Alteración de la barrera hemato-médula espinal mediante ultrasonido focalizado de baja intensidad en un modelo de rata

Resumen

La disrupción de la barrera hemato-médula espinal (BSCB) puede lograrse con éxito con la administración intravenosa de microburbujas y la aplicación de ultrasonidos focalizados de baja intensidad (LIFU). Este protocolo detalla la apertura del BSCB utilizando LIFU en un modelo de roedores, incluida la configuración del equipo, la inyección de microburbujas, la localización del objetivo y la visualización de la interrupción del BSCB.

Resumen

El ultrasonido focalizado de baja intensidad (LIFU) utiliza pulsaciones ultrasónicas a intensidades más bajas que el ultrasonido y se está probando como una tecnología neuromoduladora reversible y precisa. Aunque se ha explorado en detalle la apertura de la barrera hematoencefálica (BHE) mediada por LIFU, hasta la fecha no se ha establecido ninguna técnica estandarizada para la apertura de la barrera hematoencefálica (BSCB). Por lo tanto, este protocolo presenta un método para la disrupción exitosa de BSCB utilizando la sonicación LIFU en un modelo de rata, que incluye descripciones de la preparación animal, la administración de microburbujas, la selección y localización de dianas, así como la visualización y confirmación de la interrupción de BSCB. El enfoque que se presenta aquí es especialmente útil para los investigadores que necesitan un método rápido y rentable para probar y confirmar la localización de la diana y la interrupción precisa de la BSCB en un modelo animal pequeño con un transductor de ultrasonido focalizado, evaluar la eficacia de la BSCB de los parámetros de sonicación o explorar aplicaciones para la LIFU en la médula espinal, como la administración de fármacos. inmunomodulación y neuromodulación. Se recomienda optimizar este protocolo para uso individual, especialmente para avanzar en futuros trabajos preclínicos, clínicos y traslacionales.

Introducción

Al igual que la barrera hematoencefálica (BHE), la barrera hematoencefálica (BSCB) regula el movimiento de solutos, células y componentes plasmáticos circulantes hacia el parénquima espinal. Esta característica protectora es el resultado de un sistema especializado de células endoteliales no fenestradas fuertemente unidas que recubren los capilares espinales². Típicamente, solo las moléculas lipofílicas de bajo peso con carga positiva pueden cruzar ambas barreras³. A pesar de los estudios que sugieren que el BSCB tiene una permeabilidad ligeramente superior a la BBB, ambas barreras limitan la administración de terapias al sistema nervioso central⁴. Se han desarrollado varias estrategias para aumentar el transporte de fármacos a través del BSCB, incluyendo técnicas para aumentar la presión osmótica en los capilares espinales, el desarrollo de fármacos que interactúan con los receptores de bradicinina y la creación de nanopartículas funcionalizadas⁵.

La disrupción del BSCB también puede lograrse mediante la administración intravenosa de microburbujas (MB) seguida de sonicación por ultrasonidos focalizados de baja intensidad (LIFU)⁶. El campo acústico generado por el transductor de ultrasonido provoca oscilaciones MB, que a su vez ejercen tensión contra la pared endotelial y aflojan las uniones estrechas⁷. El aflojamiento de la unión estrecha crea espacios transitorios en los capilares, lo que permite que la terapéutica penetre en el parénquima espinal (Figura 1). Este proceso también puede crear fenestraciones transendoteliales, aumentar la transcitosis y regular a la baja los transportadores de casetes de unión a ATP, como la glicoproteína^{P 8,9}. Una ventaja clave de esta técnica es la capacidad de minimizar los efectos fuera del objetivo dirigiendo la región focal de la sonicación a la ubicación de interés en la médula espinal. Varios ensayos clínicos han investigado la eficacia de la apertura de la BHE mediada por LIFU para el tratamiento de patologías del sistema nervioso central, incluidos los gliomas, la esclerosis lateral amiotrófica, la enfermedad de Alzheimer y la enfermedad de Parkinson. A pesar de que la disrupción de la BSCB mediada por LIFU no está tan ampliamente caracterizada como la disrupción de la BHE mediada por LIFU, varios grupos han reportado una disrupción exitosa de la BSCB en modelos de roedores, conejos y porcinos^10,11,12. En general, el interés en la técnica está creciendo rápidamente, especialmente como una vía viable para la administración de fármacos.

En este protocolo, se describe una técnica para la disrupción de BSCB mediada por LIFU en un modelo de rata. El procedimiento incluye descripciones detalladas de la preparación de los animales, la configuración del equipo LIFU, la administración de MB, la localización de dianas y la extracción de la médula espinal. La confirmación de la localización de la diana y la interrupción de la BSCB se evalúa mediante la extravasación del colorante azul de Evans (EBD) en la médula espinal. La EBD es un compuesto no tóxico que se une a la albúmina sérica y puede identificarse visualmente por su rico color azul y su autofluorescencia roja al microscopio¹³.

Los pasos enumerados aquí ofrecen una alternativa rápida y económica a los sistemas tradicionales de LIFU guiados por ultrasonido (US) o resonancia magnética (RM). Como resultado, este método es útil para los investigadores interesados en probar y confirmar rápidamente las capacidades de focalización e interrupción de BSCB de su transductor LIFU antes de adquirir equipos y materiales adicionales o buscar aplicaciones LIFU en la médula espinal, como la administración de fármacos, la inmunomodulación y la neuromodulación.

Protocolo

Todos los estudios en animales fueron aprobados y realizados de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Johns Hopkins (IACUC RA20M223). Para el presente estudio solo se utilizaron ratas hembras Sprague-Dawley adultas (peso promedio: 250 g; edad: 11 semanas).

