Summary
현재 프로토콜은 생체 내에서 주사 가능한 생체 반응성 하이드로겔의 치료 효과를 조사하기 위해 현미경을 사용하여 교모세포종(GBM) 재발 절제 후 모델을 설정합니다.
Abstract
종양 재발은 교모세포종(GBM)에서 불량한 예후를 나타내는 중요한 요소입니다. 많은 연구에서 수술 후 GBM의 재발을 예방하기 위한 효과적인 치료 전략을 확인하려고 시도하고 있습니다. 국소 방출 약물을 유지할 수 있는 생체반응성 치료용 하이드로겔은 수술 후 GBM의 국소 치료에 자주 사용됩니다. 그러나 적절한 GBM 재발 절제 후 모델이 없기 때문에 연구가 제한적입니다. 여기에서 GBM 재발 절제 후 모델을 개발하여 치료용 하이드로겔 조사에 적용했습니다. 이 모델은 GBM에 대한 연구에서 널리 사용되는 동소 두개내 GBM 모델을 기반으로 구성되었습니다. 임상 치료를 모방하기 위해 동소 두개내 GBM 모델 마우스에 대해 부분 부분 절제술을 수행했습니다. 잔류 종양은 종양 성장의 크기를 나타내기 위해 사용되었다. 이 모델은 구축하기 쉽고 GBM 외과적 절제의 상황을 더 잘 모방할 수 있으며 절제 후 GBM 재발의 국소 치료에 대한 다양한 연구에 적용할 수 있습니다. 결과적으로, GBM 재발 절제 후 모델은 절제 후 재발에 대한 효과적인 국소 치료 연구를 위한 고유한 GBM 재발 모델을 제공합니다.
Introduction
교모세포종(Glioblastoma, GBM)은 모든 중추신경계 암 중에서 가장 흔한 악성 종양이다 1,2. 수술은 GBM 환자의 1차 치료이며 화학 방사선 요법은 수술 후 주요 보조 치료입니다. 그러나, 종양 재발은 다양한 치료를 받는 대부분의 GBM 환자에서 3-6개월 이내에 종종 발생한다 3,4,5. 따라서 GBM 재발을 예방하기 위한 보다 효과적인 치료 전략을 개발하는 것이 시급합니다.
GBM에 대한 최근의 연구는 재발성 종양보다는 원발성 종양에 주로 초점을 맞추고있다 6. 그러나 클리닉에서 해결해야 할 가장 일반적인 문제는 수술 후 GBM의 재발을 억제하는 방법입니다. 따라서 수술 후 교모세포종의 재발에 대한 연구는 더 많은 관심이 필요하다. 생체반응성 치료용 하이드로겔은 수술 후 종양 재발에 대한 연구에서 가장 많이 사용되는 벡터이다 7,8. 그러나 중추신경계의 특수한 구조로 인해 적절한 GBM 재발 절제 후 모델9를 개발하기 어려우며, 이는 GBM 재발 연구에 매우 중요합니다.
이 연구는 원발성 GBM에 대한 연구에 사용된 동소 두개내 GBM 모델을 기반으로 개선된 GBM 재발 절제 후 모델을 생성했습니다. 이 모델에서, 대부분의 종양은 현미경을 이용한 수술에 의해 제거되고, 잔류 종양은 생체내 생체 발광 이미징 및 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색에 의해 검출된다. 이 모델은 뇌종양 환자의 절제 상태를 모방하며 GBM 재발에 대한 다양한 연구에 사용될 수 있습니다.
Protocol
모든 동물 실험은 난징 의과 대학의 기관 검토위원회와 동물 윤리위원회 (IACUC-1904004)의 승인과 감독을 받았습니다. 생후 6-8주령의 C57BL/6J 암컷 마우스를 본 연구에 사용하였다. 동물들은 상업적 공급원으로부터 입수하였다 ( 재료의 표 참조).
1. 동물 준비
- 생쥐의 체중을 측정하고 50mg/kg 펜토바르비탈 나트륨을 복강내 주사하여 마취합니다(재료 표 참조). 수술 전후 진통을 위해 멜록시캄(5mg/kg; i.p.)을 투여합니다. 12시간/12시간의 명암 주기, 주변 온도 24°C, 상대 습도 50%의 케이지에 마우스를 수용합니다.
참고: 본 연구의 경우, 마우스의 초기 무게는 약 22g이었다. - 실험실 동물 면도기를 사용하여 마우스 머리의 머리카락을 제거하고 머리와 팔다리를 정위 장치에 고정합니다 ( 재료 표 참조).
