Diferenciación de células madre pluripotentes inducidas por humanos a células cerebrales similares a células endoteliales microvasculares con un fenotipo inmune maduro

Summary

Aquí, describimos un protocolo, el método de cultivo de células endoteliales extendidas (EECM), que permite la diferenciación de células madre pluripotentes a células similares a células endoteliales microvasculares cerebrales (BMEC). Estas células muestran la expresión de la molécula de adhesión de células endoteliales y, por lo tanto, son un modelo de barrera hematoencefálica humano adecuado para estudiar las interacciones de las células inmunes in vitro.

Abstract

La disfunción de la barrera hematoencefálica (BHE) es un sello patológico de muchas enfermedades neurodegenerativas y neuroinflamatorias que afectan al sistema nervioso central (SNC). Debido al acceso limitado a las muestras de BBB relacionadas con la enfermedad, todavía no se comprende bien si el mal funcionamiento de BBB es causal para el desarrollo de la enfermedad o más bien una consecuencia del proceso neuroinflamatorio o neurodegenerativo. Por lo tanto, las células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC) brindan una nueva oportunidad para establecer modelos de BBB in vitro de donantes y pacientes sanos y, por lo tanto, para estudiar las características específicas de la enfermedad de BBB de pacientes individuales. Se han establecido varios protocolos de diferenciación para derivar células cerebrales similares a las células endoteliales microvasculares (BMEC) de hiPSC. La consideración de la pregunta de investigación específica es obligatoria para la elección correcta del protocolo de diferenciación BMEC respectivo. Aquí, describimos el método de cultivo celular endotelial extendido (EECM), que está optimizado para diferenciar hiPSCs en células similares a BMEC con un fenotipo inmune maduro, lo que permite el estudio de las interacciones célula-BBB inmune. En este protocolo, las hiPSC se diferencian primero en células progenitoras endoteliales (EPC) mediante la activación de la señalización Wnt/β-catenina. El cultivo resultante, que contiene células similares al músculo liso (SMLC), se pasa secuencialmente para aumentar la pureza de las células endoteliales (CE) e inducir propiedades específicas de BBB. El cocultivo de EECM-BMEC con estos SMLC o medio acondicionado de SMLC permite la expresión reproducible, constitutiva y regulada por citoquinas de moléculas de adhesión EC. Es importante destacar que las células similares a EECM-BMEC establecen propiedades de barrera comparables a las BMEC humanas primarias, y debido a su expresión de todas las moléculas de adhesión de EC, las células similares a EECM-BMEC son diferentes de otros modelos de BBB in vitro derivados de hiPSC. Las células tipo EECM-BMEC son, por lo tanto, el modelo de elección para investigar el impacto potencial de los procesos de enfermedad a nivel de la barrera hematoencefálica, con un impacto en la interacción de las células inmunes de manera personalizada.

Introduction

La unidad neurovascular (NVU) en el sistema nervioso central (SNC) consiste en las células endoteliales microvasculares (CE) altamente especializadas, pericitos incrustados en la membrana basal endotelial, así como la membrana basal parenquimatosa y los pies terminales de los astrocitos¹. Dentro de la NVU, las células endoteliales microvasculares cerebrales (BMEC) son los componentes clave que forman la barrera hematoencefálica (BBB). Los BMEC forman uniones estrechas complejas y continuas y tienen una actividad pinocitótica extremadamente baja en comparación con las CE microvasculares en órganos periféricos, lo que permite que la BBB inhiba la difusión paracelular libre de moléculas solubles en agua en el SNC. La expresión de transportadores de afluencia específicos y bombas de eflujo por BMEC asegura la absorción y exportación de nutrientes y moléculas dañinas, respectivamente, desde el SNC². Además, la barrera hematoencefálica controla estrictamente la entrada de células inmunes en el SNC expresando bajos niveles de moléculas de adhesión endotelial cruciales para el tráfico de células inmunes en el SNC³. En condiciones fisiológicas, los niveles de expresión de moléculas de adhesión en la superficie de los BMEC, como la molécula de adhesión intercelular-1 (ICAM-1) y la molécula de adhesión celular vascular-1 (VCAM-1), son bajos, pero estos niveles aumentan en algunos trastornos neurológicos². La ruptura morfológica y funcional de la BHE se reporta en muchas enfermedades neurológicas, como el accidente cerebrovascular⁴, la esclerosis múltiple (EM)⁵ y varias enfermedades neurodegenerativas ^6,7,8. La investigación detallada de las características celulares y moleculares de los BMEC en condiciones fisiológicas y patológicas es un enfoque para identificar nuevas estrategias terapéuticas que se dirigen a la barrera hematoencefálica.

Hasta hace poco, se utilizaban BMEC humanos y roedores primarios o inmortalizados para estudiar la barrera hematoencefálica. Sin embargo, no está claro si las conclusiones basadas en modelos animales de la BBB son fácilmente aplicables a la BBB humana, ya que la expresión de varias moléculas importantes, incluyendo moléculas de adhesión y proteínas transportadoras de solutos, difiere entre humanos y roedores ^9,10. Aunque las líneas BMEC humanas como hCMEC/D3 expresan niveles apropiados de moléculas de adhesión¹¹, estas BMEC inmortalizadas generalmente no tienen uniones estrechas complejas y propiedades de barrera robustas¹². Los BMEC humanos primarios son útiles para estudiar las funciones de barrera¹³, pero no están fácilmente disponibles para todos los investigadores. Además, los BMEC primarios de los pacientes pueden ser difíciles de obtener, ya que deben recolectarse a través de una biopsia cerebral o cirugía que solo se realiza en condiciones clínicas específicas.