1. Montaje y configuración de ultrasonido focalizado de baja intensidad

1. Adquirir un sistema de transductor de ultrasonido focalizado con especificaciones suficientes para lograr la apertura de BSCB en ratas. Los parámetros sugeridos en la literatura incluyen una frecuencia central entre 0,25-4 MHz y la capacidad de producir presiones máximas entre 0,2-2,1 MPa 10,14,15,16,17. Asegúrese de que el sistema incluya el equipo de conducción/control, que como mínimo incluye un generador de ondas/señales, un amplificador de potencia/accionamiento de radiofrecuencia (RF) y una red correspondiente (Figura 2A).
   NOTA: La configuración descrita aquí utiliza un transductor multielemento disponible en el mercado con una frecuencia central de 250 kHz y un diámetro de 64 mm (Figura 2B).
2. Coloque el soporte de la sonda impreso en 3D y el cono de agua en el transductor (Figura 2C). Asegúrese de que haya un sello hermético entre el cono y el transductor.
   NOTA: Con el transductor utilizado en este experimento se incluye un cono personalizado y un soporte para sonda. El cono y el soporte de la sonda se fijan al transductor con tornillos, que también se suministran.
3. Esterilice una membrana de poliéster acústicamente transparente de 50 μm de espesor y fíjela al fondo del cono de agua con una banda elástica.
4. Llene el cono de agua con agua desgasificada y desionizada utilizando los tubos de entrada y salida. Tenga cuidado de evitar las burbujas de aire dentro del cono, ya que pueden interrumpir el acoplamiento acústico entre el transductor y el objetivo. La membrana de poliéster debe estar ligeramente inflada.
   NOTA: Para eliminar las burbujas de aire del cono, guíe las burbujas hacia la válvula de salida mientras llena el cono con agua a través de la válvula de entrada. Si hay muchas burbujas pequeñas, cierre todas las válvulas y gire el cono hasta que quede una burbuja grande. Guíe esta burbuja hasta la válvula de salida y reanude el llenado del cono.
5. Conecte el equipo de accionamiento, que incluye el generador de ondas y el amplificador de accionamiento de RF, al transductor. El cable del transductor se conectará al lado de salida de la red coincidente y el generador de señal/amplificador de potencia se conectará al lado de entrada de la red coincidente. Los cables deben conectarse a su número de canal correspondiente (Figura 2D-G).
   NOTA: En el sistema comercial utilizado en este estudio, el generador de ondas y el amplificador de accionamiento de RF son componentes de la potencia de salida del transductor (TPO) (Figura 2D).
6. Coloque el soporte de la sonda en el brazo estereotáctico. Fije el brazo estereotáxico al conjunto de la placa de fijación. Esto permitirá que el transductor se posicione con precisión sobre el roedor durante la sonicación.

2. Preparación animal y laminectomía quirúrgica

1. Anestesiar a la rata con una mezcla de isoflurano y aire medicinal en una cámara de inducción conectada a un recipiente de filtro de carbón. Ajuste el caudal de gas a 400 ml/min y el vaporizador de isoflurano entre 1,5% y 2,5% para la inducción de la anestesia. La cantidad de tiempo que se pasa en la cámara antes de la sedación completa es variable, aunque generalmente oscila entre 3 y 6 minutos.
2. Registre el peso de la rata sedada y realice una prueba de pellizco en los dedos de los pies. Si se observan sacudidas o movimientos en respuesta al pellizco, vuelva a colocar a la rata dentro de la cámara de inducción durante 1 minuto adicional y repita la prueba de pellizco del dedo del pie. Repita las veces que sea necesario para asegurarse de que la rata esté y permanezca completamente anestesiada.
3. Coloque una almohadilla térmica y una almohadilla absorbente estéril en la placa de fijación. Coloque a la rata sobre la almohadilla absorbente, aplique ungüento para los ojos y coloque un termómetro rectal para controlar la temperatura corporal.
   NOTA: Durante la duración del procedimiento quirúrgico, se debe controlar la temperatura y la frecuencia cardíaca de la rata (idealmente, la frecuencia cardíaca debe estar entre 330-480 lpm y la temperatura entre 35,9-37,5 °C)^18,19. Ajuste el isoflurano o la almohadilla térmica según corresponda para evitar la muerte prematura. La almohadilla térmica se puede ajustar a una temperatura de alrededor de 37 ° C y debe encenderse y apagarse según sea necesario para mantener la temperatura corporal óptima.
4. Palpar la última costilla de la rata, que está unida a la columna vertebral en la^13ª vértebra torácica (T13). Usa una maquinilla de afeitar eléctrica para afeitar el pelaje de la superficie dorsal entre la última costilla y el cuello. Limpie la piel expuesta con una gasa humedecida en yodopovidona al 10%.
5. Cree una incisión en la línea media con unas tijeras de iris y diseccione a través de la fascia hasta que las apófisis espinosas y la lámina queden expuestas. Retire el hueso con unas pinzas para huesos desplazadas y unas tijeras de iris de hoja en ángulo hasta que la médula espinal quede expuesta²⁰. La duración de la laminectomía y la incisión varía en función del número de dianas diferentes que se vayan a sonicar. En este estudio, se realizó una laminectomía de tres niveles con una incisión de 3 cm.
   NOTA: Evite tocar o ejercer presión sobre la médula espinal mientras extrae el hueso para evitar lesiones. Si las extremidades traseras de la rata se sacuden durante la laminectomía, entonces se usó demasiada fuerza sobre el cordón o las raíces nerviosas.
6. Asegure la rata a la placa de fijación sujetando las apófisis espinosas adyacentes a la laminectomía. Tire ligeramente de la columna vertebral para minimizar la curvatura antes de bloquear las abrazaderas.

