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Estabelecimento, Manutenção, Diferenciação, Manipulação Genética e Transplante de Organoides de Glândulas Lacrimais de Camundongos e Humanos

Published: February 3, 2023 doi: 10.3791/65040
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1, 1, 1,2
1Hubrecht Institute, Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences (KNAW), University Medical Center Utrecht, 2Oncode Institute, Hubrecht Institute

Summary

Este protocolo descreve como estabelecer, manter, modificar geneticamente, diferenciar, caracterizar funcionalmente e transplantar organoides da glândula lacrimal derivados de tecido primário de camundongo e humano.

Abstract

A glândula lacrimal é um órgão essencial para a homeostase da superfície ocular. Ao produzir a parte aquosa do filme lacrimal, protege o olho do estresse de dessecação e insultos externos. Pouco se sabe sobre a (pato)fisiologia das glândulas lacrimais devido à falta de modelos in vitro adequados. A tecnologia organoide provou ser uma plataforma experimental útil para múltiplos órgãos. Aqui, compartilhamos um protocolo para estabelecer e manter organoides de glândulas lacrimais de camundongos e humanos a partir de biópsias de glândulas lacrimais. Ao modificar as condições de cultura, aumentamos a funcionalidade organoide da glândula lacrimal. A funcionalidade organoide pode ser investigada através de um ensaio de "choro", que envolve a exposição dos organoides da glândula lacrimal a neurotransmissores selecionados para desencadear a liberação de lágrimas em seu lúmen. Explicamos como imaginar e quantificar esse fenômeno. Para investigar o papel de genes de interesse na homeostase da glândula lacrimal, estes podem ser geneticamente modificados. Descrevemos detalhadamente como modificar geneticamente organoides da glândula lacrimal usando editores de base - desde o design de RNA guia até a genotipagem de clones organoides. Por fim, mostramos como sondar o potencial regenerativo de organoides da glândula lacrimal humana por implante ortotópico em camundongos. Juntos, este conjunto de ferramentas abrangente fornece recursos para usar organoides da glândula lacrimal humana e de camundongos para estudar a (pato)fisiologia da glândula lacrimal.

Introduction

A glândula lacrimal é o epitélio glandular responsável pela produção da maior parte da camada aquosa do filme lacrimal1. A camada aquosa do filme lacrimal não contém apenas água para lubrificar a superfície ocular, mas também um grande repertório de componentes antimicrobianos que protegem a superfície ocular deinfecções2. Quando a glândula lacrimal está danificada ou inflamada, ocorre a doença do olho seco, que resulta em desconforto para o paciente e pode, eventualmente, levar à perda da visão3. Ao longo dos anos, sistemas-modelo para estudar a glândula lacrimal, em particular a glândula humana, têm sido limitados 4,5,6. Isso tem contribuído para uma lacuna de conhecimento sobre a função da glândula lacrimal em condições fisiológicas e patológicas.

Recentemente, modelos in vitro têm sido desenvolvidos para estudar a glândula lacrimal em uma placa 7,8,9. Esses organoides da glândula lacrimal são derivados de células-tronco adultas cultivadas como estruturas tridimensionais em uma matriz extracelular suplementada com um coquetel de fatores de crescimento que sustenta suas capacidades regenerativas in vitro7. A vantagem dos organoides derivados de células-tronco adultas (ASC) é que eles podem ser mantidos por muito tempo enquanto recapitulam as características do tecido saudável. Esse tipo de organoide é composto exclusivamente por células epiteliais, ao contrário dos organoides derivados de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC), que também podem conter células estromais, por exemplo. Ao contrário dos organoides derivados de células-tronco pluripotentes (PSC), os organoides ASC são estabelecidos diretamente do tecido adulto e não requerem modificações genéticas para serem expandidos. Os organoides ASC expressam características do adulto10.

Este protocolo contém uma caixa de ferramentas para derivar organoides da glândula lacrimal do tecido primário humano e de camundongo. O protocolo descreve como melhorar ainda mais a funcionalidade dos organoides pela simples retirada do fator de crescimento e como provocar os organoides a secretar fluido lacrimal realizando um ensaio de inchaço. Este protocolo inclui adicionalmente um método de transfecção baseado em eletroporação para engenharia genética de organoides de camundongos usando editores de base derivados de CRISPR. Ao contrário do Cas9 convencional, o uso de editores de base permite a modificação de bases simples no genoma sem gerar uma quebra de fitadupla11,12. Finalmente, descreve-se o transplante ortotópico de organoides da glândula lacrimal humana em camundongos imunodeficientes e a subsequente avaliação histológica do enxerto. Esta ferramenta organoide da glândula lacrimal pode ser usada em pesquisas sobre regeneração e função da glândula lacrimal e para modelagem de doenças genéticas e inflamatórias.

Protocol

Os experimentos com camundongos foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal da Academia Real de Artes e Ciências dos Países Baixos (KNAW) sob a licença do projeto AVD8010020151. Os organoides foram derivados de material excedente de camundongos. As biópsias da glândula lacrimal humana foram coletadas do material residual de pacientes submetidos à cirurgia no University Medical Centre Utrecht (UMCU) após aprovação pelo comitê de ética médica sob o protocolo número 18-740. O protocolo contém várias seções que são descritas na Figura 1.

Figure 1
Figura 1: Visão geral do protocolo. Esta figura destaca as diferentes etapas do protocolo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

NOTA: Todas as composições de meio e tampão estão descritas na Tabela Suplementar 1.