알림: 사용하기 전에 모든 장비를 소독하십시오. - 클로르헥시딘 또는 포비돈 요오드 스크럽을 최소 3회 번갈아 가며 알코올로 마우스의 머리를 소독하고 멸균 수술용 드레이프로 마우스를 덮습니다. 건조를 방지하기 위해 양쪽 눈에 안과 용 연고를 바르십시오.
- 안과 용 가위로 오른쪽 이마 상단의 정중선을 따라 마우스의 두피를 약 1cm 자릅니다.
참고: 절개하기 전에 페달 반사가 없어 마취의 수술 평면을 확인하십시오. - 헤링본 솔기와 전면 폰타넬 지점이 같은 높이에 위치하도록 정체 장치를 조정합니다.
2. 동소 두개내 GBM 모델의 구성
- 용담 바이올렛2 를 적신 면봉을 사용하여 전면 폰타넬의 앞면으로 1mm, 전면 폰타넬의 오른쪽으로 1.8mm, 전면 폰타넬에서 아래로 3mm 떨어진 지점을 표시합니다( 재료 표 참조).
- 직경 1mm의 미니 두개골 드릴( 재료 표 참조)을 사용하여 점을 뚫어 직경 약 1mm, 깊이 1mm의 기공 크기를 만듭니다.
- 멸균 면봉으로 삼출 된 뇌척수액을 제거하십시오.
- 5 μL의 종양 세포 현탁액(GL261-Luci, 5 × 105 세포 현탁 5 μL의 PBS)을 미세 주사기로 흡인합니다.
참고: GL261-Luci는 상용 소스에서 구입했습니다( 재료 표 참조). - 미세 주사기의 바늘 끝을 두개골 드릴링 구멍에 수직으로 맞추고 바늘 끝이 두개골 평면에 3mm 들어갈 때까지 삽입하고 바늘을 0.5mm 뒤로 되돌립니다7.
- 마이크로시린지를 열고 1μL/min의 속도로 주입합니다.
- 주사 후 10 분 동안 바늘을 유지하십시오.
- 마이크로 주사기를 천천히 빼내고 멸균 된 마른 면봉으로 주입 지점을 누릅니다.
- 비흡수성 수술용 봉합사(10-0, 재료 표 참조)로 두피를 봉합하고 절개 부위를 다시 소독합니다.
- 동물의 건강 상태를 모니터링하고 따뜻한 상태로 유지하십시오.
- 마우스가 깨어난 후 마우스를 하우징 케이지로 다시 이동합니다.
- 생체 내 생체 발광 이미징 시스템(재료 표 참조)으로 마우스를 이미지화하여 종양 보유 후 10일째에 이식된 종양을 검출합니다.
참고: GBM 세포에 로딩된 루시페라아제인 GL261을 생체발광 이미징에 사용했습니다.- 산소 유량이 0.6L/min인 1.5% 이소플루란으로 마우스를 마취합니다. 페달 반사 부족으로 마취 깊이를 확인한 후 플루오레세인칼륨(10mg/mL, 재료 표 참조)을 마우스에 복강 주사하고 11초 후 생체 발광 이미징을 수행합니다. 형광 값이 ~5 × 105에 도달하면 절차가 성공한 것입니다.
참고: 이미징하기 전에 동물을 마취하십시오. 기화된 이소플루란과 함께 공급되는 노즈 콘을 통해 마취를 유지하십시오.
- 산소 유량이 0.6L/min인 1.5% 이소플루란으로 마우스를 마취합니다. 페달 반사 부족으로 마취 깊이를 확인한 후 플루오레세인칼륨(10mg/mL, 재료 표 참조)을 마우스에 복강 주사하고 11초 후 생체 발광 이미징을 수행합니다. 형광 값이 ~5 × 105에 도달하면 절차가 성공한 것입니다.
- 종양 보유에 성공한 마우스를 선택하여 GBM 재발 절제 후 모델을 구성합니다.
3. GBM 재발 절제 후 모델 구축
- 동소 두개내 GBM 모델 마우스의 종양 크기가 ~6.5 × 105가 되면 수술 후 재발 모델에 대한 마우스를 선택합니다.
- 동소 두개내 GBM 모델 마우스의 무게를 측정하고 50mg/kg 펜토바르비탈 나트륨을 복강내 주사하여 마우스를 마취합니다. 수술 전후 진통을 위해 멜록시캄(5mg/kg; i.p.)을 투여합니다.