3. Localización de objetivos mediante guiado láser

1. Ajuste la posición del transductor con el brazo estereotáxico hasta que quede exactamente por encima de la laminectomía (Figura 3A). El marco permite el movimiento en los ejes x, y y z, así como una rotación de 180° en el plano vertical y una rotación de 360° en el plano horizontal.
2. Fije el aparato láser al fondo del cono de agua y bájelo hasta que el punto láser sea visible. Ajuste la posición lateral del transductor hasta que el punto láser esté por encima de la ubicación que es el objetivo de la interrupción del BSCB (Figura 3B, C).
   NOTA: En la sección complementaria se incluye un archivo de diseño asistido por computadora (CAD) para el aparato láser (Figura 1 suplementaria).
3. Retire el aparato láser y rellene el espacio entre el cono y la médula espinal con gel de ultrasonido desgasificado (Figura 3D). Para un acoplamiento máximo, asegúrese de que no haya burbujas de aire en el gel.
   NOTA: En este estudio, el transductor con un cono de agua adherido se bajó hasta ubicarse 1 cm por encima del cordón. Dado que el cono de agua tenía una longitud de 30 mm, la distancia total desde el transductor hasta el cable era de 40 mm. El cono de agua se colocó a 1 cm de distancia de la médula espinal porque la piel, la fascia y la musculatura de la rata a ambos lados de la incisión impiden el contacto directo entre la punta del cono y la médula. El uso de los números en el eje Y del brazo estereotáctico puede ser útil para realizar un seguimiento de la distancia vertical a la que el cono está a 1 cm de distancia del cordón, especialmente porque el gel dificultará la confirmación visual de la distancia del cono al cordón.
4. Ajuste los parámetros de sonicación en el TPO. Se puede utilizar un rango de valores para lograr una interrupción exitosa de BSCB. Para obtener la máxima potencia, ajuste la frecuencia de sonicación cerca de la frecuencia central del transductor. Los valores utilizados en este estudio se enumeran en la Tabla 1.
   NOTA: Los parámetros enumerados aquí se adaptaron de trabajos anteriores con LIFU, con una frecuencia central de 500 kHz, una duración de ráfaga de tono de 500 μs, un ciclo de trabajo del 50% y tiempos de sonicación de 5 o 10 min para neuromodular de forma segura la médula espinal de un roedor²¹. Sobre la base de estudios que lograron con éxito la disrupción de BSCB, otros parámetros que se pueden utilizar son frecuencias centrales entre 500 kHz-1 MHz, presiones de 0,2-2,1 MPa, longitudes de ráfaga de 10-25 ms y tiempos de sonicación de 2-5 min 6,10,11,22.

Parámetro	Valor
Frecuencia (kHz)	250
Distancia de enfoque (mm)	40
Presión máxima acústica (MPa)	0.47
Ciclo de trabajo	40%
Longitud de ráfaga (ms)	400
Período(s)	1
Tiempo de sonicación (min)	5

Tabla 1: Parámetros de sonicación utilizados para la disrupción de BSCB.

4. Administración de microburbujas

1. Prepare una solución MB de acuerdo con las instrucciones proporcionadas por el fabricante. Evite introducir aire en la solución.
   NOTA: Los MB son frágiles y se agrupan cerca de la parte superior del vial/jeringa si se dejan quietos durante unos minutos. Agite el vial y la jeringa con regularidad para evitar una dispersión desigual de los MB. Los MB tienen una vida útil corta; Consulte la guía del fabricante para determinar el tiempo de vencimiento.
2. Insertar un catéter de vena de cola de 22 G y enjuagar con 0,2 mL de suero fisiológico heparinizado (500 UI/mL)²³. Para aumentar las posibilidades de éxito del cateterismo de la vena caudal, sumerja la cola en agua tibia y coloque un torniquete en la base de la cola para agrandar el diámetro de la vena.
   NOTA: El cateterismo de la vena de la cola se puede realizar antes de la laminectomía, el posicionamiento y la focalización del animal para ahorrar tiempo en el estudio.
3. Inyectar 1 mL/kg de EBD al 3% en el catéter. Enjuague con 0,2 ml de solución salina heparinizada. Las extremidades y los ojos de la rata se volverán azules. Confirme el cateterismo exitoso de la vena de la cola comprobando si hay cambios de color azul en la vena espinal dorsal de la rata (Figura 4).
   NOTA: La EBD puede inyectarse mucho antes de la inyección de MB y no influirá en la sonicación. Además, dado que la Administración de Alimentos y Medicamentos (FDA) no ha aprobado actualmente la sonicación con medicamentos que ya están en el sistema, la EBD también puede administrarse después de la sonicación. Esto dará como resultado una menor absorción de colorantes, pero puede ser más relevante clínicamente.
4. Inyecte un bolo de 0,2 ml de MB en el catéter y enjuague con 0,2 ml de solución salina heparinizada. Inicie la sonicación 1-2 minutos después de la inyección de MB. La configuración utilizada aquí no recoge la retroalimentación de la sonicación en tiempo real.
   NOTA: Los estudios para la disrupción de BSCB suelen utilizar una concentración más alta de MB que la indicada para el diagnóstico por imágenes. Algunas concentraciones de marcas comunes de MB utilizadas para la disrupción de la BHE y la BSCB en modelos de ratas incluyen 0,02-0,2 ml/kg y bolos de 200 μl 10,15,24,25.

5. Extracción de la médula espinal y procesamiento de tejidos

1. Una vez finalizada la sonicación, perfundir transcardialmente a la rata con 100 ml de solución salina fría tamponada con fosfato (PBS) hasta que la sangre salga completamente clara. El hígado, que es de un color azul intenso debido al tinte, debe desvanecerse a un azul parduzco claro²⁶.
   NOTA: El propósito de la perfusión es eliminar el exceso de sangre de la vasculatura de la médula espinal. Dado que la EBD se une a la albúmina, esto también elimina el exceso de EBD. Esto asegura que cualquier EBD detectada, ya sea visualmente o a través de microscopía de fluorescencia en la médula espinal, provenga de la extravasación del tinte en el parénquima espinal.
2. Perfundir por vía transcárdica con 100 ml de paraformaldehído (PFA) frío al 4%. Las extremidades de la rata se contraerán durante esta fijación si se hace a fondo. Esta perfusión con PFA sacrifica a la rata.
3. Retire la médula espinal y colóquela en PFA al 4% a 4 °C durante la noche. Reemplace el PFA con PBS al día siguiente.

