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Predicción de farmacología en red y validación experimental del mecanismo de acción de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii contra el adenocarcinoma de pulmón

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DOI:

10.3791/64847

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3 de marzo de 2023

 ,  ,  , 
1Dongzhimen Hospital affiliated to Beijing University of Chinese Medicine, 2Traditional Chinese Medicine Department, Peking University People's Hospital

En este artículo

Resumen

Este estudio revela el mecanismo de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii en el tratamiento del adenocarcinoma de pulmón basado en la farmacología de red y la verificación experimental. El estudio también demuestra que la vía de señalización PI3K / AKT juega un papel vital en la acción de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii en el tratamiento del adenocarcinoma de pulmón.

Resumen

Nuestro objetivo fue estudiar el mecanismo de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii en el tratamiento del adenocarcinoma de pulmón (LUAD) basado en la farmacología de la red y la verificación experimental. Los componentes efectivos y los objetivos potenciales de Trichosanthis y Fritillaria thunbergii se recopilaron mediante experimentos de alto rendimiento y bases de datos guiadas por referencia (HERB) de medicina tradicional china y una base de datos de enfoque de conjunto de similitud (SEA), y los objetivos relacionados con LUAD fueron consultados por las bases de datos GeneCards y Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM). El software Cytoscape construyó una red de fármacos-componentes-enfermedad-diana. Se realizaron análisis de enriquecimiento de la vía de la red de interacción proteína-proteína (PPI), la función de la ontología génica (GO) y la enciclopedia de genes y genomas de Kyoto (KEGG) para obtener objetivos centrales y vías clave. Para la validación experimental posterior se utilizó un extracto acuoso de células de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii y A549. A través de la base de datos HERB y la búsqueda bibliográfica, se examinaron 31 compuestos efectivos y 157 genes diana potenciales de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii, de los cuales 144 eran objetivos reguladores de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii en el tratamiento del adenocarcinoma de pulmón. El análisis de enriquecimiento funcional GO mostró que el mecanismo de acción de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii contra el adenocarcinoma de pulmón es principalmente la fosforilación de proteínas. El análisis de enriquecimiento de la vía KEGG sugirió que el tratamiento del adenocarcinoma de pulmón por Trichosanthes-Fritillaria thunbergii implica principalmente la vía de señalización PI3K / AKT. La validación experimental mostró que un extracto acuoso de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii podría inhibir la proliferación de células A549 y la fosforilación de AKT. A través de la farmacología en red y la validación experimental, se verificó que la vía de señalización PI3K / AKT juega un papel vital en la acción de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii en el tratamiento del adenocarcinoma de pulmón.

Introducción

El cáncer de pulmón se refiere a tumores malignos que se originan en la mucosa bronquial pulmonar, incluidos el carcinoma de células escamosas, el adenocarcinoma, el carcinoma de células grandes y el carcinoma de células pequeñas1. El adenocarcinoma de pulmón (LUAD) es el tipo más común de cáncer de pulmón, que representa alrededor del 40% del total de casos de cáncer de pulmón2. La mayoría de los pacientes son diagnosticados en una etapa avanzada o tienen metástasis remotas y, por lo tanto, pierden la oportunidad de la cirugía3. En el tratamiento clínico actual, la quimiorradioterapia concurrente es la estrategia más común para el tratamiento de la LUAD, pero su aplicación es limitada debido a reacciones adversas graves4.

La medicina tradicional china (MTC) puede aliviar eficazmente los síntomas clínicos de los pacientes con LUAD y reducir las reacciones adversas causadas por la radioterapia y la quimioterapia y, por lo tanto, se ha convertido en un punto caliente de investigación 5,6,7. En la medicina tradicional china, el cáncer de pulmón pertenece a la categoría de "acumulación pulmonar" y "petroso pulmonar". La deficiencia de Qi y la interacción de flema, estasis y veneno son importantes en la patogénesis del cáncer de pulmón. Por lo tanto, tonificar el Qi y eliminar la flema y la estasis sanguínea son el principal tratamiento clínico8 métodos para el cáncer de pulmón según la teoría de la MTC9. Trichosanthes kirilowii Maxim (Gualou) y Fritillaria thunbergii Miq (Zhebeimu) representan un par de fármacos comunes en el tratamiento del cáncer de pulmón, y esta combinación tiene los efectos de eliminar el calor y reducir la flema10,11,12. Sin embargo, su mecanismo de acción aún no está claro, y es necesario realizar más investigaciones.