1. Estabelecimento de organoides de glândulas lacrimais humanas e de camundongos

  1. Dissecando a glândula lacrimal de camundongo
    1. Prepare as ferramentas de dissecção, incluindo tesouras, pinças e almofadas de dissecção. Eutanásia de camundongos por inalação de O 2/CO2 13.
    2. Coloque o rato eutanasiado em seu abdômen sobre a almofada de dissecção e fixe seus membros. Molhe os cabelos localizados entre as orelhas dos camundongos e na testa com etanol 70%.
    3. Usando tesoura de dissecção, faça uma abertura atrás do crânio entre as orelhas. Estenda essa abertura sobre a testa até o nariz. Ainda usando tesoura, corte a pele atrás das orelhas para gerar dois retalhos.
    4. Tracionar os retalhos em direção ao nariz com firmeza até que as glândulas lacrimais fiquem expostas, como mostra a Figura 2A. Fixar os retalhos na placa de dissecção. Usando tesoura, faça uma pequena incisão na membrana localizada acima da glândula lacrimal para expor completamente a glândula lacrimal.
    5. Usando a pinça, puxe a glândula lacrimal. Deve haver alguma resistência até que o ducto lacrimal principal seja rompido. Se preferir, corte o ducto lacrimal principal diretamente com tesoura.
    6. Coloque a glândula lacrimal de camundongo em PBS de grau de cultura de tecido até processamento adicional. Prossiga com o processamento da glândula lacrimal dentro de 2-4 h para limitar a morte celular. Se isso demorar mais, colocar a glândula lacrimal de camundongo no meio de coleta de biópsia (Tabela Suplementar 1).
      NOTA: Várias glândulas lacrimais podem ser agrupadas se um grande número de organoides for necessário imediatamente.
  2. Coleta de biópsias da glândula lacrimal humana
    1. Antes da cirurgia, preparar alíquotas de 20 mL do meio de coleta da biópsia (Tabela Suplementar 1) em um tubo de 50 mL, e entregá-las ao cirurgião antes da cirurgia. Este meio pode ser mantido a 4 °C por vários meses.
    2. No dia da cirurgia, deixar o cirurgião colher amostra de um pedaço da glândula lacrimal (geralmente <1 mm3) e guardá-lo no meio de coleta da biópsia (Tabela Suplementar 1) a 4 °C.
    3. Coletar a biópsia para processá-la o mais rápido possível. Idealmente, isso deve ser no mesmo dia dentro de 2 h após a amostragem da biópsia.
  3. Derivação organoide
    1. Preparar com antecedência: matriz extracelular (MEC) descongelada, camundongo à temperatura ambiente (TR) ou meio de expansão humana (Tabela Suplementar 1), colagenase descongelada, meio base (Tabela Suplementar 1), dois bisturis, uma placa de Petri de 10 cm, um filtro de 70 μm instalado em um tubo de 15 mL e placas de suspensão de 12 poços pré-aquecidas a 37 °C por 30 min.
    2. Preparar o meio de digestão combinando todos os componentes mostrados na Tabela Suplementar 1. Pré-molhe os bisturis neste meio para evitar que pedaços de tecido grudem neles.
    3. Recupere o tecido da glândula lacrimal humana ou do rato do meio e coloque-o na placa de Petri.
    4. Usando os bisturis pré-molhados, pique o tecido. Quando os pedaços de tecido forem muito pequenos (ou seja, <0,5 mm3), coloque-os no meio de digestão, raspando-os da placa de Petri com o bisturi. Se a biópsia humana já for muito pequena, coloque-a diretamente no meio de digestão sem picar para evitar a perda de tecido.
    5. Incubar os pedaços de tecido por até 15 min em banho-maria a 37 °C. Inverter o tubo de 15 mL regularmente para ressuspender as peças. Monitore a dissociação celular sob um microscópio de bancada para não digerir excessivamente o tecido.
    6. Enquanto isso, reduza uma pipeta Pasteur colocando sua ponta em uma chama enquanto gira, e pré-molhe-a no meio de base. Para dissociar eficientemente o tecido, certifique-se de que o orifício seja ligeiramente menor do que os maiores pedaços de tecido restantes. Para facilitar o processo de dissociação, pipete a mistura para cima e para baixo a cada 5 min com a pipeta estreitada pré-molhada de Pasteur.
    7. Quando muitas células isoladas e pequenos aglomerados são visíveis ao microscópio, pare a dissociação adicionando 10 mL do meio base. Gire para baixo a 400 x g por 5 min para pellet as células.
    8. Retire o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 10 mL do meio base para repetir a lavagem. Filtrá-lo através de um filtro de 70 μm para remover os grandes pedaços de tecido não digeridos e as fibras colágenas remanescentes, o que impediria a polimerização adequada da MEC. Gire o eluato a 400 x g por 5 min.
      NOTA: Uma pastilha de glóbulos vermelhos indica a presença de glóbulos vermelhos, o que normalmente não dificulta a derivação organoide. No entanto, para algumas aplicações, como citometria de fluxo, as hemácias devem ser lisadas. Para isso, incubar as células em 5 mL de tampão de lise de hemácias frescas em TR por 5 min, e pellet as células a 400 x g por 5 min.
    9. Remover o sobrenadante e ressuspender o pellet de células em 100 μL de MEC fria para uma única glândula lacrimal de camundongo e em 50 μL de MEC fria para uma biópsia humana. Ao ressuspender, tenha cuidado para não fazer bolhas, pois elas também afetariam a polimerização e a estabilidade da MEC.
    10. Semeando até 100 μL de células por poço de uma placa de suspensão de 12 poços. Use um P200 para fazer ~20 gotículas μL no poço. Quanto menores as gotículas, melhor a difusão dos fatores de crescimento e nutrientes através da matriz.
    11. Coloque a placa de cabeça para baixo em uma incubadora umidificada a 37 °C por 20-30 min para permitir que o ECM se solidifique.
    12. Uma vez que a MEC esteja solidificada, adicione ~1 mL de camundongo RT ou meio de expansão humano por poço de uma placa de 12 poços. Refrescar o meio a cada 2-3 dias até que os organoides atinjam um tamanho de 300 μm. Para isso, aspirar o meio no poço e adicionar suavemente o meio de expansão na lateral do poço sem tocar nas gotículas de ECM para não atrapalhá-las.
      NOTA: Primocina (100 mg/mL; 1:1.000 de estoque comercial) pode ser adicionada após o isolamento se ocorrer contaminação bacteriana. No entanto, porque retarda o crescimento organoide também, é preferível não adicioná-lo ou removê-lo após uma ou duas passagens.

2. Expansão dos organoides da glândula lacrimal humana e do camundongo

  1. Após ~7 dias para organoides de camundongos e ~10 dias para organoides humanos, quando os organoides atingirem um tamanho de ~300 μm, remova o meio de cultura.
  2. Ressuspender as gotículas de MEC contendo os organoides em 1 mL de solução de tripsina, pipetando vigorosamente para cima e para baixo com uma P1.000 até que as gotículas se desmoronem. Transfira essa mistura para um tubo de 15 mL e incube-a brevemente em banho-maria a 37 °C.
  3. Após 2-3 min, use uma pipeta de Pasteur estreitada e pré-molhada para pipetar a suspensão organoide para cima e para baixo 10x-15x. Verificar o estado de dissociação dos organoides sob um microscópio de bancada; pequenos aglomerados de ~20 células devem ser obtidos. Incubar por mais tempo em banho-maria a 37 °C e repetir a etapa de pipetagem até que a dissociação seja satisfatória.
    NOTA: Esta etapa pode levar mais tempo para organoides humanos, pois eles são multicamadas. Células únicas serão geradas; Isso não afeta o crescimento organoidal, desde que a maior parte da suspensão organoide consista em pequenos aglomerados.
  4. Interromper a dissociação adicionando 10 mL do meio base. Em seguida, pastilha as células a 400 x g por 5 min.
  5. Após a remoção do sobrenadante e da MEC que pode estar sobre os organoides (camada gelatinosa transparente e sem organoides), ressuspenda as células em um volume apropriado de MEC fria antes de plaquear em uma placa de suspensão, conforme indicado no passo 1.3.10.
    NOTA: Geralmente, os organoides lacrimais de camundongos são divididos em uma proporção de 1:5 e os organoides humanos em uma proporção de 1:3. Isso significa que, ao iniciar com organoides contidos em 100 μL de MEC, eles precisam ser ressuspensos em 500 μL e 300 μL, respectivamente, após a divisão.
  6. Incubar a placa de cabeça para baixo em uma incubadora de 37 °C até a solidificação da MEC por 30 min e cobrir os organoides com o camundongo ou meio de expansão humano em RT.

3. Criopreservação dos organoides da glândula lacrimal humana e de camundongos

  1. Para criopreservar os organoides, primeiro divida os organoides no meio de expansão de acordo com as instruções dadas na seção 2.
  2. Cerca de 3-4 dias depois, quando os organoides estiverem em fase de crescimento, remova o meio e ressuspenda 100 μL da MEC contendo organoides em 10 mL de meio base fria. Incubar no gelo por 10 min para ajudar a dissociar a MEC. Vire o tubo regularmente para facilitar esse processo.
  3. Pellet os organoides a 500 x g por 5 min. Retirar o sobrenadante e ressuspender o organoide em 1 mL de meio de criopreservação (a sobra da MEC não prejudica a criopreservação). Transfira a suspensão organoide para um criovial e imediatamente para um congelador de −80 °C.
    NOTA: Ao usar o meio de criopreservação descrito na Tabela de Materiais, os crióvios podem ser mantidos indefinidamente em um freezer de −80 °C. Se outro meio de criopreservação for usado, transfira o criovial para um tanque de nitrogênio líquido após 24 h para garantir a preservação ideal.
  4. Para descongelar os organoides, retire o criovial do congelador e transporte-o em gelo seco para um banho-maria a 37 °C. Segure o criovial na água até que a maior parte do seu conteúdo esteja descongelado. Transfira o conteúdo para um tubo de 15 mL contendo 10 mL de meio base e gire as células a 400 x g por 5 min.
  5. Placatear os organoides em 100 μL de MEC com o meio de expansão, conforme descrito nas etapas 2.5 e 2.6.