Los avances recientes en la tecnología de células madre han permitido la diferenciación de varios tipos de células humanas, que surgen de fuentes de células madre como las células madre pluripotentes inducidas por humanos (hiPSC). Los modelos derivados de hiPSC nos permiten establecer modelos fisiopatológicos utilizando muestras derivadas de pacientes. Se pueden combinar varios tipos de células derivadas de hiPSC para establecer cocultivos autólogos u organoides que imiten mejor las condiciones fisiológicas. Se pueden usar varios protocolos ampliamente utilizados 14,15,16,17,18,19 para diferenciar células similares a BMEC derivadas de hiPSC que tienen propiedades robustas de barrera de difusión con la expresión de transportadores específicos de BBB y bombas de flujo, y son útiles para estudiar la difusión paracelular de moléculas pequeñas, mecanismos de transporte molecular y administración de fármacos al cerebro ^20,21. Sin embargo, estudios previos han demostrado que las células similares a BMEC derivadas de hiPSC ampliamente utilizadas carecen de la expresión de moléculas clave de adhesión endotelial, incluidas VCAM-1, selectinas e ICAM-2, que son responsables de mediar las interacciones entre las células inmunes y la BBB²². Además, se ha informado que los BMEC derivados de hiPSC anteriores muestran características endoteliales y epiteliales mixtas a nivel transcripcional²³. Por lo tanto, desarrollamos el método de cultivo celular endotelial extendido (EECM), un protocolo novedoso que permite la diferenciación de hiPSC en células similares a BMEC que se asemejan a BMEC humanas primarias con respecto a la morfología, las características de barrera y la expresión de la molécula de adhesión endotelial. Este protocolo describe los procedimientos metodológicos detallados para diferenciar las hiPSC de las células similares a BMEC que muestran un fenotipo inmune maduro.

Protocol

Figura 1: Descripción general del protocolo. El manuscrito presenta un protocolo paso a paso para diferenciar hiPSCs en células tipo EECM-BMEC. Los esquemas correctos representan las poblaciones celulares en cada paso. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La línea hiPSC, HPS1006, fue proporcionada por el RIKEN BRC a través del Proyecto Nacional de Recursos Biológicos del MEXT/AMED, Japón.