La farmacología de redes es un método integral basado en la teoría de la biología de sistemas y la farmacología multidireccional que tiene como objetivo revelar relaciones complejas de red entre múltiples fármacos y enfermedades13. Las prescripciones tradicionales chinas tienen las características de ser multicomponente y multiobjetivo, por lo que son muy adecuadas para el estudio de la farmacología de red14,15. Recientemente, la farmacología en red ha surgido como un enfoque poderoso en el estudio de las fórmulas de MTC y se ha convertido en un punto caliente de investigación16,17.

Sin embargo, hasta donde sabemos, todas las investigaciones sobre farmacología de redes se presentan como texto. Presentar esta tecnología a través de video reducirá en gran medida el umbral de aprendizaje y facilitará la promoción de esta tecnología, que es una de las ventajas de este artículo. En este estudio, tomamos Trichosanthes-Fritillaria thunbergii contra adenocarcinoma de pulmón como ejemplo para llevar a cabo la predicción de farmacología en red y la validación experimental.

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Protocolo

Todos los procedimientos de farmacología en red se llevaron a cabo de acuerdo con las Directrices para los métodos de evaluación de farmacología en red18. Todos los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo con las regulaciones de gestión de laboratorio de la Universidad de Medicina China de Beijing.

1. Predicción farmacológica en red

  1. Selección de componentes activos
    1. Abra la base de datos HERB (http://herb.ac.cn)19 y use "Gualou" (el nombre chino de Trichosanthes kirilowii Maxim) y "Zhebeimu" (el nombre chino de Bulbus Fritillariae thunbergii) como palabras clave para obtener los componentes de los dos medicamentos. Descargue la lista y las estructuras canónicas SMILES de los componentes relacionados de los dos medicamentos.
    2. Determine si el componente obtenido es el componente activo.
      1. Incluir como componentes activos aquellos que tienen valores de biodisponibilidad oral (OB) y similares a fármacos (DL) en la base de datos de grupos HERB (es decir, componentes con OB ≥ 30% y DL ≥ 0,18)20,21.
      2. Si el componente no tiene valores OB y DL, introduzca el componente en la base de datos ADME suiza (http://www.swissadme.ch/index.php)22 para obtener la información sobre cada componente. Incluya componentes con absorción GI "alta" y al menos dos valores de DL "Sí" como componentes activos.
  2. Predicción objetivo de los componentes activos
    1. Abra la base de datos HERB (http://herb.ac.cn). Busque y copie las estructuras SMILES canónicas de los componentes activos.
    2. Abra la base de datos SEA (Similarity ensemble approach, http://sea.bkslab.org)23. Pegue las estructuras SMILES canónicas de los componentes activos en el cuadro de búsqueda y haga clic en Probar SEA para obtener la clave de destino, el nombre de destino, el valor P y MaxTC de cada componente activo.
    3. Copie los datos en una hoja de cálculo y utilice la función de filtrado del archivo de hoja de cálculo para filtrar los destinos de los componentes activos por clave Target (Human, P < 0.05 y MaxTC > 0.5).
    4. Copie todos los objetivos en una hoja de cálculo y elimine los duplicados para obtener los objetivos farmacológicos.
  3. Predicción de dianas de enfermedades
    1. Abra la base de datos GeneCards (https://www.genecards.org)24 y la base de datos Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM, https://www.omim.org)25 y use Lung Adenocarcinoma como palabra clave para obtener los objetivos de la enfermedad del adenocarcinoma de pulmón.