4. Diferenciar organoides da glândula lacrimal e avaliar sua funcionalidade

  1. Diferenciação organoide
    1. Para diferenciar organoides da glândula lacrimal, primeiro divida os organoides no meio de expansão de acordo com as instruções na seção 2.
    2. Após 2 dias, substituir o meio de expansão por meio de diferenciação rato ou humano, conforme descrito no passo 1.3.12. Atualize o meio a cada 2-3 dias para manter os organoides do rato por 5 dias nesse meio e os organoides humanos por 9 dias.
    3. Para avaliar a diferenciação organoide após 5 ou 9 dias no meio de diferenciação, coletar 100 μL de MEC contendo organoides para extrair o RNA. Para tanto, ressuspenda as gotículas da MEC em 1 mL de meio contido no poço com P1.000 e transfere a suspensão organoide em 3 mL de meio base gelado. Pellet os organoides a 500 x g por 5 min.
    4. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet em tampão de extração de RNA. Realizar a extração de RNA a jusante de acordo com as instruções do kit de extração de RNA. Use o RNA obtido, por exemplo, para análise RT-qPCR da expressão de células-tronco (TP63, KRT5, KRT14) e marcadores celulares diferenciados (LCN2, WFDC2, AQP5, LTF, ACTA2...) 14º.
      NOTA: Para obter a análise de expressão relevante, meça a expressão dos marcadores escolhidos em uma ou várias amostras de tecido. Organoides cultivados em condições de diferenciação tendem a conter menos RNA.
  2. Ensaio de inchamento funcional
    NOTA: Para esta parte do protocolo, use organoides da glândula lacrimal humana que tenham sido diferenciados por pelo menos 7 dias. O tempo mínimo necessário é de 7 dias para garantir expressão suficiente do marcador para o lacrimejamento funcional. Cada poço de uma placa de 12 poços constitui uma condição. O número mínimo de condições é três: um controle positivo, um controle negativo e uma condição de teste.
    1. Preparar na hora 1 mL de meio de diferenciação humana contendo componentes individuais que induzem a secreção pelos organoides da glândula lacrimal. Por exemplo, adicione 100 μM de noradrenalina e 1 μM de forskolina, e misture bem.
      NOTA: Forskolin serve como um controle positivo que geralmente induz o inchaço máximo.
    2. Em um microscópio de lapso de tempo de campo claro automatizado, defina as posições a serem obtidas na placa, o intervalo de tempo (5 min) e a duração (4 h). Certifique-se de que uma gota inteira de ECM esteja visível em cada posição.
    3. Imediatamente antes de iniciar a obtenção de imagens e sem mover a placa do microscópio, retire o meio de cultura dos poços que serão fotografados e substitua-o pelo meio bem ressuspendido preparado na etapa 4.2.1. Incluir como controle negativo um poço com meio de diferenciação substituído apenas por meio de diferenciação, pois o refresco médio pode desencadear algum inchaço organoide.
    4. Após até 4 h, o ensaio de inchaço termina. Analise os resultados.
      NOTA: Essas etapas são executadas com um microscópio EVOS M7000 que permite imagens automatizadas de lapso de tempo de campo brilhante. Para esse microscópio, consulte o manual detalhado do fabricante para configurar a imagem de lapso de tempo. Vale ressaltar que qualquer outro microscópio com características semelhantes pode ser usado.
    5. Para quantificar o inchaço organoide, meça o diâmetro de cada organoide individual em 0 h e 4 h. Abra as imagens de uma única gota organoide a 0 h e 4 h no ImageJ.
    6. Clique no ícone Linha reta na barra de ferramentas e primeiro desenhe o diâmetro de um organoide em 0 h. Em seguida, use a ferramenta Medir no ImageJ (Analyze > Measure) para medir o comprimento dessa linha e, portanto, o diâmetro do organoide antes do inchaço. Repita o processo no mesmo organoide em 4 h para obter o diâmetro do organoide após o inchaço.
    7. Meça o diâmetro organoide de ~20 organoides por condição antes e depois do ensaio de inchaço.

5. Construindo um plasmídeo para nocautear Pax6

  1. Projeto de gRNA para nocaute Pax6 usando editores de base C > T
    NOTA: Há uma abundância de programas de software disponíveis para o design de gRNA. Aqui, o Benchling foi usado, pois isso permite o design integrado de gRNA, anotação e o alinhamento dos traços de Sanger. Todas as etapas subsequentes podem, portanto, também ser realizadas usando programas de software alternativos.
    1. Inicie o processo de design de gRNA visualizando o gene alvo no Benchling clicando em Nova (+) > Sequência de DNA > Importar Sequências de DNA.
    2. Na guia Importar do Banco de Dados, digite o gene de interesse, Pax6, e pressione Pesquisar.
    3. Selecione a compilação mais recente do genoma de referência do mouse GRCm38 (mm10, Mus musculus) e pressione Importar.
    4. Selecione o éxon onde o gRNA nocaute pode ser projetado aderindo às seguintes regras:
      1. Evite colocar um gRNA no primeiro éxon codificador, porque locais de início alternativos em éxons subsequentes podem ser usados pela célula para contornar o códon de parada induzido precocemente.
      2. Projetar gRNAs em éxons que estão presentes em todos os transcritos alternativos que podem ocorrer por splicing do mRNA Pax6 . Para garantir isso, visualize Pax6 no navegador do genoma Ensembl e selecione o exon que é usado em todas as transcrições.
      3. Para contornar ainda mais o splicing alternativo, mire um éxon que tenha um códon incompleto (uma ou duas bases restantes de um triplete). Isso é de menor importância, mas dá mais certeza sobre os efeitos dos indels induzidos. Para a Pax6, o exon 4 ao exon 11 são um bom alvo. Além disso, escolha um éxon que contenha resíduos de triptofano (W), glutamina (Q) ou arginina (R).
        NOTA: Os editores de base C > T padrão que usam SpCas9 têm uma janela de edição que se estende do nucleotídeo 4 ao nucleotídeo 8 desde o início do gRNA (mais distante do PAM). Os editores de base C > T podem introduzir códons de parada em todos os resíduos de triptofano (W) (TGG para TGA, TAG ou TAA) com um gRNA na fita reversa, em resíduos de glutamina (Q) (CAG para TAG ou CAA para TAA) e, por último, em resíduos de arginina (R) (CGA para TGA) na fita direta.
    5. Selecione o exon + 20 bases upstream e downstream. Clique no lado direito da tela no sinal de destino CRISPR e clique em Projetar e analisar guias.
    6. No menu recém-aberto, na aba Design Type, marque os Guias para "edição base" (Komor et al., 2016). Mantenha o comprimento do guia em 20 nucleotídeos e, em Genoma para mouse, selecione GRCm38 (mm10, Mus musculus).
    7. Depois de clicar no sinal verde + , o programa de software detectará automaticamente todas as sequências de motivos adjacentes (PAM) do protoespaçador e, no lado direito da tela, criará uma lista de todos os potenciais gRNAs na área ao redor do éxon de interesse.
    8. Percorra a lista até o sinal do códon de parada (*) em uma caixa vermelha, que sinaliza para um gRNA que pode potencialmente transformar um aminoácido em um códon de parada e, assim, resultar em um nocaute.
    9. Na primeira coluna à direita da sequência de gRNA, para cada alvo "C" ao redor da janela de edição, as eficiências de edição previstas in silico são calculadas. Certifique-se de que a edição C > T que resulta no códon stop tenha uma eficiência de edição de pelo menos ~10.
    10. Clique no valor na coluna Off-Target para verificar a quais loci fora do destino o gRNA poderia se ligar. Evite escolher um gRNA que se liga a quaisquer genes adicionais para aumentar a especificidade. Por exemplo, um bom gRNA para editar Pax6 com um editor de base C > T tem como alvo o éxon 7 e é 5'-AAGCAACAGATGGGCGCAGA-3'.
    11. Crie uma anotação no arquivo Benchling clicando no ícone Anotações no canto superior direito da tela, seguido por Nova Anotação. Nomeie a anotação e verifique se a orientação correta do gRNA está selecionada no menu suspenso Strand.
  2. Geração de plasmídeos de gRNA
    NOTA: Existem vários vetores disponíveis para entrega de gRNA em organoides. O seguinte plasmídeo foi usado como base para a construção do gRNA: pFYF1320 (Addgene #47511, um presente gentil de Keith Joung).
    1. Para clonar os gRNAs em pFYF1320, implemente uma estratégia de PCR inversa utilizando o primer forward padrão: "/5phos/ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGC. Para projetar o primer reverso, cole o complemento reverso da sequência espaçadora de gRNA (verifique a orientação do gRNA [+ ou - strand]) na frente da seguinte parte universal do primer reverso: CGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG. Para atingir o éxon 7 do mouse Pax6 usando o editor de base C > T, o primer reverso é o seguinte: TCTGCGCCCATCTGTTGCTTCGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG. Encomende os dois primers.
    2. Executar uma reação de PCR inversa usando 1 ng de pFYF1320 como molde usando uma DNA polimerase de alta fidelidade por 35 ciclos a uma temperatura de recozimento de 61 °C.
    3. Execute a reação de PCR em um gel de agarose a 1% em tampão TAE a 100 V por ~45 min para visualizar o fragmento esperado de 2.281 pares de bases (pb). Realize uma limpeza em gel usando o kit de sua preferência.
    4. Configure a seguinte reação de ligadura: 100 ng de produto de PCR limpo, enzima Dpn1 para remover o DNA do molde pFYF1320 inicial e ligase T4. Incubar a mistura durante 15 min a 20 °C, 30 min a 37 °C e 20 min a 80 °C.
    5. Transformar a mistura de reação em bactérias DH5α quimicamente competentes e espalhar as bactérias em placas de ágar contendo ampicilina15.
    6. No dia seguinte, colher e expandir três colônias individuais em 3 mL de caldo lisogênico (LB) meio suplementado com 50 μg/mL de ampicilina.
    7. No dia seguinte, realizar um miniprep em 1 mL de cada uma das três miniculturas usando um kit miniprep e armazenar o restante a 4 °C. Submeter o plasmídeo obtido ao sequenciamento de Sanger com o primer U6_Forward para garantir que o gRNA seja inserido corretamente no vetor16.
    8. Após identificar uma única colônia bacteriana com o plasmídeo correto, inocular 500 μL da minicultura correspondente em 50 mL de LB suplementado com ampicilina para amplificar o DNA plasmidial durante a noite. Realize uma preparação midi no dia seguinte ao uso de um kit midiprep. Este plasmídeo será utilizado para a eletroporação na seção 6.