1. Inducción de la diferenciación de hiPSC en células progenitoras endoteliales (EPC)

1. Placas y reactivos recubiertos con matriz extracelular (ECM)
   1. Preparar placas de 12 pocillos recubiertas con matriz de membrana basal alícuotas de 2,5 mg de gel de matriz en tubos de centrífuga de 50 ml para su almacenamiento a -20 °C durante un máximo de 6 meses. Añadir 30 ml de la mezcla de medios/nutrientes F-12 (DMEM/F12) modificada de Dulbecco de Dulbecco en frío, que se ha conservado en nevera (4 °C). Mezclar suavemente pipeteando hasta que el gel se haya descongelado y luego añadir 500 μL de la solución a cada pocillo de la placa de 12 pocillos. Colocar la placa en una incubadora (37 °C, 5%_CO2) durante al menos 1 h.
      NOTA: El gel de matriz de membrana basal es sensible a la temperatura y debe manipularse de acuerdo con las instrucciones del fabricante para la alícuota y el recubrimiento de placas. La concentración de proteínas de la matriz extracelular puede variar entre lotes. Para garantizar la exactitud, la concentración exacta debe mencionarse en la hoja de certificado de calidad para el lote específico, utilizando el número de lote. Por ejemplo, si la concentración exacta es de 10,0 mg/ml, utilice 250 μL de gel para un total de 2,5 mg.
   2. Preparar la solución madre inhibidora de la rho-quinasa (ROCK) disolviendo el inhibidor de ROCK en agua estéril hasta una concentración de 10 mM (Tabla 1). Alícuota la solución madre en volúmenes de 100-200 μL y almacenar a -20 °C para evitar ciclos de congelación-descongelación.
   3. Hacer una solución madre de 100 mg/ml de ácido L-ascórbico disolviendo 5 g de ácido L-ascórbico en 50 ml de agua estéril y almacenar a -20 °C (Tabla 1). Añadir 6,25 ml de glutamina y 305 μL de solución madre de ácido L-ascórbico en 500 ml de DMEM/F12 avanzado para formar un medio LaSR²⁴ (Tabla 1). Conservar a 2-8 °C durante un máximo de 2 semanas.
   4. Preparar la solución de CHIR99021 disolviendo CHIR99021 en dimetilsulfóxido (DMSO) sin diluir hasta una concentración final de 10 mM (Tabla 1). Alícuota la solución en volúmenes de 100-200 μL para evitar ciclos de congelación-descongelación y almacenar a -20 °C durante un máximo de 1 año. Conservar las alícuotas de trabajo de la solución madre a 4 °C durante un máximo de 1 mes.
   5. Prepare el medio DMEM/F12-10 agregando 50 ml de suero bovino fetal inactivado por calor a 450 ml de DMEM/F12. Conservar el medio a 2-8 °C durante un máximo de 1 mes (Tabla 1).
   6. Prepare el tampón de flujo-1 agregando 33.3 ml de albúmina sérica bovina (BSA) al 7.5% a 467 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) de Dulbecco (Tabla 1). Conservar a 2-8 °C durante un máximo de 6 meses.
2. Siembra de hiPSCs singularizadas y expansión para diferenciación EPC (Día -3 a Día -1)
   1. Comenzar la diferenciación cuando las colonias de hiPSC en una placa de 6 pocillos no muestran diferenciación espontánea y tienen la densidad apropiada para el paso, típicamente alrededor del 80% de confluencia (2.5-3.5 x 10⁶ células). Controle cuidadosamente las células espontáneamente diferenciadas bajo el microscopio para asegurarse de si se requieren múltiples pasajes para eliminar las células no diferenciadas. Consulte la nota que se proporciona a continuación en el paso 1.4.15 para obtener información sobre el medio de cultivo celular y la matriz extracelular.
   2. Aspirar el medio y añadir 1 mL de reactivo de disociación a los pocillos e incubar durante 5-7 min a 37 °C. Disociar y singularizar las células pipeteando suavemente la solución de reactivo de disociación sobre las superficies de los pocillos dos o tres veces.
   3. Transfiera las células desprendidas a un tubo de 15 ml que contenga 4 ml de medio de mantenimiento hiPSC y resuspenda las células completamente. Reservar una alícuota de 10 μL para el recuento celular.
   4. Granular las células centrifugando durante 5 min a 200 x g a 20-25 °C. Contar las células y calcular el volumen requerido para lograr una densidad adecuada de hiPSCs (75-400 x 10³ por pocillo) en una placa de 12 pocillos recubierta con matriz de membrana basal (paso 1.1.1).
   5. Aspirar la solución de recubrimiento de los pocillos y añadir 1 ml de medio hiPSC que contenga 10 μM inhibidor de ROCK en cada pocillo (dilución 1:1.000). Después de centrifugar, aspirar el sobrenadante y disociar el pellet en 1 ml de medio hiPSC.
   6. Añadir el volumen requerido de hiPSC, determinado en el paso 1.2.4, a cada pocillo de la placa de 12 pocillos. De dos a cuatro placas de 12 pocillos pueden ser suficientes para diferenciar un clon hiPSC. Consulte el paso 1.2.4 para determinar el número de placas necesarias para sembrar células.
   7. Colocar la placa en una incubadora (37 °C, 5%_CO2). Distribuya uniformemente las células deslizando suavemente la placa hacia adelante y hacia atrás y luego de lado a lado en la incubadora.
   8. Al día siguiente (es decir, día -2), intercambiar el medio con 2 ml de medio de mantenimiento hiPSC que carezca de inhibidor de ROCK. Al día siguiente (Día -1), cambie el medio con 2 ml de medio de mantenimiento hiPSC nuevo.
3. Inducción de EPCs con el inhibidor de la glucógeno sintasa quinasa 3 (GSK-3) CHIR99021 (Día 0 a Día 5)
   1. El día 0, reemplace el medio de mantenimiento hiPSC en cada pocillo con 2 ml de medio LaSR que contenga 8 μM CHIR99021.