6. Visualización de la disrupción de BSCB

1. Aísle una sección de 2 cm que rodee el lugar de la sonicación con una cuchilla de afeitar. Divida la sección a lo largo de la línea media con la cuchilla y la sección en secciones de 10 μm de grosor con un micrótomo. Para una visualización de campo claro, tiña con tinción de hematoxilina-eosina (H&E).
   NOTA: Las muestras de médula espinal H&E mostradas en este estudio se tiñeron con hematoxilina durante 3 min y eosina durante 1 min²⁷.
2. Para microscopía de fluorescencia, desparafinar los portaobjetos que contienen las secciones de la médula espinal y contratinción con 25 μL de 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) disueltos en el medio de montaje (0,5 μg/mL). Incubar a 4 °C durante al menos 10 min. Evite la luz para evitar la decoloración.
   NOTA: La desparafinación puede ser reemplazada mediante el uso de un criostato para obtener secciones congeladas.
3. Usa un microscopio fluorescente para obtener imágenes de todos los portaobjetos. La autofluorescencia EBD (excitación: 470 nm y 540 nm; emisión: 680 nm) es visible en el canal rojo, mientras que DAPI está presente en el canal azul. Use un microscopio óptico para obtener imágenes de los portaobjetos de H&E.
   NOTA: Aunque este protocolo describía un procedimiento sin supervivencia, también se realizó mediante técnicas quirúrgicas de supervivencia. Para la cirugía de supervivencia, desinfectar la piel antes de la incisión con 3 aplicaciones alternas de yodopovidona y administrar buprenorfina por vía subcutánea (0,05 mg/kg) antes de la cirugía. Continúe administrando buprenorfina subcutánea cada 12 h al menos 3 días después de la operación, con días adicionales si la rata muestra signos de dolor. Si se produce una lesión de la médula espinal, las ratas pueden presentar retención urinaria o marcha anormal. Esto se presentará como arrastre o retraso en el movimiento de las extremidades posteriores o vejigas palpables y distendidas. Si esto ocurre, las ratas domésticas con gel de agua fortificado nutricionalmente para la alimentación y la hidratación y extraen manualmente las vejigas dos veces al día hasta que se recupere la micción refleja. Si hay parálisis completa de las extremidades traseras o dolor intratable, eutanasia a la rata.

Resultados

Este artículo demuestra que la aplicación simultánea de la sonicación LIFU y la administración de MB es una técnica eficaz para la disrupción localizada de BSCB. La apertura del BSCB está indicada por la presencia de extravasación de EBD en el parénquima espinal. Los cambios son evidentes tanto visualmente como bajo microscopía de fluorescencia. La vasculatura de la médula espinal es visible después de la laminectomía y muestra la vena espinal posterior con múltiples vasos más pequeños que irradian lateralmente (Figura 4A). La inyección intravenosa de EBD a través del catéter de la vena de la cola da como resultado que esta vasculatura se enriquezca con tinte azul (Figura 4B). Este es un buen punto en el procedimiento para verificar que la laminectomía no resultó en la ruptura de ninguna vasculatura espinal, ya que esto resultaría en una acumulación de sangre azul sobre el cordón. Después de la sonicación, debería hacerse visible una mancha azul sobre la ubicación objetivo, lo que indica la extravasación de la EBD en el parénquima blanco debido a la interrupción del BSCB (Figura 4C). El tamaño de esta mancha varía en función de una serie de factores, como el tamaño de la región focal del transductor y el tiempo transcurrido tras la sonicación. Para aumentar las posibilidades de ver una extravasación de la EBD, hay que alargar el tiempo entre la sonicación y la extracción de la médula espinal.

Aunque la perfusión de PFA no es un paso necesario antes de la extracción del cordón umbilical y el posterior análisis de tejido, elimina la sangre de la muestra y aumenta el contraste entre el parénquima espinal blanco y las regiones teñidas con EBD azul. Todas las ratas que recibieron la administración de MB y la sonicación LIFU muestran una aparente extravasación de la EBD a la médula espinal, mientras que los controles negativos que recibieron MB y EBD sin sonicación LIFU no lo hacen. En la Figura 5 se muestran imágenes representativas. Los cortes sagitales a través de los tejidos revelan que la extravasación de la EBD no solo es superficial, sino que se extiende hasta el propio cordón. Esto es esperable, ya que la región focal del transductor utilizado en este estudio es mayor que el diámetro de la médula espinal de la rata. A veces, se pueden observar pequeñas cantidades de hemorragia en los cortes sagitales. Esto puede deberse a la laminectomía o a la sonicación por ultrasonido. Si la hemorragia está cerca de la periferia dorsal del cordón, es más probable que se deba a la laminectomía.

Para evaluar más a fondo la extravasación de la EBD, las secciones sagitales de la médula espinal se tiñeron con DAPI (marcador nuclear) y se tomaron imágenes con un microscopio fluorescente. Todos los cordones que recibieron sonicación LIFU (n = 3) mostraron una intensidad significativamente mayor de autofluorescencia EBD (p = 0,016) que los cordones que no recibieron sonicación, con intensidades similares de DAPI presentes en ambos (Figura 6). El análisis de H&E reveló además que no había daño neuronal, hemorragia o lesiones en las cavidades presentes en las localizaciones sonicadas, lo que respalda la seguridad de este procedimiento. A modo de comparación, se muestran ejemplos de cordones lesionados debido a una mala manipulación quirúrgica y a una sonicación de alta potencia. Se etiquetan hemorragias, daño tisular, lesiones de cavidades y posible vacuolización. Aunque el ejemplo de la sonicación de alta potencia no muestra hemorragia, también se ha informado de ello como un efecto de la interrupción de los ultrasonidos.