6. Geração de clones Pax6 KO

  1. Eletroporação organoide
    1. Comece com organoides de camundongo que foram divididos no máximo 5 dias antes para que eles estejam em um estado proliferativo. Use ~300-400 μL de gotículas organoides por knock-out. Incluir uma condição adicional para selecionar um controle negativo que será eletroporado sem qualquer plasmídeo.
    2. Execute as etapas 2.1-2.4 para dissociar os organoides, mas dissociar os organoides por mais tempo para que sejam células únicas. Descarte o sobrenadante.
    3. Ressuspender as células em 80 μL do tampão de eletroporação.
    4. Em um tubo de 1,5 mL, prepare os seguintes plasmídeos para um máximo de 20 μL: 2,5 μg de plasmídeo pFYF1320-gRNA, 2,8 μg de plasmídeo contendo transposase, 7,2 μg de plasmídeo contendo transposon resistente à higromicina e 7,5 μg de pCMV_ABEmax_P2A_GFP.
      NOTA: O plasmídeo pFYF1320-gRNA codifica o gRNA projetado anteriormente, que orienta o editor de base para o locus alvo. O plasmídeo pCMV_ABEmax_P2A_GFP codifica o editor de base, bem como um repórter GFP, que pode ser usado para monitorar as células que expressam o editor de base após a eletroporação. O plasmídeo contendo transposase codifica a transposase, que cola o de resistência à higromicina fornecido pelo plasmídeo contendo transposon de resistência à higromicina em algum lugar aleatoriamente no genoma. As células que incorporaram este em seu genoma tornam-se resistentes à higromicina e podem ser selecionadas positivamente pela adição de higromicina. Como a co-incorporação de vários plasmídeos é muito provável, a resistência à higromicina constitui uma seleção funcional a ser enriquecida para células que foram editadas para Pax6.
    5. Adicione os plasmídeos às células e misture bem, pipetando para cima e para baixo.
    6. Montar o eletroporador com os seguintes parâmetros para o pulso de poragem (tensão: 175 V; comprimento de pulso: 5 ms; intervalo de pulso: 50 ms; número de pulsos: 2; taxa de decaimento: 10%; polaridade: +) e para pulso de transferência (tensão: 20 V; comprimento de pulso: 50 ms; intervalo de pulso: 50 ms; número de pulsos: 5; taxa de decaimento: 40%; polaridade: +/-).
    7. Coloque as células com os plasmídeos em uma cubeta de eletroporação. Meça imediatamente a resistência (Ω), que deve estar entre 0,30 A e 0,55 A, e eletropore imediatamente. Realizar essa etapa rapidamente é necessário para evitar que as células se instalem no fundo da cubeta e reduzam a eficiência da eletroporação.
    8. Transferir as células para um tubo de 1,5 mL e adicionar 400 μL de tampão de eletroporação suplementado com um inibidor de Rho-quinase. Deixe as células se recuperarem em RT por 30 min.
    9. Pellet as células a 500 x g por 5 min, descartar o sobrenadante e plaquear as células em 200 μL de MEC. Após a solidificação, adicione o meio de expansão do mouse.
    10. Os organoides císticos crescem após 2-3 dias. Monitore o sinal GFP, que revela a presença do editor de base C > T, diariamente.
  2. Seleção de organoides
    1. Após ~3 dias, quando os organoides tiverem se recuperado, adicione 100 μg/mL de higromicina ao meio de expansão do camundongo para selecionar organoides que integraram o de resistência à higromicina. Há uma alta probabilidade de que as células que absorvem um plasmídeo absorvam vários plasmídeos. Ao selecionar organoides resistentes à higromicina, organoides editados no locus Pax6 são enriquecidos.
    2. Quando todas as células no controle negativo estiverem mortas e os organoides sobreviventes forem ~300 μm, escolha os organoides resistentes à higromicina.
  3. Colheita e genotipagem de organoides
    1. Preparar pontas P20 estéreis junto ao microscópio e tubos de 1,5 ml contendo 100 μL de solução de tripsina cada sobre gelo.
    2. Dobre uma ponta P20 com pinças. Observe a placa contendo os organoides sobreviventes em um microscópio de bancada. Quando um organoide sobrevivente estiver em foco, remova a tampa da placa. Usando a ponta P20 dobrada e ainda sob o microscópio, aspirar cada organoide sobrevivente individualmente e colocar cada um deles em um tubo separado contendo solução de tripsina.
    3. Pegue até 20 clones. O número de clones a serem escolhidos depende do número de clones necessários para cada planejamento experimental e da eficiência de edição, que varia de acordo com cada gRNA e locus.
    4. Quando todos os clones tiverem sido colhidos, colocar os tubos de 1,5 mL em banho-maria a 37 °C por até 5 min. Vórtice cada tubo regularmente para aumentar a velocidade de dissociação, e verifique os organoides sob o microscópio de bancada. Quando os organoides são dissociados em pequenos aglomerados e/ou células únicas, pare a digestão adicionando 1 mL de meio base.
    5. Para cada clone colhido, manter ~400 μL para genótipo em um tubo separado de 1,5 mL. Gire os ~600 μL deixados a 500 x g por 5 min, remova o sobrenadante, ressuspenda as células em 20 μL de MEC, plaqueie-as como uma única gota em um poço de uma placa de 24 poços e adicione meio de expansão de camundongo sem higromicina.
    6. Para genotipar os clones, gire os tubos contendo ~400 μL de suspensão celular a 500 x g por 5 min, remova o sobrenadante e ressuspenda as células em 50 μL de tampão de extração de DNA para extrair o DNA.
    7. Incubar imediatamente as células da seguinte forma: 6 min a 60 °C, vórtice e 4 min a 95 °C. Esse DNA pode ser mantido por até 7 dias a -20 °C, mas realizar o PCR a jusante imediatamente é o ideal.
    8. Para amplificar o locus alvo com a nuclease, realizar uma PCR em 2 μL do DNA extraído usando iniciadores de genotipagem adequados previamente ordenados e uma polimerase de baixa fidelidade. Os primers de genotipagem são AGACTGTTCCAGGATGGCTG (Pax6_C>T_F) e TCTCCTAGGTACTGGAAGCC (Pax6_C>T_R). O amplicon deve iniciar cerca de 100 pb a partir do locus editado esperado para garantir que ele seja sequenciado de forma eficiente.
    9. Executar o produto de PCR em um gel de agarose para avaliar a eficiência da PCR, conforme mencionado na etapa 5.2.3. Quando uma banda do tamanho correto for detectada, corte-a do gel para realizar uma extração de gel de DNA usando um kit.
    10. Sequenciar o DNA extraído de cada clone organoide previamente colhido com os primers de genotipagem.
    11. Alinhar as sequências obtidas ao gene Pax6 em Benchling. Abra a sequência genética importada a partir do passo 4.1. Clique em Alinhamentos no lado direito e, em seguida, em Criar novo alinhamento. Carregue os arquivos .ab1 obtidos do provedor de sequenciamento, selecione DNA como um tipo de nucleotídeo e pressione Avançar.
    12. Na janela a seguir, selecione Multiseqüência e o programa de alinhamento Automático (MAFFT) antes de clicar em Criar alinhamento.
    13. Identificar os genótipos que possuem códon de parada prematura homozigótica (obtido com editores de base) em ambos os alelos. Mantenha os clones organoides correspondentes para expandir e criopreservá-los para análise posterior. Idealmente, três diferentes clones de organoides devem ser analisados lado a lado para contornar potenciais efeitos de nucleases fora do alvo.

