Se necesita un modelo animal apropiado para comprender los mecanismos patológicos subyacentes a la estenosis de la válvula aórtica (EAV) y para evaluar la eficacia de las intervenciones terapéuticas. El presente protocolo describe un nuevo procedimiento para desarrollar el modelo de conejo AVS a través de una lesión directa con balón in vivo.
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Artículo de método
Un modelo de estenosis valvular aórtica de conejo inducida por lesión directa con balón
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Resumen
Resumen
Los modelos animales están emergiendo como una herramienta importante para comprender los mecanismos patológicos subyacentes a la estenosis de la válvula aórtica (EAV) debido a la falta de acceso a fuentes confiables de válvulas aórticas humanas enfermas. Entre los diversos modelos animales, los modelos de conejo AVS son uno de los más utilizados en estudios con animales grandes. Sin embargo, los modelos tradicionales de conejo AVS requieren un período prolongado de suplementación dietética y manipulación genética para inducir una estenosis significativa en la válvula aórtica, lo que limita su uso en estudios experimentales. Para abordar estas limitaciones, se propone un nuevo modelo de conejo AVS, en el que la estenosis es inducida por una lesión directa con balón en la válvula aórtica. El presente protocolo describe una técnica exitosa para la inducción de AVS en conejos blancos de Nueva Zelanda (NZW), con procedimientos paso a paso para la preparación, el procedimiento quirúrgico y el cuidado postoperatorio. Este modelo simple y reproducible ofrece un enfoque prometedor para estudiar el inicio y la progresión de la AVS y proporciona una herramienta valiosa para investigar los mecanismos patológicos subyacentes de la enfermedad.
Introducción
Cada vez se reconoce más que el uso de modelos animales apropiados puede contribuir a una mejor comprensión de los mecanismos patológicos subyacentes a la estenosis de la válvula aórtica (EAV) debido a la falta de acceso a fuentes fiables de válvulas aórticas humanas enfermas asociadas con la progresión de la estenosis aórtica (EA). Entre los diversos modelos animales para el estudio de la AVS, los conejos son uno de los modelos AVS de animales grandes más utilizados, y el modelo de conejo AVS se induce a través de la suplementación con colesterol/vitamina D2 o la manipulación genética 1,2,3,4.
Aunque los modelos de AVS de conejo han proporcionado información significativa sobre el desarrollo y la progresión de AVS, sigue siendo un desafío inducir AVS de manera consistente y reproducible, como se vio en nuestros experimentos preliminares.
Además de los modelos animales inducidos por la dieta y genéticamente susceptibles, se ha establecido un nuevo modelo de AVS a través de la lesión mecánica directa en ratones 5,6. El modelo de lesión mecánica induce con éxito la estenosis aórtica y representa un modelo AVS simple y reproducible en ratones de tipo salvaje. Hasta donde sabemos, no ha habido estudios previos que examinen los efectos de una lesión mecánica en la válvula aórtica en modelos de conejos. Por lo tanto, este estudio proporciona un nuevo procedimiento para inducir AVS en conejos blancos machos de Nueva Zelanda a través de una lesión directa con balón en la válvula aórtica, que puede imitar con precisión la condición de estenosis aórtica valvular. Este protocolo incluye descripciones paso a paso de la preparación, el procedimiento quirúrgico y los cuidados postoperatorios, que son útiles para inducir modelos reproducibles de conejos AVS.
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Protocolo
Todos los procedimientos de investigación con animales fueron aprobados y realizados de acuerdo con la Ley de Bienestar de los Animales de Laboratorio, la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y las Directrices y Políticas para Experimentos con Animales proporcionadas por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Facultad de Medicina de la Universidad Católica de Corea (número de aprobación: CUMC-2021-0176-05). En el presente estudio se utilizaron conejos blancos machos de Nueva Zelanda (NZW) de 3 meses de edad con un peso de 3,5-4,0 kg, que se mantuvieron en condiciones estándar en jaulas individuales. Los conejos fueron alimentados con una dieta normal o una dieta enriquecida con colesterol al 0,5% suplementada con 50.000 U de vitamina D2 (ver Tabla de Materiales). El diseño experimental y los métodos de análisis para la inducción del modelo de conejo AVS se muestran en la Figura 1.