   2. El día 1, aspirar el medio y añadir 2 ml de medio LaSR fresco que contenga 8 μM CHIR99021.
   3. En los días 2, 3 y 4, reemplace el medio con 2 ml de medio LaSR fresco que carezca de CHIR99021.
4. Clasificación celular activada magnéticamente (MACS) para purificar CD31⁺ EPCs (Día 5)
   1. El día 5, aspirar el medio y luego agregar 1 ml de reactivo de disociación a cada pocillo, antes de incubar durante 6-8 min a 37 °C.
   2. Disociar y singularizar las células con una micropipeta y pasar a través de un filtro celular de 40 μm para filtrar la suspensión en un tubo de 50 ml que contiene 10 ml de medio DMEM/F12-10. Filtre la suspensión celular recogida de más de dos placas de 12 pocillos en al menos dos tubos de 50 ml.
   3. Detenga la reacción de digestión agregando medio DMEM/F12-10 (hasta 50 ml). Pipetear bien y reservar 10 μL para contar células. Granular las células centrifugando durante 5 min a 200 x g a 20-25 °C.
   4. Después de retirar el sobrenadante, agregue 10 ml de medio DMEM/F12-10 y transfiera la suspensión celular a tubos frescos de 15 ml. Granular las células centrifugando durante 5 min a 200 x g a 20-25 °C.
   5. Aspirar el sobrenadante y resuspender en tampón de flujo-1 a una densidad de 1,0 x 10⁷ células por 100 μL de tampón.
   6. Agregue el reactivo bloqueador de FcR en una proporción de 1:100 e incube durante 5 minutos antes de agregar el anticuerpo CD31 marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) diluido 1:200. Incubar la suspensión durante 30 minutos en la oscuridad a 20-25 °C.
   7. Añadir 10 mL de tampón de flujo-1, reservando 10 μL de la suspensión para el análisis de citometría de flujo para determinar la fracción de células CD31⁺ (Figura 2).
   8. Granular las células centrifugando a 200 x g durante 5 min a 20-25 °C. Luego, retire el sobrenadante y vuelva a suspender a una densidad de 1.0 x 10⁷ células por 100 μL de solución tampón de flujo-1. Añadir el cóctel de selección FITC (5 μL por 100 μL de suspensión celular). Mezclar bien pipeteando e incubar en la oscuridad durante 15 min a 20-25 °C.
   9. Añadir 5 μL de nanopartículas magnéticas por cada 100 μL de suspensión celular, pipetear bien e incubar en la oscuridad durante 10 min a 20-25 °C.
   10. Transfiera la suspensión celular a un tubo de citometría de flujo de 5 ml y agregue tampón de flujo-1 para lograr un volumen total de 2,5 ml. Coloque el tubo de citometría de flujo en el imán durante 5 min.
   11. En un movimiento continuo, invierta el imán y decanta la suspensión celular que contiene células que no fueron marcadas con el anticuerpo FITC-CD31. Mantenga el imán y el tubo en posición invertida durante 2-3 s y luego retire el líquido restante. Aspire cualquier gota en el borde del tubo antes de devolver el tubo a una posición vertical.
   12. Tome el tubo de citometría de flujo del imán y agregue 2.5 ml de tampón de flujo-1 para lavar las células CD31⁺ restantes. Resuspenda las células pipeteando suavemente las células hacia arriba y hacia abajo dos o tres veces. Coloque el tubo de flujo en el imán durante 5 minutos.
   13. Repita los pasos 1.4.11-1.4.12 tres veces y luego el paso 1.4.11 una vez más para un total de cuatro lavados.
   14. Retire el tubo de flujo del imán y agregue la cantidad indicada de un medio adecuado (por ejemplo, medio libre de suero endotelial humano [hECSR] para cultivo EC extendido o medio de congelación para congelación) al tubo para resuspender las células CD31⁺ purificadas. Reservar dos alícuotas de 10 μL de la suspensión, una para el recuento celular y la segunda para realizar análisis de citometría de flujo para evaluar la pureza de las células CD31⁺ en muestras post-MACS (Figura 2). Si no se dispone inmediatamente de un citómetro de flujo, conservar la alícuota a 4 °C hasta su análisis.
   15. Si los siguientes pasos (a través del paso 2) no se pueden llevar a cabo inmediatamente, congele los CD31⁺ EPC en este punto. Para la expansión y el paso selectivo de EPC, continúe con el paso 2.
       NOTA: Las placas de 12 pocillos recubiertas de Vitronectina de²⁵ pocillos y el medio de mantenimiento hiPSC más estable (mTeSR plus) se pueden usar en lugar de placas recubiertas de matriz de membrana basal y medio de mantenimiento hiPSC (mTeSR1). Para preparar placas de 12 pocillos recubiertas de vitronectina, diluir la vitronectina con tampón de dilución hasta una concentración final de 10 μg/ml y luego transferir 500 μL de la solución diluida a cada pocillo de las placas de 12 pocillos. Dejar las placas a 20-25 °C durante al menos 1 h. La densidad de siembra de las hiPSC singularizadas es comparable a la utilizada para las placas recubiertas de matriz de membrana basal. Cambiar el medio de cultivo o la composición de la matriz puede afectar la proliferación y diferenciación espontánea de las hiPSC, que generalmente requieren de 1 a 2 semanas para adaptarse a las nuevas condiciones de cultivo. Si el medio de mantenimiento hiPSC más estable se utiliza para el mantenimiento hiPSC, este medio se puede utilizar para la diferenciación EPC en lugar del medio de mantenimiento hiPSC. En este caso, el medio de mantenimiento hiPSC más estable debe cambiarse en el día -2 para eliminar el inhibidor de ROCK, y se puede omitir el intercambio en el día -1.