Además, se realizó un análisis de comportamiento en ratas que recibieron MBs, EBD y sonicación LIFU. Aunque este método no excluye por completo el daño tisular, sí prueba si se produjeron déficits motores debido a este procedimiento. Se grabó a las ratas caminando en una jaula durante 5 minutos todos los días durante un período de 5 días, y la función locomotora se clasificó en función de la escala locomotora de Basso Beattie Bresnahan (Archivo de video suplementario 1). Todas las ratas (n = 5) recibieron la puntuación más alta antes de la sonicación, después de la sonicación y todos los días del período de supervivencia (Figura 7).

Por último, se midieron los efectos térmicos de los parámetros de sonicación utilizados en este estudio utilizando dos muestras de médula espinal de rata ex vivo y una sonda de termómetro digital con una punta fina insertada en el cordón.  Se realizó un seguimiento de la temperatura de las muestras de médula espinal durante 5 minutos antes, durante y después de la sonicación, durante un total de 15 minutos. Se observaron cambios mínimos en la temperatura. De hecho, hubo un cambio de ≤1,3 °C debido a la sonicación en ambas muestras, lo que disminuyó la probabilidad de lesión hipertérmica como resultado de la sonicación (Figura 8).

Figura 1: Mecanismo de apertura de la barrera sangre-médula espinal mediada por ultrasonidos focalizados de baja intensidad. (A) Resumen esquemático de la sonicación por ultrasonidos focalizados de baja intensidad (LIFU) de la médula espinal de rata. (B) El mecanismo de apertura de la barrera hemato-médula espinal (BSCB) a través de la sonicación LIFU de microburbujas intravenosas (MB). Los MB oscilan en respuesta a LIFU, lo que provoca el ensanchamiento de las uniones estrechas entre las células endoteliales. Esta disrupción del BSCB permite la extravasación de nanopartículas, fármacos terapéuticos o colorante azul de Evans. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Configuración y conectividad de sobremesa de ultrasonido focalizado de baja intensidad. (A) Representación esquemática que muestra los componentes típicos de ultrasonido focalizado. (B) Imagen general de la configuración de ultrasonido enfocado, que incluye: 1. salida de potencia del transductor (TPO), 2. red de emparejamiento, 3. Transductor LIFU, 4. el instrumento estereotáxico, 5. pinzas móviles. (C) Transductor, que incluye: 1. soporte de sonda, 2. transductor de anillo, 3. cono de agua, 4. tubo de entrada de agua, 5. tubo de salida de agua, 6. membrana asegurada con una banda elástica. (D) Frente del TPO, que incluye: 1. Carcasa blindada de RF, 2. Panel de visualización frontal sensible al tacto con menú ajustable, 3. Perilla giratoria para ajuste de parámetros, 4. Interruptor de salida de arranque/parada. (E) Parte posterior del TPO, que incluye: 1. conectores de salida de canal, 2. tierra, 3. puerto de entrada USB para control de software, 4. disparador interno, 5. conector de salida de sincronización, 6. conector de entrada de alimentación y suministro, 7. interruptor de encendido / apagado. (F) Salida de red coincidente, con cables que coincidan con los números de canal. (G) Entrada XDR de red coincidente, con cables que coinciden con los números de canal Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Localización de objetivos con guiado láser . (A) Brazo estereotáctico con rango de movimiento en los tres ejes y capacidades de rotación. Se fija a la placa de fijación que se encuentra debajo. (B) Aparato láser para la identificación de la zona focal. El láser se coloca en la punta del transductor y está alineado con la región focal. (C) Ilustración que muestra el láser en la médula espinal expuesta, lo que indica que la región focal del transductor ahora se dirige a esta ubicación. (D) El transductor se baja hasta que la punta del cono se encuentra 1 cm por encima del cable, y el espacio se llena con gel para garantizar el máximo acoplamiento. La distancia desde el transductor hasta la médula espinal es de 40 mm (distancia focal). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Extravasación del colorante azul de Evans en la médula espinal después de la sonicación. (A) Imagen de la incisión de laminectomía en rata T9-T11, con la médula espinal expuesta y la vena dorsal posterior claramente visibles. (B) El tejido circundante y la vasculatura de la médula espinal se vuelven azules después de la inyección intravenosa de tinte azul de Evans (EBD). (C) Extravasación de EBD en el parénquima de la médula espinal en el sitio de la sonicación, lo que indica que se ha producido una interrupción de BSCB. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Extracción de la médula espinal y visualización de la apertura de BSCB después de la perfusión. (A) Médula espinal extirpada de rata control sin tratamiento LIFU. Esta rata solo recibió MBs y EBD. En el recuadro se muestra un corte sagital medio del cordón incrustado en parafina, y no se aprecia extravasación de la EBD. (B) Médula espinal extirpada de rata con tratamiento LIFU. Esta rata también recibió MBs y EBD. La columna de extravasación de EBD es visible y localizada en la región sonicada. En el recuadro se muestra el corte sagital medio del cordón incrustado en parafina, con una flecha que apunta a la concentración de EBD visible dentro de la ubicación sonicada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Detección y evaluación de la apertura de BSCB. (A) Médula espinal teñida con DAPI (marcador nuclear, azul). La autofluorescencia mínima de EBD (rojo) es visible. Esta rata no recibió LIFU. (B) Médula espinal teñida con DAPI (marcador nuclear, azul). La autofluorescencia EBD localizada (rojo) en la ubicación del objetivo sonicado es visible. Esta rata recibió LIFU y MBs. (C) La médula espinal de una rata sin LIFU teñida con hematoxilina (tinción de ácido nucleico) y eosina (tinción de proteína inespecífica) (H&E). No se aprecian daños neuronales, hemorragias ni lesiones en las cavidades. (D) La médula espinal de una rata con LIFU teñida con H&E. No hay daño neuronal, hemorragia o lesiones en la cavidad visibles. (E) Médula espinal de una rata con lesión quirúrgica teñida con H&E. Las flechas apuntan a una hemorragia amplia y daño tisular. (F) La médula espinal de una rata con daños debidos a la sonicación de alta potencia teñida con H&E. Las flechas apuntan a lesiones de la cavidad, y el recuadro muestra una posible vacuolización. (G) Gráficos de barras que muestran la intensidad de DAPI y EBD en la médula espinal de ratas con y sin sonicación LIFU. Hay significativamente más intensidad de EBD en la médula espinal LIFU en comparación con el control negativo (p = 0,016), a pesar de una intensidad similar de DAPI (p > 0,05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Ensayo conductual antes y después de la sonicación . (A) Configuración del aparato Basso, Beattie, Bresnahan, en el que se grabaron ratas caminando durante 5 minutos desde abajo. (B) Imagen fija de un video grabado. Este video se utilizó para calificar la coordinación motora y la marcha de la rata en la escala de Basso, Beattie, Bresnahan. (C) Diagrama de caja (n = 5) que no muestra ningún cambio en las puntuaciones motoras antes y después de la sonicación o durante un período de supervivencia de 5 días en ratas que recibieron MB y tratamiento con LIFU (p > 0,05). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Análisis de temperatura utilizando médula espinal ex vivo . Gráfico que muestra los cambios de temperatura en dos muestras de médula espinal ex vivo durante 5 minutos de duración antes, durante y después de la sonicación. Los parámetros utilizados para la sonicación se enumeran en la tabla 1. Para la muestra 1, las temperaturas medias previas, durante y posteriores a la sonicación fueron de 21,9 °C ± 0,1 °C, 22,1 °C ± 0,1 °C y 22,0 °C ± 0,1 °C, respectivamente. Para la muestra 2, las temperaturas previas, durante y posteriores a la sonicación fueron de 21,9 °C ± 0,1 °C, 22,5 °C ± 0,3 °C y 22,4 °C ± 0,2 °C, respectivamente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura complementaria 1: Archivo CAD del aparato de puntería láser. (A) Vista del aparato láser desde abajo. Cualquier láser se puede colocar dentro del orificio central en el medio. (B) Vista lateral del aparato láser. (C) Dimensiones del aparato láser, con unidades en pulgadas. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo de video suplementario 1: Video de una rata caminando en el aparato de Basso, Beattie, Bresnahan. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