1. Preparación para la operación
- Asegúrese de que todos los instrumentos médicos y quirúrgicos (ver Tabla de Materiales) estén esterilizados al comienzo de la operación.
- Prepare el juego de catéteres con balón de dilatación siguiendo los pasos que se indican a continuación.
- Conecte el dispositivo de desinflado lleno de una mezcla de solución salina y medio de contraste disponible en el mercado (1:1) a la parte Luer Lock del catéter con balón (consulte la Tabla de materiales).
- Llene el balón con solución de inflado y retire el aire del catéter del balón.
NOTA: Para el presente estudio, la solución de inflado consistió en yodixanol al 30% con solución salina al 0,9% (ver Tabla de Materiales). - Verifique el inflado adecuado del globo purgando el lumen del globo con la solución de inflado.
2. Procedimiento quirúrgico para la lesión de la válvula aórtica
- Administrar una inyección intramuscular de tiletamina y zolazepam (15 mg/kg) y xilacina (5 mg/kg) (ver Tabla de Materiales) para anestesiar al animal.
NOTA: Antes de administrar la anestesia, los conejos fueron pretratados con una inyección subcutánea de glicopirrolato (0,05 mg/kg) como agente anticolinérgico preanestésico. El nivel adecuado de anestesia se determinó mediante una combinación de criterios, incluida la falta de respuesta a un pellizco en el dedo del pie y una frecuencia respiratoria constante. - Insertar un catéter intravenoso (IV) de 24 G en la vena auricular marginal y conectar un equipo de infusión con solución salina heparinizada (100 U/kg de heparina).
- Conecte al conejo con un monitor veterinario multiparamétrico (ver Tabla de Materiales) para monitorear continuamente los signos vitales, como la señal de saturación de oxígeno (SpO2), la temperatura y la presión arterial.
NOTA: Para el monitoreo de SpO 2, conecte el sensor de SpO2 a la lengua del conejo. Para el control de la temperatura, inserte la sonda en el recto del conejo. Para el control de la presión arterial, coloque el manguito en la extremidad anterior. - Coloque al conejo en posición supina sobre una mesa de operaciones equipada con una fluoroscopia de arco en C (consulte la Tabla de materiales) y retire el pelo del área ventral del cuello con un cortapelos de animales (Figura 2A).
- Esterilice el área de la incisión con yodo y cubra al conejo con toallas quirúrgicas.
- Coloca el corazón del conejo en el centro de la imagen del arco en C.
NOTA: Todos los investigadores deben usar equipo de protección con dosímetros termoluminiscentes (TLD) adjuntos para reducir la exposición a la radiación mientras realizan la cirugía guiada por arco en C.- Encienda el arco en C y seleccione el modo fluoroscópico para las imágenes cardíacas.
- Ajuste la posición del conejo para asegurarse de que el corazón esté en el centro del campo de imágenes.
- Realice una incisión longitudinal de aproximadamente 3 cm en la piel del cuello, y utilice unas tijeras quirúrgicas para cortar la fascia y el tejido graso.
- Exponga la arteria carótida común izquierda (LCCA) separando cuidadosamente los músculos hasta que quede expuesta aproximadamente 3-3,5 cm de la LCCA (Figura 2B).
- Ligue el LCCA con una sutura de seda 3-0 (consulte la Tabla de materiales) en la parte superior y al final del LCCA expuesto para detener el flujo sanguíneo.
- Inserte un catéter intravenoso de 22 G en el LCCA e introduzca una guía (0,016 pulgadas, consulte la Tabla de materiales) en el ventrículo izquierdo (VI) a través del catéter intravenoso, asegurándose de que la punta del catéter esté correctamente colocada en el campo de imágenes del arco en C.
NOTA: Al insertar el catéter intravenoso, afloje con cuidado la sutura de la ligadura en el camino hacia la válvula aórtica para permitir el avance del catéter. - Retire el catéter intravenoso, dejando el alambre guía, y coloque una vaina 4-F (ver Tabla de materiales) sobre el alambre guía en el LCCA para introducir el catéter con balón (Figura 2C).
NOTA: Después de reemplazar el catéter intravenoso con la vaina, se debe eliminar el aire atrapado del dispositivo de la vaina. - Inserte con cuidado el catéter con balón de 8 mm sobre la guía en la válvula aórtica bajo guía fluoroscópica del arco en C (Figura 2D).