7. Transplante ortotópico de organoides da glândula lacrimal humana em camundongos NSG

  1. Preparação de organoides
    1. Os organoides da glândula lacrimal humana devem ser divididos ~3 dias antes do dia do transplante, conforme descrito na seção 2. No dia do transplante, certifique-se de que os organoides estejam na fase proliferativa para aumentar as chances de enxerto.
    2. Para extrair os organoides da MEC, adicionar dispase ao meio de cultura até atingir uma concentração final de 0,125 U/mL. Usando um P1.000, ressuspenda completamente as gotículas de ECM para interrompê-las e coloque a placa de volta na incubadora de 37 °C por 30 min. Um volume de 100 μL de MEC é suficiente para injetar ~10 glândulas lacrimais.
    3. Ressuspender os organoides em 10 mL de meio base para lavar a enzima. Pastilhar as células a 400 x g por 5 min.
    4. Ressuspender as células (~1.500.000) em 50 μL de meio de expansão humano frio suplementado com ECM a 5%. Coloque a suspensão organoide no gelo e proceda imediatamente ao transplante.
  2. Transplante ortotópico em camundongos
    1. No biotério, coloque a suspensão organoide e agulhas de insulina no gelo. Aspirar a suspensão organoide em uma agulha fria de insulina.
    2. Sedar um camundongo imunodeficiente NOD scid gama (NSG) com isoflurano a 3% para iniciar a anestesia. Quando o rato estiver dormindo, coloque-o rapidamente de lado com a glândula lacrimal principal (localizada a meio caminho entre o olho e a orelha) acessível.
    3. Injetar 5 μL da suspensão organoide diretamente através da pele na glândula lacrimal. O volume máximo que uma glândula lacrimal de camundongo pode conter é de 5 μL.
    4. Permita que o mouse se recupere e monitore o mouse todos os dias para avaliar a presença de qualquer desconforto relacionado ao transplante, especialmente no olho.
  3. Avaliar enxerto
    1. Sacrificar o camundongo com inalação de O 2/CO2 após até 90 dias, dependendo se o enxerto de curto ou longo prazo deve ser avaliado13.
    2. Dissecar a glândula lacrimal conforme descrito na secção 1. Fixe em formalina a 4% por 24 h no RT.
    3. Coloque a glândula lacrimal em um. Desidratar a glândula lacrimal incubando-a da seguinte forma: 2 h em etanol 70%, 2 h em etanol 96%, 1 h em etanol 100% (2x), 2 h em xileno e pernoite em parafina líquida a 58 °C no forno.
    4. No dia seguinte, orientar a glândula lacrimal como preferir em um molde metálico, completar com parafina líquida e deixar o bloco solidificar em uma superfície fria. Este processo é melhor executado com uma máquina de incorporação.
    5. Quando o bloco de parafina estiver sólido, corte todo o bloco em seções de 4-5 μm usando um micrótomo. Mantenha todas as seções (em forma de fitas) em um ambiente seco e sem correntes de ar. As seções podem ser mantidas indefinidamente à temperatura ambiente.
    6. Amostra de uma em cada 10 seções que abrangem todo o bloco.
      1. Monte as seções em uma lâmina da seguinte forma: coloque uma gota de água no escorregador, coloque a seção em cima, deixe descansar por ~2 min para permitir que ela se estique em uma placa quente de 42 °C e remova a água suavemente com papel.
      2. Coloque as lâminas para secar durante a noite em forno a 58 °C. Os slides podem ser mantidos indefinidamente no RT após este estágio.
    7. Para distinguir células humanas de células de camundongo, realizar coloração de antígeno nuclear humano nessas seções. Reidratar as seções realizando as seguintes lavagens: 3 min em xileno (2x), 1 min em etanol 100% (2x), 1 min cada em etanol 96%, etanol 90%, etanol 80%, etanol 70%, etanol 70%, etanol 60% e etanol 25% e, finalmente, 1 min em água demi (2x).
    8. Incubar as lâminas por 15 min em tampão PO (Tabela Suplementar 1). Lave as lâminas 3x em água ultrapura.
    9. Realizar uma recuperação de antígeno à base de citrato na autoclave:
      1. Coloque as lâminas em um suporte de corrediça à prova de autoclave em uma cesta cheia de tampão citrato (Tabela Suplementar 1). Coloque o cesto na autoclave e execute um ciclo de autoclave (pressão: 10 PSI; temperatura: 121 °C; tempo: 15 min).
      2. Quando a autoclave estiver despressurizada, recupere o cesto contendo as lâminas e coloque-o em banho-maria RT para levar as lâminas para RT.
        NOTA: A estratégia de recuperação de antígeno depende do anticorpo usado. Consulte a ficha técnica do provedor para realizar a recuperação de antígeno mais adequada.
    10. Coloque as lâminas horizontalmente, do lado da seção para cima, em uma bandeja de incubação. Adicionar 500 μL de tampão de bloqueio contendo 1% de albumina de soro bovino (BSA) em PBS por cima e incubar por 1 h. Remova o buffer de bloqueio.
    11. Preparar a solução de anticorpos adicionando 1 μL de anticorpo-anticorpo nucleolar humano a 500 μL de tampão de bloqueio por lâmina a ser corada. Adicione a solução de anticorpos a cada lâmina. Incubar durante a noite numa bandeja de incubação humidificada a 4 °C.
    12. No dia seguinte, lave as lâminas 3x em PBS. Incubar as lâminas com anticorpo secundário anti-camundongo HRP não diluído por 45 min. Lave as lâminas 3x em PBS.
      CUIDADO. Em uma capa química, prepare o tampão DAB (Tabela Suplementar 1). Incube as lâminas com buffer DAB por 10 min. Descarte qualquer resíduo em recipientes de resíduos líquidos químicos orgânicos.
    13. Lave as lâminas com água. Incubar as lâminas por 2 min em hematoxilina para contracoloração dos núcleos. Lave as lâminas em água corrente da torneira por 10 min.
    14. Desidratar as lâminas incubando-as por 1 min cada em etanol 50%, etanol 60%, etanol 70%, etanol 80% e etanol 90%, 1 min em etanol 96% (2x), 1 min em etanol 100% (2x) e 1 min em xileno (2x).
    15. Feche as corrediças com meio de montagem e uma lamínula. Após a secagem por cerca de 20 min, observe as lâminas ao microscópio.
    Eu>