- 1.2-1.5 단계의 과정을 반복하십시오.
- 두피 조직과 두개골을 분리하고 동소 두개내 GBM 모델을 구축하는 데 사용된 드릴링 구멍을 확인합니다. 구멍이 치유되면 정위 장치를 사용하여 구멍을 식별하고 2.1-2.3 단계에서 언급 한 절차를 따르십시오.
- 두개골 드릴로 구멍 직경을 5mm로 확장하고 멸균 면봉으로 삼출 된 뇌척수액을 제거합니다.
- 현미경을 마우스 머리에 초점을 맞추고 드릴링 구멍이 시야 중앙에 위치하도록 설정을 조정합니다.
- 미세 가위로 수막을 자르고 현미경으로 마이크로 큐렛과 마이크로 메스로 종양 조직의 일부를 제거합니다.
참고: 수막과 관련하여 두개골이 열리면 뇌 조직에 가까운 얇은 막이 수막입니다. - 멸균 거즈로 출혈을 멈추고 멸균 생리 식염수로 절개 부위를 씻으십시오.
- 시중에서 판매되는 하이드로겔(10μL, 재료 표 참조)을 1mL 주사기로 절제된 구멍에 주입하고 비흡수성 수술용 봉합사(10-0)로 두피를 봉합한 다음 절개 부위를 다시 소독합니다(그림 1).
- 동물의 건강 상태를 모니터링하고 마우스를 따뜻하게 유지하십시오.
- 마우스가 깨어난 후 마우스를 하우징 케이지로 다시 이동합니다.
- 1일 후에 이식된 종양을 검출하기 위해 생체 내 발광 이미징을 수행하여 잔류 종양의 크기를 정량화합니다(그림 2 및 그림 3).
- 종말점까지 2일마다 마우스의 무게를 잰다.
참고: 본 연구의 경우, 최종 종점은 30일이었고, 마우스는 복강내 주사와 함께 펜토바르비탈 나트륨의 과다 투여에 의해 안락사되었습니다.
Representative Results
GBM 재발 절제 후 모델의 구성 과정은 그림 1에 나와 있습니다. 종양이 부분적으로 제거된 후의 공동절제술을 현미경 하에서 나타내었다. 하이드로겔을 주사기로 절제강에 주입하여 치료 효과를 입증하였다. 실험 설계의 일정은 도 2A에 도시되어 있다. GBM 세포를 마우스의 뇌에 이식한 후, 종양 성장을 10일째에 생체 내 생체 발광 이미징에 의해 테스트하였다. 11일째에 절제를 시행한 후, 하이드로겔을 절제강에 주입하였다. 잔류 종양 성장을 모니터링하기 위해 생체 내 생체 발광 이미징 테스트를 15일, 20일, 25일 및 30일에 수행했습니다. 그림 2B,C에서 볼 수 있듯이 절제 후 GBM 재발 모델의 종양 크기는 생체 내 생체 발광 이미징 테스트에서 볼 수 있듯이 동소 두개내 GBM 모델의 종양보다 훨씬 작았습니다. 25일째에, 종양은 절제 후 유의하게 재발하였다(도 2D). H & E 염색은 GBM 재발 후 절제 모델이 성공적으로 구성되었고 절제 후 잔류 종양이 유의하게 재발했음을 확인했다 (그림 3A, B).
그림 1: 하이드로겔의 종양 절제 및 주입에 대한 수술 중 모습. 현미경으로 마이크로 큐렛과 마이크로 메스로 종양 조직의 일부를 제거하고, 하이드로겔을 절제강 내로 주입하였다. 스케일 바: 50 μm. 이 수치는 Sun et al.10에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 두개내 및 절제 후 GBM 모델에서 마우스의 실험 설계 및 생체 내 생체 발광 이미징 일정. (A) 절제가 11일째에 수행되었고 생체 내 생체발광 이미징(IV)이 10일째, 15일째, 20일째, 25일째 및 30일째에 수행되었음을 보여주는 실험 설계의 일정. (B) 두개내 GBM 모델 마우스는 10일째에 큰 종양 크기를 보였고, (C) 종양 크기는 11일째 절제 후 유의하게 감소하였고, (D) 절제후 GBM 모델에서 25일째 절제 후 종양 크기가 증가하였다. 대조군에는 치료를받지 않은 GBM 재발 절제 후 모델 마우스가 포함되었습니다. 이 연구에는 총 42마리의 마우스가 사용되었습니다. 스케일 바: 100 μm. 이 수치는 Sun et al.10에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 절제된 GBM 모델로부터의 뇌 조직의 H&E 염색 이미지. (A) 절제강, 잔류 종양 및 정상 뇌 조직을 보여주는 H&E 염색 이미지. 절제 1일 후에 뇌조직을 채취하였다. (B) 재발성 종양 및 정상 뇌 조직을 보여주는 H&E 염색 이미지. 절제 후 12일째에 뇌조직을 채취하였다. 스케일 바: 100 μm. 이 수치는 Sun et al.10에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
수술은 대부분의 GBM 환자에게 첫 번째 선택이다11. GBM의 침습적 성장 특성으로 인해, 미세 신경외과 수술 후에도 소수의 종양 세포가 남아 결국 종양 재발을 초래한다12. 수술 후 GBM의 재발을 억제하는 방법이 GBM 관련 연구의 초점이 되었습니다. 그러나 뇌 조직의 복잡한 해부학적 구조로 인해 적절한 수술 후 GBM 모델의 구축이 이 분야에서 해결해야 할 주요 문제가 되었습니다.