- Coloque la punta del catéter con balón aproximadamente 1-2 cm distal a la válvula aórtica e infle el balón purgando la solución de inflado con un inflador de presión a 6 atm.
- Avance el globo hacia el vértice del VI y tire de él hacia la salida del VI. Repita este procedimiento cinco veces y luego desinfle el globo (Figura 2E, F).
- Repita los pasos 2.8-2.9 tres veces para asegurarse de que la lesión de la válvula sea adecuada.
- Retire el catéter con balón y la guía. Retire lentamente la vaina del LCCA e inmediatamente ate el LCCA con la sutura en el camino hacia la válvula aórtica.
- Limpie el área de la incisión con solución salina para eliminar los coágulos de sangre e inspeccione el sitio de la punción en busca de sangrado arterial.
- Cierre el músculo y la piel con una sutura no absorbible 3-0 y esterilice todos los lados de la herida con yodo.
3. Cuidados postoperatorios
- Retire los parches y clips de monitoreo y mantenga al conejo en una incubadora de cuidados intensivos.
NOTA: Después de la cirugía, los conejos fueron observados de cerca durante 1 día en una incubadora de cuidados intensivos y luego trasladados a una jaula doméstica. - Controlar el dolor postoperatorio con 5 mg/kg de tramadol y 3 mg/kg de ketoprofeno y administrar antibióticos (4 mg/kg de gentamicina) dos veces al día durante 3 días mediante inyección subcutánea (ver Tabla de materiales).
NOTA: El manejo del dolor postoperatorio debe cumplir con las pautas veterinarias y de la IACUC (p. ej., opioides, AINE, anestésico local o combinación). - Alimente una dieta enriquecida con colesterol al 0,5% con 50.000 U de vitamina D2 (HC + VitD2) durante 8 semanas.
4. Ecocardiografía
- Después de 8 semanas de lesión con balón, anestesiar al conejo usando el mismo procedimiento descrito en el paso 2.1.
- Visualice las válvulas aórticas mediante vistas transtorácicas bidimensionales y grabe imágenes en modo M en vistas de eje corto y eje largo.
- Coloca al conejo en posición supina sobre una mesa de eco.
- Afeita el área del pecho con una maquinilla y crema depilatoria.
- Aplique gel transductor de ultrasonido (ver Tabla de materiales) en el tórax.
- Ajuste el transductor para obtener la vista del eje largo paraesterl y la vista del eje corto paraesternal de la válvula aórtica.
- Utilice las imágenes en modo M para registrar imágenes de la válvula aórtica tanto en las vistas del eje largo como en el eje corto, y guarde las imágenes para su posterior análisis.
5. Análisis histológico
- Después de la ecocardiografía, eutanasiar al conejo administrando una inyección intravenosa de cloruro de potasio (KCl, 3 g/20 mL, 1 mL).
- Abra la cavidad torácica, extraiga el corazón con la aortaascendente 7 y colóquelo en hielo en solución salina tamponada con fosfato (PBS).
- Sumerja inmediatamente el corazón en una solución de paraformaldehído (PFA) al 4% e insértelo en un bloque de parafina (consulte la Tabla de materiales).
- Cortar el bloque cardíaco incluido en parafina en secciones de 4 μm de espesor con un micrótomo y teñir las secciones con tricrómico de Masson (MT), rojo de alizarina y von Kossa (ver Tabla de materiales) para evaluar la deposición de colágeno y la calcificación de la válvula, respectivamente 8,9.
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Resultados
Modelo AVS de conejo inducido por lesión valvular aórtica
Para inducir el modelo AVS de conejo, se utilizaron conejos machos NZW con un peso de 3,5-4,0 kg para este estudio. De acuerdo con los procedimientos quirúrgicos descritos en el paso 2 (Figura 2), el modelo AVS se estableció por lesión valvular aórtica, lo que resultó en degeneración mecánica de la válvula aórtica y calcificación. El grupo de control incluyó conejos alimentados con una dieta enriquecida con 0,5% de...
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Discusión
Los modelos animales de AVS se utilizan comúnmente para estudiar los aspectos patológicos de AVS, incluido el inicio y la progresión de AVS. Este protocolo introduce un nuevo modelo de AVS de conejo inducido por una lesión directa con balón en la válvula aórtica. En este estudio, el modelo de lesión valvular aórtica mostró un engrosamiento y calcificación significativo de las valvas. En comparación con el modelo AVS leve inducido por la suplementación dietética, la válvula aórtica en el modelo de lesión directa con balón...