2. Método de cultivo de células endoteliales extendidas (EECM) para diferenciar las células similares a células endoteliales microvasculares cerebrales (células similares a BMEC) y las células similares al músculo liso (SMLC)

1. Preparación de placas y reactivos recubiertos de colágeno
   1. Prepare placas de 6 pocillos recubiertas de colágeno disolviendo 5 mg de colágeno cristalizado tipo IV en 5 ml de agua estéril. Incubar durante la noche a 4 °C antes de alícuota y almacenar a -20 °C. Diluir las alícuotas de colágeno IV 1:100 en agua estéril para producir soluciones de 10 μg/ml y añadir 1 ml de soluciones IV de colágeno de 10 μg/ml a cada pocillo de las placas de 6 pocillos. Incubar las placas durante al menos 30 min a 37 °C. Las placas se pueden almacenar a 37 °C durante un máximo de 1 semana.
   2. Preparar una solución madre del factor de crecimiento de fibroblastos humanos 2 (FGF2) disolviendo 500 μg de FGF en 5 ml de PBS de Dulbecco, añadir BSA al 7,5% a una concentración final del 0,1% y alícuota la solución madre en volúmenes de 20-200 μL. Estos pueden almacenarse a -20 °C durante un máximo de 3 meses (Tabla 1). Las soluciones madre pueden almacenarse a 4 °C durante un máximo de 1 mes; Evite los ciclos de congelación-descongelación. Preparar el medio hECSR añadiendo 2 ml de suplemento B-27 y 20 μL de FGF2 en 98 ml de medio hECSR (Tabla 1). El medio hECSR puede almacenarse a 2-8 °C durante un máximo de 2 semanas.
   3. Preparar el medio de congelación para las EPC, las células similares a EECM-BMEC y los SMLC agregando 15 ml de suero bovino fetal, 5 ml de DMSO y 25 μL de solución inhibidora de ROCK a 30 ml de medio hECSR (Tabla 1). El medio de congelación puede almacenarse a 2-8 °C durante un máximo de 2 semanas.
2. Siembra de EPC para cultivo de células endoteliales extendidas
   1. Retire la solución de colágeno de las placas de 6 pocillos. Luego, transfiera 1.0-2.0 x 10 5 EPC CD31⁺ purificadas en 2 ml de medio hECSR que contenga⁵ μM inhibidor de ROCK (dilución 1:2,000). Colocar la placa en una incubadora (37 °C, 5%_CO2). Distribuya uniformemente las celdas deslizando suavemente las placas hacia adelante y hacia atrás, luego de lado a lado.
   2. Al día siguiente, retire el medio hECSR que contiene inhibidor de ROCK y agregue 2 ml de medio hECSR fresco sin inhibidor de ROCK. Intercambie el medio hECSR cada dos días hasta alcanzar el 100% de confluencia.
      NOTA: Si no se puede mantener un horario regular de alimentación durante un fin de semana, el medio se puede reemplazar en la noche del último día hábil de la semana y nuevamente temprano en la mañana después del fin de semana.
3. Paso selectivo para purificar células tipo EECM-BMEC y SMLCs
   1. Retire el medio hECSR de las placas de 6 pocillos que contienen una mezcla de poblaciones de CE y no CE. Agregue 1 ml de reactivo de disociación a cada pocillo.
   2. Controle cuidadosamente la morfología celular bajo un microscopio. Cuando los EC (pero no los no EC) aparezcan brillantes y redondos (generalmente dentro de 2-5 minutos), sepáralos golpeando el borde de la placa. La mayoría de los no CE permanecen unidos a la placa.
   3. Recoger los CE desprendidos utilizando una micropipeta, teniendo cuidado de evitar la resuspensión de los no CE. Transfiera los CE a un tubo de centrífuga de 15 ml o 50 ml que contenga 4 ml de DMEM/F12-10 por 1 ml de reactivo de disociación.
   4. Agregue 2 ml de medio hECSR a los pocillos que contienen los restantes no CE conectados para establecer SMLC. Coloque la placa en la incubadora.
   5. Pipetear la suspensión EC en el tubo de centrífuga para mezclar bien y reservar 10 μL de la suspensión para el recuento celular. Centrifugar las células restantes durante 5 min a 200 x g a 20-25 °C. Retire el sobrenadante del pellet y agregue 2 ml de medio hECSR por 1.0-2.0 x 10⁵ ECs.
   6. Al retirar la solución de colágeno IV de una nueva placa de 6 pocillos, añadir 2 ml de suspensión EC a cada pocillo, seguido de la incubación a 37 °C con 5% de_CO2. Para distribuir uniformemente las células en la placa, muévala suavemente hacia adelante y hacia atrás y de lado a lado en el estante de la incubadora.
   7. Reemplace el medio hECSR cada dos días hasta que los CE alcancen el 100% de confluencia.
   8. Repita los pasos 2.3.1-2.3.7 hasta obtener una monocapa EC pura. Si no se pueden llevar a cabo los siguientes pasos, congele los CE CD31⁺ (consulte el paso 2.4.2). Para analizar las funciones de EC, continúe con el paso 3.
      NOTA: En general, se necesitan dos o tres pasajes selectivos para obtener cultivos casi puros de CE que sean adecuados para análisis funcionales, y consideramos estas células como células similares a EECM-BMEC. Después de más de cinco o seis pasajes, la proliferación celular generalmente disminuye, aunque esta variable depende de la línea hiPSC.
   9. Para cultivar SMLC, reemplace el medio hECSR cada dos días. Para recolectar el medio acondicionado (CM) SMLC, pase el medio recolectado a través de un filtro de 0.22 μm en cada cambio de medio. El CM se puede utilizar para regular al alza la expresión de VCAM-1 de células similares a EECM-BMEC. Agrupe el SMLC-CM hasta que los SMLC alcancen el 100% de confluencia.
4. EPC, EECM-BMEC-like cell y SMLC cryopreservation and thawing
   1. Para congelar EPC, después del lavado MACS final (paso 1.4.13), resuspenda los EPC en medio de congelación en lugar de medio hECSR a una densidad de 1.0-2.0 x 10⁶ células/ml. Distribuir 1 ml de la suspensión celular en criotubos. Coloque los criotubos en un dispositivo de congelación de velocidad controlada y transfiéralos rápidamente a -80 °C. Para el almacenamiento a largo plazo, mueva los tubos a un tanque de nitrógeno líquido de 24 a 48 h después de la congelación.
   2. Para congelar células tipo EECM-BMEC y SMLC, después de retirar el medio de los pocillos, agregue reactivo de disociación (1 ml / pocillo) e incube la placa a 37 ° C con 5% de_CO2 hasta que las células se desprendan (5-7 min y 20-30 min para células tipo EECM-BMEC y SMLC, respectivamente). Recoja las células en un tubo de centrífuga de 15 ml o 50 ml que contenga 4 ml de DMEM/F12-10 por 1 ml de reactivo de disociación.
   3. Pipetear bien para mezclar y reservar 10 μL de la suspensión celular para el recuento celular. Granular las células centrifugando a 200 x g durante 5 min a 20-25 °C. Retire el sobrenadante y resuspenda completamente las células en medio de congelación a una densidad de 1.0-2.0 x 10⁶ células/ml. Distribuir 1 ml de la suspensión celular en criotubos frescos.
   4. Coloque los criotubos en un dispositivo de congelación de velocidad controlada y transfiéralos inmediatamente a -80 °C. Para el almacenamiento a largo plazo, los tubos se pueden transferir a un tanque de nitrógeno líquido de 24 a 48 h después de la congelación.
   5. Para descongelar EPC, células similares a EECM-BMEC y SMLC, enrolle viales de criotubos entre las manos o incube en un baño de agua a 37 °C hasta que las células estén casi completamente descongeladas. Añadir 500 μL de DMEM/F12-10 y transferir suavemente la suspensión celular a un tubo de 15 ml que contenga 4 ml de medio DMEM/F12-10. Lave el criotubo una vez añadiendo 1 ml de DMEM/F12-10 y luego centrifugar las células a 200 x g durante 5 min a 20-25 °C.
   6. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 2 ml de medio hECSR que contenga 5 μM inhibidor de ROCK (dilución 1:2.000) a una densidad de 1,0-2,0 x 10 5 células por 2 ml para EPC, y 2,0-3,0 x 10⁵ células por 2 ml para células tipo EECM-BMEC y SMLC. Distribuya la suspensión celular entre los pocillos de las placas de 6 pocillos recubiertas de colágeno después de aspirar la solución de colágeno.
   7. Mover suavemente las placas hacia adelante y hacia atrás, luego de lado a lado, en el estante de una incubadora a 37 °C, 5 % de_CO2 para distribuir uniformemente las células en los pocillos.
   8. Al día siguiente, cambie el medio con un medio hECSR fresco que carezca de inhibidor de ROCK. Intercambie el medio hECSR cada dos días hasta lograr una confluencia del 100%. A continuación, proceda al paso selectivo para EPC (ver paso 2.3) y análisis funcionales para células similares a EECM-BMEC (ver paso 3). Antes de realizar la caracterización molecular y los ensayos funcionales, las células similares a EECM-BMEC deben ser 100% confluentes, lo que generalmente se logra 2-3 días después de la descongelación.