이 연구는 GBM 재발 절제 후 모델을 개발했습니다. 이 모델을 구성하는 과정에서 동소 두개내 GBM 모델의 구성이 중요합니다. 이 모델이 성공적으로 개발된 후에는 적시에 절제술을 수행해야 합니다. 권장 시간은 종양 크기의 형광 값이 약 6.5 × 105 일 때입니다. 생쥐의 폐사율을 줄이기 위해 40mg/kg 1% 펜토바르비탈 나트륨으로 마취 절제술을 복강주사로 시행하였다. 그러나 절제술은 시행하기가 어려웠고 소량의 마취제로 인해 생쥐가 자주 움직였습니다. 이를 바탕으로 마취제 용량을 50mg/kg으로 증량하였다. 마취 용량을 늘린 후 마우스의 수술 중 반응이 사라지고 절제가 성공적으로 수행되었습니다. 이소플루란 가스도 이 프로토콜에 사용할 수 있습니다.
이 연구에서는 GL261-Luci 세포를 사용하여 모델을 개발했습니다. 따라서 향후 프로토콜을 검증하기 위해 더 많은 GBM 세포주를 사용해야 합니다. 프로토콜을 보다 설득력 있게 만들기 위해서는 유전자 조작 GBM 마우스 모델과 같은 다양한 GBM 마우스 모델을 사용해야 합니다. 또한 MRI는 수술 후 종양의 재발을 감지하는 가장 좋은 수단이 될 수 있습니다.
요약하면, 이 작업에서는 GBM 재발 절제 후 모델을 개발했습니다. 이 모델에서는 절제 후 잔류 종양의 성장을 평가하여 종양 재발을 모니터링합니다. 이 모델은 종양 재발을 완전히 모방하는 것으로 간주될 수 없지만 이 모델의 절제 스타일은 GBM 환자의 임상 치료에서 최대한 안전한 수술 표준과 유사합니다. 이 작업은 GBM 재발 절제 후 모델을 구성하는 편리하고 실현 가능한 방법을 제공하며 절제 후 GBM 재발에 대한 연구 분야의 발전을 나타냅니다.
Disclosures
저자는 이해 상충을 선언하지 않습니다.
Acknowledgments
이 작업은 중국 국립 자연 과학 재단 (82071767 및 82171781)의 프로젝트 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gentian violet | Sigma | C6158 | |
| GL261-Luci | Shanghai Zhong Qiao Xin Zhou Biotechnology Co.,Ltd. | ZQ0932 | |
| In vivo bioluminescent imaging system | Tanon | Tanon ABL X6 | |
| Laboratory animal shaver | Beyotime Biotechnology | FS600 | |
| Mice | Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. | ||
| Micro curette | Belevor Medical Co.,Ltd. | ||
| Micro scalpel | Belevor Medical Co.,Ltd. | ||
| Microscope | Shanghai Xiangfan Instrument Co., Ltd | JSZ5A/B | |
| Microsyringe | Hamilton | 87943 | |
| Mini cranial drill | RWD | 78001 | |
| Nonabsorbable surgical suture | Shanghai Yuyan Instruments Co.,Ltd. | ||
| Pentobarbital sodium | ChemSrc | 57-33-0 | |
| PVA-TSPBA hydrogel | Aladdin | 9002-89-5 | |
| Stereotaxic apparatus | RWD | 68043 |
References
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