    2. Descargue las hojas de cálculo de los objetivos de la enfermedad. Elimine los destinos repetidos para obtener los destinos LUAD.
  4. Construcción de una red de medicamentos-componentes-enfermedad-diana
    1. Copie los objetivos relacionados con LUAD y los objetivos farmacológicos en la misma columna de una nueva hoja de cálculo. Utilice la función Datos - Identificar duplicados de la barra de herramientas para obtener objetivos de intersección de los objetivos relacionados con LUAD y los objetivos relacionados con componentes activos de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii .
    2. Abra Cytoscape 3.8.0. Haga clic en Archivo en la barra de menú y, a continuación, seleccione Importar > red desde archivo para importar el archivo de hoja de cálculo. Optimice el tamaño y el color de los nodos de red a través de la barra de estilo en el panel de control izquierdo.
    3. Utilice la función Analizar red para el análisis de topología de red . Haga clic en Herramientas en la barra de menú y luego seleccione Analizar red. En el panel Tabla , haga clic en Grado en la barra de título para organizar los componentes por grado en orden descendente. Tome los diez componentes y objetivos principales como los principales componentes activos y objetivos principales.
  5. Construcción de la red PPI y cribado de las proteínas centrales
    1. Abra la base de datos STRING (https://cn.string-db.org/)26. Pegue la lista de formato de texto de los objetivos potenciales de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii contra LUAD en el cuadro de diálogo Lista de nombres . Seleccione Homo sapiens en Organismos y haga clic en los botones BUSCAR > CONTINUAR .
    2. Cuando los resultados estén disponibles, haga clic en Configuración y marque Confianza alta (0.700) en Configuración básica > Puntuación de interacción mínima requerida. Marque Ocultar nodos desconectados en la red en Configuración avanzada y, a continuación, haga clic en el botón ACTUALIZAR.
    3. Haga clic en Exportaciones en la barra de título y descargue el breve texto tabular de la relación PPI en formato TSV.
    4. Abra Cytoscape 3.8.0. Haga clic en Archivo > Importar > red desde archivo para importar el archivo de formato TSV para el análisis visual.
    5. Utilice la función Analizador de red para realizar el análisis topológico. Optimice el tamaño y el color de los nodos de red a través de la barra de estilo en el panel de control izquierdo.
  6. Análisis de enriquecimiento KEGG
    1. Abra la plataforma Metascape (https://metascape.org/)27. Pegue la lista de formato de texto de los posibles objetivos terapéuticos en el cuadro de diálogo y luego haga clic en el botón Enviar. Marque H. sapiens en Entrada como especie y Análisis como especie, y luego haga clic en el botón Análisis personalizado. Seleccione Enriquecimiento, marque solo la Ruta KEGG y luego haga clic en Análisis de enriquecimiento. Después de que la barra de progreso alcance el 100%, haga clic en el botón naranja Página de informe de análisis para ver los resultados de enriquecimiento.
    2. Haga clic en Todo en un archivo zip para descargar el resultado del enriquecimiento y, a continuación, abra el archivo _ FINAL_GO.csv en la carpeta Enrichment_GO para obtener el resultado.
    3. Software Open R (https://cran.r-project.org/). Escriba install.package (" ggplot2") y library (ggplot2) en R para la instalación del paquete ggplot2 R. Pulse Intro para ejecutar el programa de visualización KEGG.