Representative Results

Após a dissecção da glândula lacrimal de camundongos (Figura 2A), a digestão enzimática e mecânica gerou pequenos fragmentos de tecido, entre os quais foi possível distinguir os ácinos e ductos (Figura 2B). Os grandes pedaços de tecido remanescentes desestabilizariam a MEC, o que reduziria o crescimento organoide inicial. A derivação organoide da glândula lacrimal de camundongo foi bem sucedida quando organoides císticos de ~500 μm de diâmetro foram encontrados após ~7 dias, estágio em que os organoides estavam prontos para serem divididos (Figura 2C). Mesmo que a derivação organoide geral seja bem-sucedida, alguns organoides podem começar a crescer antes de parar eventualmente. Os organoides da glândula lacrimal humana cresceram como cistos dentro de 3-4 dias e atingiram o tamanho completo em 10-14 dias após o isolamento do tecido (Figura 2D). Tanto para camundongos quanto para humanos, a derivação organoide às vezes falhava, com nenhum ou poucos organoides crescendo; Isso foi geralmente causado pela digestão excessiva do tecido. Os organoides da glândula lacrimal de camundongo poderiam ser passados pelo menos 40x e os organoides humanos pelo menos 20x. A passagem foi feita a cada 7-10 dias, em média, dependendo do crescimento organoide.

Figure 2
Figura 2: Estabelecimento dos organoides das glândulas lacrimais de camundongos e humanos. (A) Fotografias dos diferentes estágios da dissecção da glândula lacrimal de camundongos. A seta aponta para a glândula lacrimal sob sua membrana protetora. (B) Imagens de campo claro de células da glândula lacrimal de camundongos logo após a digestão do tecido, com inserções mostrando um ácino e um ducto. (C) Imagens de campo brilhante de uma derivação organoide da glândula lacrimal de camundongo bem-sucedida e malsucedida. (D) Imagens de campo claro do crescimento organoide humano ao longo de 14 dias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Os organoides da glândula lacrimal contêm uma grande proporção de células-tronco quando cultivadas no meio de expansão. Para aumentar seu nível de diferenciação, montamos um camundongo e um meio de diferenciação humano com reduzido teor de fator de crescimento. Após 5 e 7 dias, respectivamente, no meio de diferenciação, os organoides das glândulas lacrimais de camundongo e humano tornaram-se mais densos (Figura 3A-B). Essa alteração morfológica correlacionou-se com o aumento das propriedades funcionais. A aplicação do ativador cíclico de AMP forskolina ou do neurotransmissor noradrenalina resultou em inchaço organoide (isto é, secreção de água apical) em menos de 3 h (Figura 3C). Quando o inchaço demorava mais de 3-4 h, isso sugeria que os organoides não eram suficientemente diferenciados e/ou não expressavam marcadores funcionais, como receptores para neurotransmissores.

Figure 3
Figura 3: Diferenciação dos organoides das glândulas lacrimais de camundongos e humanos e ensaio de inchamento funcional em organoides humanos. (A) Imagens de campo claro de organoides da glândula lacrimal de camundongos cultivados em meio de expansão por 7 dias e em meio de diferenciação por 5 dias após 2 dias em meio de expansão. (B) Imagens de campo claro de organoides da glândula lacrimal humana cultivados em meio de expansão por 11 dias e em meio de diferenciação por 9 dias após 2 dias em meio de expansão. (C) Imagens de campo claro de organoides diferenciados da glândula lacrimal humana expostos a meio de diferenciação fresco (controle), a forskolina a 1 μM e a noradrenalina a 100 μM ao longo de 3 h. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para nocautear a Pax6 em organoides da glândula lacrimal de camundongos, um plasmídeo contendo o gRNA direcionado para Pax6 escolhido foi gerado por PCR e ligadura (Figura 4A). Este plasmídeo contendo gRNA foi eletroporado juntamente com os plasmídeos Piggy-Bac (plasmídeos contendo e contendo transposase de resistência à higromicina) e o editor de base C > T Cas9 em organoides da glândula lacrimal de camundongos dissociados em células únicas. Após 3 dias, quando os organoides se recuperaram, eles foram expostos à higromicina para selecionar clones que incorporaram o de resistência à higromicina. Em eletroporações bem-sucedidas, organoides resistentes à higromicina cresceram (Figura 4B). Os clones organoides em crescimento maiores que ~300 μm foram colhidos, idealmente antes de começarem a se diferenciar espontaneamente (Figura 4C). O DNA foi extraído de parte do organoide, mantendo-se o restante em cultura. A amplificação por PCR do locus Pax6 alvo do gRNA produziu uma banda de 367 pb para cada um dos clones escolhidos (Figura 4D). Após o sequenciamento do locus amplificado, clones homozigicamente editados em C > T (n = 1) foram mantidos. Por outro lado, clones não editados (n = 4), heterozigicamente editados ou editados incorretamente (n = 1) foram descartados (Figura 4E). Em geral, usando este gRNA visando Pax6, um clone homozigoto knock-out da glândula lacrimal de camundongo de seis sequenciados foi obtido. Alguns clones cresceram bem, mas alguns clones organoides foram perdidos após a colheita ou começaram a se diferenciar (Figura 4F). Dos 10 clones organoides colhidos, 7 cresceram bem.