Aquí, se describen el equipo y los pasos necesarios para una interrupción efectiva y específica de la BSCB utilizando ultrasonidos focalizados de baja intensidad (LIFU) combinados con la administración de microburbujas (MB). Este protocolo es flexible y puede optimizarse para su uso individual con transductores de diferentes especificaciones. Otras técnicas para la disrupción de la BSCB mediada por LIFU se basan en el uso de sistemas guiados por imágenes por resonancia magnética (IRM) para la localización de dianas, que es un recurso costoso¹⁶. Las ventajas de la técnica que aquí se presenta radican en la rápida confirmación visual en tiempo real de la interrupción de la BSCB y la facilidad de focalización debido a la naturaleza abierta del procedimiento. Además, el aparato láser es fácil de usar y construir, y se incluye un archivo CAD en la sección complementaria. Como resultado, los investigadores interesados en realizar pruebas iniciales sobre las capacidades de orientación de su transductor LIFU en un modelo de animal pequeño pueden utilizar este protocolo como una herramienta para confirmar rápidamente el posicionamiento de la zona focal sobre una ubicación de interés. Esta técnica también puede ser utilizada por los laboratorios que comienzan a estudiar las aplicaciones clínicas de LIFU, como la administración de fármacos, antes de invertir en modalidades de orientación más complejas, como los sistemas de US o RM. En la actualidad, las modalidades guiadas por ecografía presentan un camino más prometedor y rentable en comparación con los sistemas de RM, aunque estos últimos se observan con mayor frecuencia en la literatura.

Hay varios pasos críticos en este procedimiento que deben ejecutarse cuidadosamente para garantizar una interrupción exitosa de BSCB. Es imperativo evitar ejercer presión innecesaria sobre la médula espinal durante la laminectomía quirúrgica. Demasiada manipulación física de la médula aumenta la probabilidad de daño al BSCB. El daño aparece como una mancha de color marrón oscuro dentro del cordón después de la extracción debido a la hemorragia y al aumento de la extravasación de la EBD. Además, se debe garantizar el acoplamiento máximo entre el transductor y la médula espinal expuesta. Como resultado, se debe tener cuidado de eliminar las burbujas del cono de agua y el gel de ultrasonido. No debe haber espacios entre la parte inferior del cono de agua y el cable para garantizar la transmisión completa de la onda acústica. Durante el cateterismo de la vena de cola, se debe evitar el paso accidental de aire junto con las soluciones de solución salina heparinizada, EBD o MB. La inyección de aire aumenta considerablemente la posibilidad de una embolia pulmonar que resulta en la muerte del roedor antes de la conclusión del procedimiento²⁸.

Un problema común que se puede encontrar durante este procedimiento es la falla de la inyección exitosa de EBD. Para las personas con experiencia mínima en el cateterismo de la vena de la cola, realizar este paso antes de la laminectomía, el posicionamiento o la focalización del animal ahorrará tiempo. La EBD también puede inyectarse mucho antes de la inyección de MB sin influir en la sonicación. Utilizar el torniquete y el baño de agua tibia sugeridos en este protocolo ayudará a dilatar las venas de la cola y aumentará la tasa de éxito. Además, la deshidratación de ratas reduce la probabilidad de una correcta colocación del catéter. Una inyección intraperitoneal de solución salina 10-15 minutos antes del cateterismo de la vena de cola puede ayudar. Durante el cateterismo, se debe comenzar 2 pulgadas por encima del extremo de la cola y moverse en dirección caudal a craneal. Moverse en la dirección opuesta disminuye la probabilidad de éxito debido a un posible colapso o hemorragia de la vena.