3. Validación de células tipo EECM-BMEC y SMLC

1. Ensayo de permeabilidad para trazadores de moléculas pequeñas
   1. Evaluar la integridad de la barrera celular similar a EECM-BMEC midiendo la permeabilidad a la fluoresceína de sodio, como lo describen Nishihara et ^al.26. Sembrar las células similares a EECM-BMEC en insertos de filtro para desarrollar monocapas completas y medir la permeabilidad de la fluoresceína de sodio.
2. Tinción por inmunofluorescencia para evaluar moléculas clave.
   1. Para la tinción de inmunofluorescencia para monitorear la expresión de moléculas de unión, moléculas de adhesión o proteínas citoesqueléticas de células similares a EECM-BMEC en monocapas o de SMLC, use portaobjetos de cámara, placas de 96 pocillos o membranas con filtros de inserción. Evaluar la expresión celular tipo EECM-BMEC de moléculas de adhesión a la superficie celular con o sin estimulación de citoquinas inflamatorias, según lo descrito por Nishihara et ^al.26.
3. Citometría de flujo para analizar la expresión de moléculas de adhesión a la superficie celular en células tipo EECM-BMEC
   1. Utilizar la citometría de flujo para evaluar la expresión semicuantitativa de moléculas de adhesión a la superficie celular implicadas en la migración de células inmunes al SNC, incluyendo ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1, P-selectina, E-selectina, CD99 y molécula de adhesión de células endoteliales plaquetarias-1 (PECAM-1), según lo descrito por Nishihara et ^al.26. Cultivar las células similares a EECM-BMEC con medio acondicionado por SMLC en presencia y ausencia de citoquinas inflamatorias durante 16-18 h.
4. Ensayo de adhesión de células inmunes en condiciones estáticas para evaluar la expresión de moléculas de adhesión funcional
   1. Utilice el método descrito por Nishihara et ^al.26 para determinar si las moléculas de adhesión a la superficie celular de las células similares a EECM-BMEC son funcionales.
   2. Brevemente, siembre las células similares a EECM-BMEC en un portaobjetos de cámara a 5.5 x 10⁴ / cm² y crezca hasta la confluencia. Aproximadamente 24 h más tarde, cambie el medio de cultivo a medio acondicionado por SMLC en presencia o ausencia de citoquinas proinflamatorias, e incube las células similares a EECM-BMEC durante 16 h adicionales.
   3. El día del experimento, descongele las células inmunitarias criopreservadas (por ejemplo, células T o células mononucleares de sangre periférica [PBMC]) con tampón de lavado de células T (Tabla 1) y etiquete con tintes fluorescentes (por ejemplo, colorantes de seguimiento celular) en medio de células T (Tabla 1). La optimización del medio de cultivo para las células inmunes debe adaptarse al tipo específico de células inmunes que se están estudiando.
   4. En un portaobjetos de cámara de 16 pocillos, agregue 2 x 10⁴ células Th1 a las células similares a EECM-BMEC. Específicamente, cuando se trabaja con células T efectoras como las células Th1, se ha observado que exhiben una mayor unión a las células similares a EECM-BMEC en comparación con las PBMC (Nishihara. et al. [2022]). En consecuencia, el número de PBMC que se agregarán a las células similares a EECM-BMEC debe ser mayor en comparación con las células T efectoras puras.
   5. Incubar las células inmunes con la monocapa de células tipo EECM-BMEC durante 30 min en medio de ensayo de migración (Tabla 1). Después de 30 minutos, lavar suavemente el portaobjetos, sumergiéndolo dos veces en un frasco que contenga PBS de Dulbecco y posteriormente fijar con solución de glutaraldehído al 2,5% a 4 °C durante 2 h.
   6. Después de la fijación, lave la diapositiva dos veces sumergiéndola en un frasco que contenga PBS de Dulbecco y móntela con un cubreobjetos. Posteriormente, adquiera imágenes de microscopía de fluorescencia del centro de la monocapa en los portaobjetos para contar las células inmunes unidas a monocapas celulares similares a EECM-BMEC.