Figure 4
Figura 4: Knock-out mediado por edição de base da Pax6 em organoides da glândula lacrimal de camundongos. (A) Traço de sequenciamento de Sanger do pFYF1320 após a integração correta do gRNA visando o locus Pax6. (B) Imagens de campo claro de organoides da glândula lacrimal de camundongos 5 dias após exposição à higromicina após eletroporação. Os organoides foram cultivados em meio de expansão de camundongos. À esquerda está um exemplo de eletroporação falhada, sem clone resistente à higromicina crescendo. À direita está um exemplo de eletroporação bem-sucedida, com vários clones organoides resistentes à higromicina sobrevivendo. (C) Imagens de campo brilhante de clones que devem ser escolhidos e clones que não devem ser selecionados. (D) Gel de agarose mostrando a amplificação do locus Pax6 alvo com o gRNA. Em verde, destaca-se a faixa do tamanho esperado de 367 pb. (E) Sequenciamento de Sanger de três clones organoides resistentes à higromicina. O clone superior não é editado. O clone do meio é uma edição C > T homozigótica e, portanto, um nocaute homozigoto. O clone de fundo apresenta duas mutações pontuais heterozigotas e é um knock-out heterozigoto ou um clone misto e foi editado erroneamente. (F) Imagens de campo brilhante dos clones organoides colhidos com vários níveis de crescimento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Por fim, para a realização do transplante ortotópico organoide da glândula lacrimal humana em camundongos, foram utilizados organoides com 3 dias de antecedência (< de 100 μm de diâmetro). O enxerto organoide foi confirmado 1 mês após a injeção dos organoides na glândula lacrimal de camundongos pela coloração para um marcador humano-específico, o antígeno nucleolar humano (Figura 5). A ausência de coloração puntiforme em todos os cortes da glândula lacrimal de camundongos significou a ausência de enxerto organoide humano.

Figure 5
Figura 5: Transplante de organoides da glândula lacrimal humana para a glândula lacrimal de camundongo. Coloração de glândulas lacrimais de camundongos transplantados para o marcador nucleolar humano para monitorar o enxerto 1 mês após o transplante. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela suplementar 1: Composição dos meios e buffers. Clique aqui para baixar esta tabela.

Discussion

Este protocolo descreve o estabelecimento e o uso de organoides da glândula lacrimal para ensaios funcionais, modelagem de mutações e transplante. Ao estabelecer organoides da glândula lacrimal humana e de camundongos, a dissociação tecidual é crucial. Se o tecido não for suficientemente digerido, o rendimento organoide será baixo. Se o tecido for superdigerido, as células morrerão e não crescerão como organoides. Cada tecido deve ser digerido com uma enzima específica por um tempo específico para garantir o crescimento ideal dos organoides14,17,18. A glândula lacrimal é um tecido bastante mole para o qual uma digestão de colagenase de 5-10 min combinada com dissociação mecânica baseada em pipetagem é suficiente para isolar pequenos pedaços de tecido. Se células únicas precisarem ser obtidas para aplicações como o sequenciamento de RNA de célula única, a dissociação pode ser realizada por mais tempo até que o estágio de célula única seja atingido, mas a dissociação deve ser interrompida assim que células únicas forem obtidas para limitar qualquer diminuição na viabilidade. Como a dissociação tecidual é tão crucial, a digestão excessiva é a razão mais provável para a falha no estabelecimento organoide da glândula lacrimal.

A manutenção adequada dos organoides da glândula lacrimal é importante para o seu uso. A manutenção em longo prazo é uma característica dos organoides das glândulas lacrimais derivadas de células-tronco adultas, em comparação com organoides derivados de células-tronco pluripotentes induzidas 7,17. Para alcançar a manutenção a longo prazo, a divisão regular dos organoides e as mudanças médias devem ser realizadas. Sem isso, os organoides começam a se diferenciar e desenvolver diminuição do potencial das células-tronco, o que dificulta sua manutenção a longo prazo7. Nesta etapa novamente, a digestão excessiva pode matar as células-tronco e prejudicar a manutenção dos organoides. Para manutenção regular, a dissociação do organoide em células únicas não é necessária. No entanto, para gerar linhagens organoides nocaute clonal, é fundamental começar com células únicas. Caso contrário, os organoides serão constituídos por um mosaico de células com diferentes origens genéticas, impossibilitando a análise do efeito de uma única mutação definida. Aqui, descrevemos o uso de um editor de base C > T para gerar códons de parada. Este editor do genoma baseia-se na presença de arginina, glutamina, ou códons de triptofano dentro de 12-18 bases de um PAM NGG. Quando essas condições não são atendidas no projeto de um gRNA, editores convencionais de base Cas9 ou C>T com PAMs alternativos podem ser usados 7,18. No entanto, o Cas9 convencional introduz quebras de fita dupla que resultam em indels após o reparo11. Como ambos os alelos podem abrigar indéis diferentes, a genotipagem de clones requer cuidados adicionais. A deconvolução das modificações introduzidas deve ser realizada para garantir que ambos os alelos contenham indéis fora de quadro e, assim, que os clones organoides sejam nocauteados para o gene alvo19. A vantagem dos editores de base C > T reside no fato de que eles podem ser usados para modelar mutações pontuais que não resultam necessariamente em códons de parada. Por exemplo, eles podem ser usados para modelar mutações específicas da Pax6 encontradas em pacientes com aniridia para estudar seu impacto na fisiologia da glândula lacrimal20.

A glândula lacrimal secreta a parte aquosa do filme lacrimal1. A secreção lacrimal pode ser recapitulada em organoides humanos após diferenciação mediada pela retirada do fator de crescimento e inibição da NOTCH. Nessas condições, os organoides sofrem diferenciação terminal e não podem ser mantidos. No entanto, organoides diferenciados da glândula lacrimal podem guiar o desenvolvimento de drogas indutoras de lacrimejamento no contexto da doença do olho seco, potencialmente em telas de alto rendimento. O ensaio de lacrimejamento apresentado neste protocolo é o que atualmente proporciona a maior alteração no tamanho dos organoides em um curto espaço de tempo, o que facilita a quantificação no contexto de uma triagem de drogas 7,9,17.

A terapia com células-tronco é uma grande promessa para a regeneração da glândula lacrimal na doença do olho seco21. Organoides da glândula lacrimal derivados de células-tronco adultas podem ser um material fonte para tais aplicações. O protocolo aqui apresentado resulta na enxertia organoide da glândula lacrimal humana, principalmente na forma de cistos. Baixo enxerto organoide pode surgir devido a organoides sendo injetados no local errado. Treinar o procedimento de injeção com um corante permite o rastreamento do local de injeção e, em última análise, melhora a precisão da injeção. Alternativamente, a epiderme de camundongos pode ser incisada para ter acesso direto à glândula lacrimal, como feito em ratos antes de22. Este método leva mais tempo, mas pode ser mais preciso. Por outro lado, com o presente protocolo, os organoides não se integraram funcionalmente à glândula lacrimal de camundongos. Resultados semelhantes foram observados para o enxerto de glândula lacrimal derivado da iPSC22. O método de transplante poderia ser melhorado ferindo a glândula lacrimal com antecedência, usando um modelo de camundongo de olho seco e/ou injetando os organoides como células únicas ou pequenos aglomerados. No entanto, organoides da glândula lacrimal derivados de células-tronco adultas e o kit de ferramentas relacionado podem ser a base de futuras aplicações na pesquisa da glândula lacrimal e na medicina regenerativa.

Disclosures

Hans Clevers é o chefe de Pesquisa Farmacêutica e Desenvolvimento Inicial na Roche, Basileia, e detém várias patentes relacionadas à tecnologia de organoides.