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar con este trabajo.
Agradecimientos
Este trabajo contó con el apoyo de una subvención de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF) financiada por el gobierno coreano (MSIT) (n.º 2020R1A4A3079570), el Ministerio de Educación (n.º 2021R1I1A1A01051425) y el Programa de Desarrollo Tecnológico Estratégico Industrial (n.º 20014873) financiado por el Ministerio de Comercio, Industria y Energía de la República de Corea.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 3-0 Sutura de seda | AILEE | SK312 | |
| 4% paraformaldehído (PFA) | Intron | IBS-BP031-2 | |
| Solución de rojo de alizarina | Millpore | TMS-008-C | |
| ASAHI SION BLUE | Alambre guía | ASAHI | |
| Cubierta de la mesa trasera | Yuhan kimberly | 80101-30 | |
| Dispositivo de inflado de globo | Demax Medical | DID30s | |
| Bionet Monitor veterinario | BIONET | BM3 VET | |
| C-Arm | SIEMENS Healthcare GmbH | Cios alpha | |
| Certified Rabbit Diet Purina | 5322 | 4.7% Aceite de Coco Hidrogenado, 0.5% Colesterol, & 1% Molasse | |
| Curadle Smart Incubator | Autoelex | CS-CV206 Unidad de | Cuidados Intensivos (UCI) |
| Ergocalciferol | Sigma-aldrich | E5750 | Vitamina D2 |
| Pinzas de conjuntiva de Fechtner titanio | WORLD PRECISSION Instrument | WP1820 | |
| Pinzas | HEBU | HB203 | |
| Gentamicina | Shin Poong | ||
| Glicopirrolato | SamChunDang | ||
| Greenflex NS | DAI HAN PHARM | Solución salina normal 500 mL | |
| Hematoxilina | Sigma-aldrich | HT1079-1 SET | |
| Heparina | JW farmacéutica | 25.000 U | |
| perfusión de un solo uso | SWOON MEDICAL | ||
| Yodo | Green farmacéutico | ||
| Iodixanol | GE Healthcare | Visipaque | Solución de inflado (agente de contraste) |
| Catéter intravenoso 22 G | BD | ||
| catéter intravenoso 24 G | BD | 382412 | |
| Ketoprofeno | SamChunDang | ||
| Jeringa Luer-Lok 10 mL | Becton Dickinson Medical | ||
| Jeringa Luer-Lok 3 mL | Becton Dickinson | ||
| OLYMPUS | SZ61 | ||
| Microtomo | ThermoFisher Scientific | HM 325 | |
| MT kit de tinción | Sigma-aldrich | HT15-1kt | |
| Soporte para agujas | Solco | 009-1304 | |
| Portaagujas con bloqueo y sutura | JEUNGDO BIO & PLANTA | H-1222-18 | |
| Parafina | LK LABKOREA | H06-660-107 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| Cloruro de potasio 40 | Daihan Pharm | KCl | |
| Prelude Vaina hidrofílica ideal | MERIT MEDICAL | PID4F11018SS | Vaina 4F |
| PTA Catéter de dilatación con balón | Boston Scientific H749-3903280208-0 | Catéter balón 8,0 mm | |
| Rompun | Elanco | Xilaxina | |
| gasa estéril | DAE HAN Medical | 10 cm x 20 cm | |
| Guantes quirúrgicos | Ansell | Albornoz quirúrgico Ansell | |
| Yuhan Kimberly | 90002-02 | ||
| Tijeras quirúrgicas | Nopa, Alemania | AC020/16 | |
| Cinta quirúrgica | 3M micopore | 1530-1 | |
| Jeringa 1 mL | Shin Chang Medical | ||
| Jeringa 10 mL | Shin Chang Medical | ||
| Casete de tejido | Scilav korea | Cas3003 | |
| Transductor gel | SUNGHEUNG | SH102 | |
| Tridol | Yuhan Corp. | Tramadol HCl | |
| Sistema de ultrasonido | Philps | Affiniti 50 | |
| Von Kossa kit de tinción | Abcam | ab105689 | |
| Zoletil 50 | Virbac korea | Tiletamine & zolazepam |
Referencias
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