Results

Ensayo de permeabilidad
La permeabilidad de la fluoresceína de sodio se calculó midiendo la intensidad de fluorescencia del medio recogido de la cámara inferior a los 15, 30, 45 y 60 min. Se muestrea un total de 150 μL de medio en cada punto de tiempo y el volumen faltante de 150 μL se reemplaza con medio hECSR. la intensidad de fluorescencia se lee utilizando un lector de placas fluorescentes (excitación de 485 nm/emisión de 530 nm) y las señales, volúmenes de separación y permeabilidades correctos se calculan utilizando una fórmula¹⁸ descrita anteriormente (Tabla 2). Se recomienda confirmar si la intensidad de fluorescencia de la fluoresceína de sodio aumenta con el tiempo. Se deben usar múltiples filtros, al menos triplicados, para un ensayo para garantizar la reproducibilidad. Para células sanas derivadas de EECM-BMEC, la permeabilidad a la fluoresceína de sodio (376 Da) debe ser inferior a 0,3 x ^10-3 cm/min. Para confirmar la formación de una monocapa celular confluente similar a EECM-BMEC, la tinción de inmunofluorescencia para las proteínas de unión de las células similares a EECM-BMEC de cada filtro utilizado en los ensayos de permeabilidad debe realizarse después de este ensayo.

Tinción por inmunofluorescencia
La tinción por inmunofluorescencia de moléculas de unión celular similares a EECM-BMEC, incluyendo claudina-5, ocludina y VE-cadherina¹, se utilizó para evaluar la morfología celular y la presencia de uniones continuas y maduras (Figura 4). Las monocapas de células tipo EECM-BMEC en las membranas de los insertos filtrantes se fijaron con metanol frío (-20 °C) durante 20 s, se bloquearon con tampón de bloqueo (Tabla 1) y luego se incubaron con anticuerpos primarios y secundarios. Las células similares a EECM-BMEC exhibieron formas de huso y uniones en forma de zigzag, las cuales son rasgos morfológicos característicos de BMECs²⁷. La estimulación de las células similares a EECM-BMEC sembradas en portaobjetos de cámara con citoquinas proinflamatorias, como el factor de necrosis tumoral α (TNF-α) y el interferón-γ (INF-γ) (0,1 ng/mL TNF-α + 2 UI/mL IFN-γ) diluido en medio condicionado derivado de SMLC, reguló al alza la expresión de moléculas de adhesión, como ICAM-1 y VCAM-1²⁸ (Figura 5). En la Figura 6 se muestran imágenes representativas de marcadores de células musculares lisas, incluyendo actina de músculo liso α (AME), calponina y proteína del músculo liso 22-alfa (SM22a)²⁹. Los SMLC sembrados en el portaobjetos de la cámara se fijaron con paraformaldehído al 4% durante 10 min, se bloquearon con tampón de bloqueo y luego se incubaron con anticuerpos primarios y secundarios.

Análisis por citometría de flujo de la expresión de moléculas de adhesión a la superficie celular por células similares a EECM-BMEC
Los resultados representativos para la expresión de la superficie celular de moléculas de adhesión endotelial en células similares a EECM-BMEC se muestran en la Figura 7. La estimulación con citoquinas proinflamatorias, como TNF-α e INF-γ, reguló al alza la expresión de la superficie celular de varias moléculas de adhesión, incluyendo ICAM-1, VCAM-1 y P-selectina. El cultivo de células similares a EECM-BMEC con medio condicionado por SMLC mejoró la expresión de la superficie celular endotelial VCAM-1. El efecto de la inducción de la expresión de la superficie celular VCAM-1 puede variar entre lotes de medio acondicionado por SMLC. Se recomienda almacenar varios lotes de medio acondicionado cosechado de SMLC, derivados de la misma fuente hiPSC, al diferenciar SMLC, para verificar qué lote induce la expresión adecuada de VCAM-1.

Ensayo de adhesión de células inmunitarias en condiciones estáticas
El número de células inmunes unidas se correlacionó con el nivel de expresión de moléculas de adhesión funcional en la superficie de células similares a EECM-BMEC. La estimulación con citoquinas inflamatorias reguló al alza la expresión de moléculas de adhesión endotelial y promovió el aumento del número de células inmunes que se adhirieron a monocapas celulares similares a EECM-BMEC (Figura 8). El experimento actual demostró la funcionalidad de las moléculas de adhesión en células similares a EECM-BMEC, lo que hace que este modelo sea adecuado para estudiar las interacciones entre células inmunes y EC.

