáticos a ambas anastomosis y coloque una gasa alrededor de ellas.
- Después de soltar las pinzas de pinza de mordida lateral, comprima las anastomosis suavemente con hisopos de algodón esterilizados para facilitar la hemostasia. Posteriormente, aplique solución salina normal tibia en el corazón del donante para proporcionar calor. El corazón del donante comienza a fibrilar en unas pocas decenas de segundos y se recupera al ritmo sinusal después de unos minutos.
- Devuelva el intestino delgado al abdomen del receptor usando hisopos de algodón esterilizados. Se debe tener cuidado para evitar comprimir el corazón del donante o torcer el intestino delgado.
- Cierre la pared abdominal con una sutura de seda 4-0. Después de administrar atipamezol (0,75 mg/kg) en el abdomen, cierre la piel con una sutura de seda 4-0.
- Suspenda la anestesia por inhalación e inyecte 1 ml de lidocaína al 1% debajo de la incisión. Además, inyecte 2 ml de solución salina normal tibia por vía subcutánea para compensar la pérdida de sangre.
- Caliente la rata receptora con una lámpara de diodo emisor de luz. La rata receptora recupera la conciencia y puede ser extubada aproximadamente 30-40 minutos después de suspender la anestesia por inhalación.
2. Nuevo modelo de RA utilizando trasplante cardíaco abdominal heterotópico en ratas
NOTA: Se generó un nuevo modelo de RA utilizando trasplante cardíaco abdominal heterotópico utilizando ratas macho Jcl:Wistar de 7 a 9 semanas de edad. Se utilizó un microscopio con un aumento de 6,7x a 45x para realizar el procedimiento. Los instrumentos quirúrgicos fueron esterilizados en autoclave para su esterilización.
- Extracción de corazón de donante
NOTA: Se requiere una placa de Petri modificada con un orificio en el centro, alicates y un alambre guía rígido para crear el nuevo modelo AR (Figura 1).- Como se describió anteriormente, extraer el corazón del donante utilizando un procedimiento similar al trasplante normal en ratas, excepto por los pasos relacionados con la aorta ascendente y la transección de PA (1.1.1-1.1.14, 1.1.16-1.1.17)
- Antes de transectar la aorta ascendente y la PA, retire el tejido adiposo en la parte frontal de ambos vasos con tijeras de Potts. Posteriormente, diseccionar el tejido conectivo entre ambos vasos utilizando pinzas.
- Inserte una hoja de las tijeras de Potts en el seno transversal. Tire de las tijeras Potts hacia el operador e inserte la cuchilla entre la aorta ascendente y el PA. Posteriormente, transecte solo la AF (Figura 2A), seguido de la transección de la aorta distalmente a la arteria braquiocefálica utilizando tijeras de Potts (Figura 2B).
- Después de ligar la base del corazón usando una sutura de seda 5-0 y dividirla distalmente a la ligadura con tijeras, diseccionar el tejido conectivo entre la aorta ascendente y el PA, y perfundir solución cardiopléjica de Krebs-Henseleit modificada en frío en las arterias coronarias utilizando un procedimiento similar al trasplante normal (pasos 1.1.18-1.1.20).
- Arregle el corazón del donante con alicates (Figura 2C). Posteriormente, cubra el corazón del donante con una placa de Petri modificada con un orificio en el centro e inmovilice la aorta ascendente con un clip vascular.
- Inserte un alambre guía rígido en la arteria braquiocefálica (Figura 2D). Empuje el alambre guía aún más incluso después de que se cumpla la resistencia, y perfore la válvula aórtica si se confirma una pérdida de resistencia. Realice múltiples punciones si se va a crear un modelo AR grave.
- Transectar la aorta proximalmente a la arteria braquiocefálica para eliminar la porción sujeta con el clip vascular (Figura 2E). Posteriormente, almacenar el corazón del donante en una solución cardiopléjica de Krebs-Henseleit modificada en frío mediante un procedimiento similar al trasplante normal (paso 1.1.21).
- Preparación del destinatario
NOTA: Antes de extraer el corazón del donante, complete la preparación del receptor.- Como se describió anteriormente, el procedimiento de preparación del receptor es similar al del trasplante normal (pasos 1.2.1-1.2.7).
- Trasplante cardíaco heterotópico
- Como se describió anteriormente, el procedimiento de trasplante de corazón del donante es similar al trasplante normal (pasos 1.3.1-1.3.20).
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Resultados
En cuanto al modelo normal, se estableció con éxito una buena contracción del VI después del despinzamiento. El tiempo de isquemia del corazón trasplantado y el tiempo de anestesia del receptor fueron aproximadamente 60 min y 130 min, respectivamente (Tabla 1).
También se obtuvo una buena contracción del VI después del despinzamiento en el nuevo modelo AR. El tiempo isquémico del corazón trasplantado y el tiempo de anestesia del receptor en el modelo AR fueron aproximadamente ...
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Discusión
Se descubrieron pasos clave para evitar que el corazón del donante se endurezca durante la implantación. En primer lugar, es vital transectar la aorta abdominal del donante antes de la recolección para descargar el corazón del donante 4,7. Si el procedimiento quirúrgico del donante se realiza sin intubación endotraqueal, la respiración cesa después de la toracotomía, lo que obstruye la circulación pulmonar del donante. En consecuencia, el corazón del donante se s...
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Agradecimientos
Nos gustaría agradecer a Editage (www.editage.com) por la edición en inglés.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Antisedán (atipamezole) | Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd. | ||
| Domitor (medetomidina) | Nippon Zenyaku Kogyo Co., Ltd. | ||
| Dormicum (midazolam) | Maruishi Pharmaceutical Co., Ltd. | ||
| heparina | AY Pharmaceuticals Co., Ltd. | ||
| Jcl:Ratas Wistar | CLEA Japón, Inc. | ||
| microscopio | Orinpas Co., Ltd. | SZ61 | |
| solución cardiopléjica modificada de Krebs-Henseleit | Merck KGaA | ||
| sevoflurano | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | ||
| SURGICEL FIBRILLAR | Johnson & Johnson K.K. | ||
| Vetorphale (butorfanol) | Meiji Animal Health Co., Ltd. |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