Acknowledgments

Agradecemos a Yorick Post pelo desenvolvimento inicial do protocolo. Este trabalho foi em parte apoiado por um prêmio da Cancer Research UK Grand Challenge (C6307/A29058) e da Mark Foundation for Cancer Research para a equipe SPECIFICANCER.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL safe-lock centrifuge tubes Eppendorf EP0030 120.094
3,3′-Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate (DAB) Sigma-Aldrich D5637 CAS: 868272-85-9 , CAUTION, 6 g/L solution can be stored aliquotted at -20 °C
5x green GoTaq Flexi buffer Promega M891A Store at -20 °C
A83-01 Tocris 2939 Store at -20 °C, stock at 30 mM, 10000x
Advanced DMEM/F12 Invitrogen 12634-010 store at 4 °C
Agar plates containing Ampicillin Hubrecht Institute
Ampicillin sodium salt Sigma-Aldrich A9518
Autoclave VAPOUR-Line lite VWR chemicals
B27 supplement Invitrogen 17504-044 Store at -20 °C, 50x
BD Micro-Fine insulin needle 1 mL BD Bioscience 324825
Benchtop microscope DMI1 Leica
Bovine serum albumine (BSA) MP biomedicals 160069 Store at 4 °C
BTXpress BTX MDS450805
C57BL/6 mice Hubrecht Institute
Cassettes Klinipath 410-02S
CellBanker 1 amsbio 11910 Cryopreservation medium, adhere to instructions
Centrifuge Eppendorf
Citric acid monohydrate J.T. Baker 0088 CAS: 5949-29-1
Collagenase I Sigma Aldrich C9407 Aliquots at 20 mg/mL, 20x, store at -20 °C
Conical tubes 15 mL Greiner Bio-One 5618-8271
Conical tubes 50 mL Corning CLS430828-500EA
Coverslips 24 mm x 50 mm Menzel-Gläzer BB024050S1
Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Growth Factor Reduced, Type 2 - extracellular matrix R&D Systems, Bio-Techne 3533-001-02 Store at -20 °C, keep at 4 °C for up to 1 month
DAPT Sigma Aldrich D5942 Store at -20 °C, stock at 10 mM, 1000x
Disodium hydrogen phosphate anhydrous VWR chemicals 28026.292 CAS: 7558-79-4
Di-sodiumhydrogenphosphate dihydrate Sigma-Aldrich 71643 CAS:10028-24-7
Dispase ThermoFisher Scientific 17105-041 Aliquots at 50 U/mL, store at -20 °C until use, 400x
Disposable Scalpel Sterile N° 10 Swann Morton 3033838
DM4000 microscope Leica
dNTPs 25 mM Promega U1420 Mix all 4 nucleotides together, Store at -20 °C
Dpn1 New England Biolabs R0176
Dulbecco's Phosphate-bufferd Saline (DPBS) Gibco 14190144 1x
Easy strainers 70 µm Greiner 542170
Electroporation cuvette Nepagene EC002S
EnVision+/HRP mouse Agilent K400111-2
Ethanol 100% BOOM 84045206;5000 CAUTION, Use to prepare other Ethanol dilutions
Ethanol 70% BOOM 84010059.5000 CAUTION
Ethanol 96% BOOM 84050065.5000 CAUTION
EVOS FL Auto 2 Cell Imaging System ThermoFisher Scientific Live-imaging brightfield microscrope
FGF10 Peprotech 100-26 Store at -20 °C, stock at 100 mg/mL in base medium, 100x
Fiji NIH, Fiji developers
Formaldehyde solution 4% Sigma-Aldrich 1.00496 CAS: 50-00-0, CAUTION
Forskolin Tocris 1099 Store at -20 °C, stock at 10 mM, 10000x
Glutamax Gibco 35050-061 100x
GoTaq G2 Flexi DNA Polymerase Promega M7805 Store at -20 °C
Haematoxylin VWR chemicals 10047105 Store at room temperature
HEPES Gibco 15630-080 Store at 4 °C, 100x
Histocore H and C, Tissue embedding machine Leica
Hot plate Meidax
Human nucleolar antigen antibody Abcam ab-190710
Hydrochloric acid 5 N ThermoFisher Scientific 10605882 CAS: 7647-01-0, CAUTION
Hydrogen peroxyde 30% Chem-lab CL00.2308.1000 CAS: 7722-84-1, CAUTION
Hygromycin B-gold InvivoGen ant-hg Stock at 100 mg/µL, 1000x
Hygromycin resistance cassette-containing plasmid Andersson-Rolf et al, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156
IsoFlo 100% Mecan 5960501
LB medium Hubrecht Institute
MgCl2 25 mM Promega A351H Store at -20 °C
Microtome RM2235 Leica
Midiprep DNA isolation kit ThermoFisher Scientific K210005
Miniprep DNA isolation kit ThermoFisher scientific K210003
N-acetylcysteine Sigma Aldrich A9165 Store at -20 °C, stock at 500 mM, 400x
NEPA21 electroporator Nepagene
Nicotinamide Sigma Aldrich N0636 Store at -20 °C, stock at 1M, 100x
NOD Scid Gamma (NSG) mice Hubrecht Institute colony
Noggin conditioned medium U-Protein Express Custom order Store at -20 °C
Noradrenaline Sigma Aldrich A7257 Store at -20 °C, stock at 100 mM
Oven Memmert Set at 58 °C
P20, P200 and P1000 pipettes Gilson
Paraffin VWR chemicals 10048502
Pasteur pipettes, glass plugged ThermoFisher Scientific 1150-6973
Pax6_C>T_F: AGACTGTTCCAGGATGGCTG  IDT
Pax6_C>T_R: TCTCCTAGGTACTGGAAGCC  IDT
pCMV_ABEmax_P2A_GFP Addgene 112101
Penicillin/Streptomycin Invitrogen 15140-122 Store at -20 °C
Pertex Klinipath AM-08010
pFYF1320  Addgene 47511
Primocin InvivoGen ant-pm-1 1000X, store at -20 °C
Prostaglandin E2 (PGE2) Tocris 2296 Store at -20 °C, stock at 10 mM, 10000x
Petri dish, 10 cm Greiner 633102
Q5 buffer New England Biolabs B9027S
Q5 high-fidelity DNA polymerase New England Biolabs M0491S
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen 28704
QuickExtract DNA Extraction Solution Lucigen QE09050 Store aliquots at -20 °C
R-spondin 3 conditioned medium U-Protein Express Custom order Store at -20 °C
sgRNA Reverse Primer: TCTGCGCCCATCTGTTGCTT CGGTGTTTCGTCCTTTCCACAAG IDT
Slides StarFrost MBB-0302-55A Adhesive, ground
Sodium azide Merck 8.22335.1000 CAS: 26628-22-8, CAUTION
Sodium cytrate dihydrate J.T. Baker 0280 CAS: 6132-04-3
Standard Forward Primer: “/5phos/ GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG
TTAAAATAAGGC		 IDT
Subcloning efficiency competent cells DH5alpha Invitrogen 18265-017
Suspension cell culture plates (24-well) Greiner Bio-One 662102 24-well
Suspension cell culture plates (12-well) Greiner Bio-One 665102 12-well
T4 DNA ligase New England Biolabs M0202
TAE buffer ThermoFisher Scientific B49 Stock at 50x, dilute to 1x with ultrapure water
Transposase-containing plasmid Andersson-Rolf et al, Nature Methods, 2017. doi: 10.1038/nmeth.4156
TrypLE Express Enzyme Invitrogen 12605-028 store at 4 °C
U6_Forward primer: GGGCAGGAAGAGGGCCTAT IDT
UltraPure Agarose 1000 Invitrogen 16550
Water bath Tulabo
Xylene Klinipath 4055-9005 CAS: 1330-20-7, CAUTION
Y-27632 Abmole Bioscience Y-27632 dihydrochloride Store at -20 °C, stock at 10 mM, 1000x

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References

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Estabelecimento, Manutenção, Diferenciação, Manipulação Genética e Transplante de Organoides de Glândulas Lacrimais de Camundongos e Humanos
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Bannier-Hélaouët, M., Geurts, M. H., Korving, J., Begthel, H., Clevers, H. Establishment, Maintenance, Differentiation, Genetic Manipulation, and Transplantation of Mouse and Human Lacrimal Gland Organoids. J. Vis. Exp. (192), e65040, doi:10.3791/65040 (2023).

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