2. Verificación experimental

  1. Preparación de medicamentos
    NOTA: Fritillaria thunbergii Miq y Trichosanthes kirilowii Maxim fueron comprados al Hospital Dongzhimen, afiliado a la Universidad de Medicina China de Beijing.
    1. Mezclar 50 g de Fritillaria thunbergii Miq y 50 g de Trichosanthes kirilowii Maxim. Remojar la mezcla en 1 L de agua destilada durante 20 min, y luego decoctar la mezcla a 100 °C a presión normal durante 1 h.
    2. Filtre la decocción para obtener un filtrado con una doble capa de gasa médica estéril, y luego use papel de filtro de 80 μm para filtrar aún más el extracto. Repita la operación anterior tres veces.
    3. Mezclar el filtrado para obtener una decocción de aproximadamente 1,2 L. Colocar la solución en el matraz de un evaporador rotativo. Ajuste la velocidad de rotación a 50 rpm con una temperatura de 37 °C. Mezclar y condensar las decocciones en un extracto en el evaporador rotativo durante 6 h para obtener un líquido viscoso.
    4. Encienda el mecanismo de liofilización al vacío para preenfriar la temperatura a -40 °C. Coloque el extracto obtenido en la bandeja de material y colóquelo en la trampa fría para congelarlo.
    5. Cuando la temperatura de la trampa en frío alcance −50 °C y el material se haya congelado durante 2 h, transfiera los materiales congelados a una rejilla de secado colocada en la trampa fría. Encienda la bomba de vacío para iniciar el proceso de liofilización. Saque el polvo liofilizado y guárdelo en el refrigerador a -20 °C para usarlo más tarde.
  2. Cultivo celular
    1. Configure el medio completo DMEM con 89% de DMEM medio básico, 10% de suero bovino fetal y 1% de penicilina-estreptomicina.
    2. Después de retirar las células A549 del nitrógeno líquido, incubar las células en un baño de agua a 37 °C y remover hasta que el medio en el vial se derrita.
    3. Agregue un volumen cuádruple de medio completo DMEM en las células fundidas. Centrifugar las células (4 °C, 679 x g, 5 min) y desechar el sobrenadante.
    4. Resuspender las células precipitadas con 6 ml de medio completo DMEM, chaparlas en un matraz de cultivo T25 e incubar el matraz en una incubadora celular a 37 °C, 5% deCO2.
  3. Detección de viabilidad celular
    1. Digerir las células A549 en fase de crecimiento logarítmica con 1 ml de tripsina al 0,25% durante 1 min a 37°C. Agregue 1 ml de medio completo DMEM para neutralizar la tripsina y sople suavemente para promover el desprendimiento celular. Centrifugar la mezcla para obtener el pellet de la celda (4 °C, 192 x g, 5 min). Resuspender las células obtenidas utilizando el medio completo DMEM.
    2. Agregue la suspensión celular a un hemocitómetro y cuente con un contador celular automatizado. Diluir a 5 x 104 células/ml usando medio completo DMEM.
    3. Disuelva 1 g de extracto acuoso de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii en 10 ml de solución de PBS y filtre-esterilice a través de un filtro de 0,22 μm. Diluya la mezcla a 90 mg/ml, 80 mg/ml, 70 mg/ml, 60 mg/ml, 50 mg/ml, 40 mg/ml, 30 mg/ml, 20 mg/ml y 10 mg/ml usando PBS.
    4. Coloque las células diluidas en placas de 96 pocillos con 100 μL por pocillo. Después de la adherencia celular, agregue 1 μL de extractos acuosos de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii de diferentes concentraciones para ajustar la concentración de cada pocillo a 900 μg / ml, 800 μg / ml, 700 μg / ml, 600 μg / ml, 500 μg / ml, 400 μg / ml, 300 μg / ml, 200 μg / ml y 100 μg / ml.
    5. Desechar el medio original después de 24 h de cultivo y añadir 100 μL de medio básico DMEM para su posterior incubación durante 2 h a 37 °C, 5% deCO2.
    6. Después del tratamiento anterior, agregue 20 μL de solución MTS (Tabla de materiales) e incube las células durante otra 1 h a 37 ° C, 5% deCO2.
    7. Transfiera la mezcla incubada a un plato diferente. Mida la absorbancia (OD) en una longitud de onda de 490 nm utilizando un lector de microplacas. Calcule la viabilidad celular utilizando la siguiente fórmula:
      Viabilidad (%) = 100 × (DO de la muestra tratada − DO del medio)/(DO de la muestra de control − DO del medio).
      NOTA: Una concentración mínima cercana a IC50 se define como una dosis alta. La concentración a la que comienza a inhibirse la proliferación celular se define como una concentración de dosis baja, y el valor intermedio se define como una concentración de dosis media para estudios experimentales posteriores. En este estudio, se utilizaron 400 μg/mL, 600 μg/mL y 800 μg/mL como dosis bajas, medias y altas.
  4. Intervención farmacológica y recogida de muestras
    NOTA: El crecimiento celular se trazó contra el tiempo para determinar la fase logarítmica.
    1. Diluir las células A549 de fase de crecimiento logarítmico a 5 x 105 células/ml. Agregue 2 ml de la suspensión celular a una placa de 6 pocillos y crezca durante 12 h.
    2. Repita el paso 2.3.3 para obtener diluciones de PBS de 80 mg/ml, 60 mg/ml y 40 mg/ml de extracto acuoso de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii. Añadir 20 μL de la solución de PBS, 20 μL del extracto acuoso de 40 mg/ml de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii, 20 μL del extracto acuoso de 60 mg/ml de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii y 20 μL del extracto acuoso de 80 mg/ml de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii al grupo control en blanco, grupo de baja concentración, grupo de concentración media y grupo de alta concentración, respectivamente. Desechar el sobrenadante después de 24 h de intervención, y limpiar las células con PBS tres veces.
      NOTA: Las concentraciones del grupo control en blanco, el grupo de baja concentración, el grupo de concentración media y el grupo de alta concentración de extracto acuoso de Trichosanthes-Fritillaria thunbergii fueron 0 μg/mL, 400 μg/mL, 600 μg/mL y 800 μg/mL, respectivamente.
    3. Agregue 250 μL de tampón RIPA (que contiene 1% de PMSF y 1% de inhibidor de fosfatasa) a cada pocillo y lisar las células durante 30 min. Recoger el lisado para centrifugación (4 °C, 6.714 x g, 10 min), y obtener el sobrenadante.
  5. Western blot
    1. Detectar la concentración de proteínas de las muestras por el método BCA de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Utilice el tampón RIPA para ajustar la concentración de cada muestra para que sea consistente.
    2. Mezclar 40 μL de la muestra de proteína con 10 μL de tampón de carga 5x y hervir durante 5 min a 100 °C. Centrifugar (4 °C, 6,714 x g, 10 min) la mezcla para obtener el sobrenadante para experimentos posteriores.
    3. Aislar las proteínas mediante electroforesis en gel mediante electroforesis vertical de 120 V.
    4. Prepare un "sándwich" eléctrico (esponja - papel de filtro - gel - membrana de PVDF - papel de filtro - esponja). Remoje el aparato de transferencia en un baño de hielo y transfiera la proteína a las membranas de PVDF a 70 V durante 60 min.
    5. Use 100 ml de solución TBST (0.05% [v/v] Tween-20, 10 mM Tris, 150 mM NaCl, pH 7.5) y 5 g de leche desnatada en polvo para configurar la leche al 5%. Prediluir los anticuerpos AKT y p-AKT con el diluyente de anticuerpos en una proporción de 1:1.000.
    6. Bloquear la membrana de PVDF en leche desnatada en polvo al 5% durante 1 h con agitación. Después del bloqueo, deseche la leche bloqueante y agregue el anticuerpo primario diluido para la incubación durante la noche a 4 °C.
    7. Después de extraer el anticuerpo primario, use la solución TBST para lavar la membrana de PVDF cinco veces durante 5 minutos cada una.
    8. Prediluir el anticuerpo secundario con el diluyente de anticuerpos en una proporción de 1:5.000. Añadir el anticuerpo secundario e incubar a temperatura ambiente (RT) durante 1,5 h. Después de extraer el anticuerpo secundario, use la solución TBST para lavar la membrana de PVDF cinco veces durante 5 minutos cada una.
    9. Detectar la proteína mediante un sistema de detección de quimioluminiscencia.