Otro reto común es la falta de extravasación de EBD a pesar de la sonicación. Esto puede indicar que los parámetros que se utilizan para la sonicación son insuficientes para la interrupción de BSCB. Por ejemplo, si la frecuencia de sonicación se establece en un valor que difiere mucho de la frecuencia central del transductor, la potencia de sonicación será demasiado baja para oscilar los MB y provocar el aflojamiento de la unión estrecha. Además, cuantas más interfaces haya entre el transductor y el cable (por ejemplo, cono de agua, membrana, gel, burbujas de aire en agua/gel), menor será la verdadera intensidad de sonicación en el objetivo. Minimizar estas interfaces, por ejemplo, mediante el uso de gel desgasificado y la eliminación completa de las burbujas en el interior del cono, ayudará a transmitir todo el potencial de la sonicación. El protocolo también recomienda aumentar el tiempo entre la sonicación y la perfusión para permitir más tiempo para la extravasación de la EBD en el parénquima espinal. Aunque la interrupción de BSCB es un procedimiento transitorio, los huecos están presentes durante varias horas antes de cerrarse. Un tiempo de espera prolongado aumenta la exposición al isoflurano, pero también da lugar a una mayor extravasación de la EBD en el cordón. Alternativamente, la extravasación de EBD puede estar presente a pesar de que no haya sonicación con LIFU. Para solucionar este problema, se debe tener cuidado durante la laminectomía para evitar cualquier daño accidental al BSCB. Las posibles soluciones incluyen levantar la columna vertebral de la rata durante el pinzamiento para aumentar la cantidad de espacio entre las láminas y el cordón, así como una laminectomía más corta. Una perfusión completa de PFA también reduce las manchas de fondo al eliminar la sangre enriquecida con EBD de la vasculatura dentro de la médula espinal. Durante la perfusión transcárdica, se debe tener cuidado para evitar la ruptura accidental del corazón, que puede resultar en fugas de PBS o PFA.

Es importante tener en cuenta que este estudio representa una experiencia de un solo centro para la disrupción de BSCB mediada por LIFU. Además, este protocolo no prueba ni optimiza varios parámetros de energía de sonicación y concentraciones de MB. Como resultado, se alienta a los investigadores a investigar varios parámetros y concentraciones al realizar esta técnica para optimizar la localización del objetivo y la interrupción de BSCB para sus necesidades particulares de investigación, especialmente si los resultados iniciales producen efectos adversos. Los grupos que deseen no ver cambios de temperatura, por ejemplo, pueden probar varios parámetros hasta que encuentren un conjunto que cumpla con este criterio y logre una interrupción suficiente de BSCB. Además, se pueden realizar experimentos adicionales para confirmar la seguridad de esta técnica. Por ejemplo, se puede aumentar el tamaño de las muestras, se puede extender el período de supervivencia y se pueden realizar estudios de electromiografía/análisis de la marcha. Para supervivencias más largas, es importante tener en cuenta que algunos estudios muestran que dosis altas de EBD a veces pueden causar toxicidad sistémica crónica, por lo que una dosis más baja puede ser prudente²⁹.

Otra limitación de este procedimiento es la naturaleza invasiva de la laminectomía (que se requiere para cualquier técnica que utilice LIFU para la apertura de BSCB, ya que el ultrasonido no puede penetrar a través del hueso). La naturaleza invasiva de este procedimiento se puede reducir limitando la duración de la laminectomía. La realización de la laminectomía en las vértebras torácicas superiores, que son más cortas y delgadas, puede reducir el tiempo necesario para la laminectomía a menos de 10 minutos. Debido a la naturaleza frágil de los MB, así como a su corta vida media, el tiempo es limitado durante este protocolo. La inyección de MB debe producirse 1-2 minutos antes del tratamiento con LIFU, y deben administrarse nuevos MB antes de cada sonicación si se realizan múltiples tratamientos con LIFU. Para los experimentos que involucran la interrupción de BSCB para múltiples ratas, es posible que sea necesario preparar varios viales de MB. Dado que las microburbujas son caras, es preferible modificar el flujo de trabajo quirúrgico para minimizar el tiempo entre sonicaciones para conservar el número de MB utilizados.

La técnica descrita aquí es principalmente para su uso como protocolo de investigación. Aunque el aparato de puntería láser no sustituirá a las modalidades tradicionales de puntería en todos los entornos clínicos, puede ser útil en otras situaciones. En el caso de las cirugías no invasivas, las modalidades tradicionales de resonancia magnética pueden utilizarse de forma fiable para dirigirse a³⁰. En el caso de las cirugías invasivas que incluyen la realización de una laminectomía, el aparato de punta láser descrito en este protocolo puede utilizarse para localizar rápidamente el centro de la zona focal de sonicación sobre una región específica (por ejemplo, un tumor o un sitio de lesión de la médula espinal) con el fin de administrar fármacos o terapia inmunomoduladora, al tiempo que se complementa cualquier guía por RM que se esté llevando a cabo.

En general, este protocolo describe una técnica eficaz y exitosa para la interrupción del BSCB e incluye varias opciones para la confirmación de la apertura del BSCB, tanto en tiempo real como en el posprocesamiento. Dado que el BSCB funciona como una barrera de entrada al parénquima de la médula espinal, la interrupción del BSCB es un posible método para mejorar la administración de terapias. Por ejemplo, Weber-Adrian et al. utilizaron LIFU con una frecuencia de 1,114 MHz y una longitud de ráfaga de 10 ms para mediar la entrega de genes a la columna cervical⁶. De manera similar, Smith et al. demostraron que LIFU con una frecuencia de 580 kHz, presiones máximas acústicas promedio de alrededor de 0,46 MPa y una longitud de ráfaga de 10 ms podría ayudar en la administración de un anticuerpo monoclonal, trastuzumab, a la médula espinal en un modelo de metástasis leptomeníngeas en roedores¹⁰. La mayoría de los estudios se han centrado en la utilización de LIFU, en lugar de HIFU, debido a la capacidad de LIFU para permeabilizar transitoriamente el BSCB mientras se evita el daño al tejido subyacente. Normalmente, LIFU utiliza intensidades entre 0,125-3 W/cm2, mientras que HIFU utiliza intensidades de 100-10.000 W/^cm2 o^{superiores 31}. Como resultado, el HIFU ejerce sus efectos principalmente a través del calentamiento del tejido, mientras que el LIFU, con la coadministración de MB, funciona a través de efectos de cavitación mecánica. La coadministración de tratamientos con MB puede dar lugar a una mayor extravasación del fármaco en el parénquima espinal, así como a la posibilidad de cargar MB con fármaco y lisar los MB con ultrasonido para la administración dirigida del fármaco.