3. Acoplamiento molecular

  1. Abra la base de datos UniProt (https://www.uniprot.org)28. Escriba los símbolos de destino en el cuadro de búsqueda y haga clic en el botón BUSCAR . En el subtítulo Estructura , haga clic en Descargar para las estructuras 3D de las dianas proteicas.
  2. Abra la base de datos RCSB PDB (https://www.rcsb.org/pdb/home/sitemap.do)29. Escriba el nombre de las macromoléculas de proteína en el cuadro de búsqueda. Descargue las estructuras de macromoléculas de proteínas en formato PDB.
  3. Descargue el paquete de instalación del software UCSF Chimera 1.16 (https://vina.scripps.edu/) y AutoDock Vina (https://vina.scripps.edu/). Instale y abra el software UCSF Chimera 1.16. Haga clic en Archivo > Abrir para mostrar la proteína receptora.
  4. Haga clic en Herramientas > Edición de estructuras > Preparación del muelle y marque Eliminar solvente, Agregar hidrógenos y Agregar cargas en la ventana emergente para eliminar el agua y agregar cargas de hidrogenación y equilibrio. Haga clic en Escribir archivo Mol2 para guardar la proteína receptora en formato mol2. Realice el mismo paso en el ligando.
  5. Haga clic en Archivo > Abrir para mostrar el ligando de formato mol2 en el software UCSF Chimera 1.16. En Tools > Surface/Binding Analysis > AutoDock Vina, establezca la barra del receptor en el nombre de la proteína receptora y la barra del ligando en el nombre del ligando. Introduzca un valor en el cuadro detrás de Centro y Tamaño para ajustar el espacio recién desarrollado, lo que permite abarcar completamente el ligando y el receptor.
  6. Haga clic en Aceptar para el cribado virtual de acoplamiento molecular para obtener la ubicación óptima para la unión del ligando al receptor. Registre el valor de energía de enlace en la posición óptima.

4. Análisis estadístico

  1. Abra el software estadístico SPSS 26.0. Haga clic en Archivo > Importar datos para cargar datos.
  2. Presentar los datos experimentales como media ± desviación estándar.
  3. Compare varios grupos utilizando un ANOVA unidireccional.
    NOTA: P < 0,05 fue considerado estadísticamente significativo en este trabajo.

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Resultados

Se identificaron un total de 31 componentes activos relacionados con Trichosanthes-Fritillaria thunbergii, incluidos 21 componentes de Trichosanthes y 10 componentes de Fritillaria thunbergia, así como 144 objetivos correspondientes. En general, se extrajeron 9.049 y 67 genes relacionados con LUAD de la base de datos GeneCards y la base de datos OMIM, respectivamente. Después de eliminar genes duplicados, se identificaron 9.057 genes relacionados con LUAD. La intersección de los genes relacion...

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Discusión

En general, un estudio completo de farmacología de red incluye la identificación de componentes activos a partir de bases de datos, la adquisición de objetivos correspondientes a componentes activos y enfermedades, la construcción de una red de fármacos-componentes-enfermedad-diana, y la predicción de objetivos y vías centrales. La asociación entre los componentes activos y las proteínas centrales (acoplamiento molecular) se predice preliminarmente mediante tecnología informática, y la verificación final se lleva a cabo ...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

Este estudio fue apoyado por el Programa de Capacitación en Innovación de la Universidad de Medicina China de Beijing (No: 202110026036).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0,25% tripsina-EDTAGibcoR001100
A549  línea celularProcellCL-0016
Anticuerpo AKTCST4691S Kit de
ensayo de proteínas BCASolarbioPC0020
Sistema de detección de quimioluminiscenciaShanghai Qinxiang Scientific Instrument FactoryChemiScope 6100
Medio de águila modificado de Dulbecco (DMEM)Solarbio11995
Kit de quimioluminiscencia mejorada (ECL);ABclonalRM00021
Suero fetal bovinoScienCell0025
HRP Cabra Anti-Conejo IgG (H+L)ABclonalAS014
MTS kit de ensayoPromegaG3580
p-AKT anticuerpoCST6040S
Penicilina estreptomicinaGibcoC14-15070-063
Fluoruro de fenilmetanosulfonilo (PMSF)SolarbioP0100
Inhibidor de la fosfatasaBeyotimeP1081
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)SolarbioP1020
Membranas de difluoruro de polivinilideno (PVDF)MilliporeISEQ00010
Solución de lisis RIPASolarbioR0010
Evaporador rotativoFábrica de instrumentos bioquímicos de Shanghai YarongRE52CS-1
Mecanismo de liofilización al vacíoNingbo Scientz BiotechnologySCIENTZ-10
β-Anticuerpo de actinaABclonalAC026

Referencias

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