Los parámetros de sonicación, la concentración de MB y el tipo de transductor utilizados en este estudio pueden modificarse en función de las necesidades experimentales. Por ejemplo, un transductor con una región focal más pequeña puede ser preferible para experimentos en los que se necesita un mayor control sobre la orientación localizada, mientras que un transductor con mayor potencia puede utilizarse para experimentos que requieren una interrupción potente en un período de tiempo más corto. Debido a la flexibilidad que ofrece este protocolo, existe un gran potencial de uso en la investigación preclínica, clínica y traslacional.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Cloruro de sodio heparinizado al 0,9%	Baxter	FKB0953G	Catéter de vena de cola con solución salina heparinizada para prevenir la formación de coágulos.
Jeringa Luer Lock Tip de 100 ml (2)	Wilburn Medical	WUSA/120	Una jeringa se puede utilizar para inyectar PBS y otra para PFA (durante la perfusión transcárdica)
1x Solución salina tamponada con fosfato (PBS)	Thermo Scientific	10010001	Para la perfusión transcárdica.
Catéter de 22 G	Med Vet International	50-209-1694	Se utiliza para colocar un catéter de vena de cola.
97% Isoflurano	Thermo Scientific Chemicals	247-897-7	Mientras la rata esté bajo isoflurano, tenga cuidado de no administrar demasiado. Una dosis alta puede sacrificar a la rata.
Betadine 7.5%	Purdue Products	4677
Vial de vidrio roscado transparente Clase A	Fisherbrand	14-955-314	Úselo para almacenar la extracción de la médula espinal.
Báscula de equilibrio digital	Kent Scientific	SCL-4000
Maquinilla de afeitar eléctrica	Wahl Home Products	79449-200	Afeitar el pelo de la piel en el lugar de la incisión antes de la cirugía
Eosin-Y con floxina	Epredia	71304
Evans tinte azul	MP Biomedicals	02151108-CF	Aunque no es tóxico, teñirá la piel de azul si se produce un contacto directo.
Conjunto de placa de fijación con pinzas de 0,5 mm	Impactadores PSI	7001-2	Fije el brazo estereotáctico a este marco
Gasa		Fisherbrand 13-761-52
Almohadilla térmica	Kent Scientific	RT-0515
Hematoxylin	Epredia	7211
Tijeras de iris con cuchillas en ángulo	ProDentUSA	12-15315
Sistema de inducción de isoflurano	Kent Scientific	SOMNO-RATKIT
Aparato de puntería láser	NA		diseño CAD personalizado proporcionado en la sección complementaria. Simplemente coloque un láser dentro del aparato creado a partir del archivo.
Pomada lubricante para los ojos	Systane	N/A
Luer Lock Llave de paso de 3 vías	Sigma	SAS7521-10EA	Se puede usar para llenar el cono de agua a través de la válvula de entrada
Kit de microburbujas Lumason	Bracco	0270-7099-16
Cubreobjetos para microscopio	Fisherbrand	12-545J
Portaobjetos para microscopio	Fisherbrand	12-550-15
Microtomo	Epredia	23-900-671
Medio de montaje con 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI)	Vector Laboratories	H-2000-2
Membrana de Mylar	Chemplex	3016	Puede cortar la membrana al tamaño adecuado si es demasiado grande para el cono
Transductor NeuroFUS de 2,52" de diámetro y 250 kHz	CTX-250	Sonic Concepts	incluye un cono de agua personalizado y un soporte para sonda
Sistema NeuroFUS PRO v2.0	Sonic Concepts	NFS102v2	Incluye salida de alimentación del transductor, red coincidente y cables asociados
Alicates de hueso compensados	Fine Science Tools	16101-10	Uso para eliminar procesos espinosos y láminas para laminectomía
Parafina	Polysciences	24364-1	Puede colocar una muestra de médula espinal en parafina para cortarla en secciones delgadas para la histología.
Paraformaldehído (4%)	Thermo Scientific	J61899-AK	Para perfusión transcárdica.
Kit quirúrgico para ratas	Kent Scientific	INSRATKIT	Consta de pinza # 5, soporte para agujas, tijeras McPherson-Vannas, tijeras Iris, retractores autoretenedores ALM, pinzas para iris y sonda roma. Estos productos deberían ser suficientes para realizar una laminectomía.
Hoja de afeitar Fisherbrand		12-640	Úsela para cortar la extracción de la médula espinal a la longitud deseable y dividir la sección hacia abajo en la línea media.
Termómetro rectal	Kent Scientific	RET-2	Mantenga la temperatura de la rata entre 35.9 y 35 mm; 37.5 y grados; C
Banda elástica	Fisherbrand	50-205-1983
Unidad vaporizadora de un solo animal	Kent Scientific	SF-01
Brazo estereotáctico	Kopf Instruments Modelo	963
Almohadilla absorbente estéril	McKesson	4033-CS150	Colocar debajo de la rata y encima de la almohadilla térmica y la placa de fijación antes de la laminectomía
Gel de ultrasonido	Aquasonic	PLI 01-34	Asegúrese de que el gel esté libre de burbujas lo mejor que pueda.