Figura 2: Purificación de CD31⁺ ECs. Diagramas de puntos de datos representativos de citometría de flujo de la activación por dispersión de CE y tinción CD31 marcada con FITC de poblaciones celulares antes (paso 1.4.7) y después (paso 1.4.14) MACS. MACS mejora la pureza de CD31⁺ EPCs en la población. Abreviaturas: SSC = dispersión lateral; FSC = dispersión hacia adelante; FITC = isotiocianato de fluoresceína; MACS = clasificación magnética de células activadas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Permeabilidad monocapa EECM-BMEC (^10-3 cm/min) calculada a partir de la intensidad de fluorescencia bruta de la fluoresceína de sodio. La pendiente lineal del volumen libre se calcula mediante regresión lineal para cada filtro (Figura 3A). La permeabilidad de la fluoresceína sódica se calcula utilizando dos fórmulas (Figura 3B). (A) La pendiente lineal del volumen de holgura frente al tiempo se calculó utilizando regresión lineal para el filtro 1 (m_c1) y el filtro en blanco (m_f). Los m c1 y m f son coeficientes de X_c1 y X_f, respectivamente. (B) Fórmula para calcular la permeabilidad a la fluoresceína (Pe) utilizando m_c y m_f (Fórmula 1). Las unidades de PE se convirtieron utilizando el área de superficie de un filtro (Fórmula 2). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Las células similares a EECM-BMEC muestran uniones celulares maduras. Tinción de inmunofluorescencia para claudina-5, ocludina o VE-cadherina (rojo) en células similares a EECM-BMEC cultivadas en membranas de filtros de inserto. Los núcleos se tiñeron con 4′,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (azul). La tinción se realizó en los mismos insertos de filtro utilizados para los ensayos de permeabilidad. Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Expresión de moléculas de adhesión endotelial por células tipo EECM-BMEC. La tinción por inmunofluorescencia se realizó en células similares a EECM-BMEC cultivadas en membranas de insertos filtrantes en presencia de CM derivado de SMLC. Se muestra inmunotinción para ICAM-1 o VCAM-1 (rojo) para células no estimuladas y 1 ng / ml TNF-α + 20 UI / ml de IFN- γ estimuladas con EECM-BMEC. Los núcleos fueron teñidos con DAPI (azul). Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Caracterización de SMLCs. Se muestra la inmunocitoquímica de la actina del músculo liso α (SMA), la calponina o la proteína del músculo liso 22-alfa (SM22a) (rojo) para los SMLC cultivados en portaobjetos de cámara. Los núcleos fueron teñidos con DAPI (azul). Barra de escala = 50 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Expresión de la superficie celular endotelial de moléculas de adhesión en células tipo EECM-BMEC. Se muestran los resultados del análisis por citometría de flujo de la expresión de la molécula de adhesión superficial EC en células similares a EECM-BMEC. Las células similares a EECM-BMEC se cultivaron utilizando un medio condicionado derivado de SMLC. Las líneas azules, rojas y grises de las superposiciones del histograma muestran la condición no estimulada (NS), 1 ng/mL TNF-α + 20 UI/mL condición estimulada por IFN-γ y control del isotipo, respectivamente. Se evaluó la expresión de la superficie celular de las moléculas de adhesión endotelial, incluida la molécula de adhesión intercelular 1 (ICAM-1), ICAM-2, la molécula de adhesión celular vascular 1 (VCAM-1), P-selectina, E-selectina, CD99 y la molécula de adhesión de células endoteliales plaquetarias-1 (PECAM-1). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Adhesión de células inmunes en células similares a EECM-BMEC. (A) Imágenes de células inmunes adherentes marcadas con fluorescencia en monocapas celulares no estimuladas (NS) y 0.1 ng / ml TNF-α + 2 UI / ml estimuladas por IFN-γ (TNF-α + IFN-γ) similares a EECM-BMEC. Las imágenes corresponden a los centros de los pozos. Barra de escala = 50 μm. (B) El número de células inmunes marcadas con fluorescencia en monocapas de NS y TNF-α + células similares a EECM-BMEC estimuladas por IFN-γ. Las células inmunes adherentes/campos de visión (HOV) se contaron automáticamente utilizando el software FIJI. Los puntos representan el número de células T adjuntas. Las barras muestran el valor medio y las barras de error muestran la desviación estándar (DE) de ocho ensayos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Detalles de reactivos específicos para los ensayos. Se describe el nombre y la cantidad exacta de ingredientes para cada reactivo específico. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Tabla 2: Ejemplo de datos brutos del lector de placas de fluorescencia para el cálculo de PE. Los números en negrita son la intensidad de fluorescencia bruta de la fluoresceína de sodio medida por un lector de placas. Para analizar con precisión los datos, es necesario eliminar la señal de fondo de los valores brutos y tener en cuenta cualquier pérdida de señal resultante del muestreo de la cámara inferior, y posteriormente corregir la señal. Por ejemplo, después de restar el fondo, la muestra de 15 minutos exhibe una señal de 100 unidades de fluorescencia relativa (RFU), y la muestra de 30 minutos exhibe una señal de 150 RFU. La señal corregida a los 30 min es (150 RFU + los valores faltantes a los 15 min [100 RFU x 150 μL/1.500 μL]), que es 150 RFU + 10 RFU = 160 RFU. El volumen de separación = (1.500 x [S B,t])/(S T,60 min), donde 1.500 es el volumen de la cámara inferior (1.500 μL), S B,t es la señal corregida en el tiempo t, y S_T,60 min es la señal de la cámara superior a los _{60 min}. Haga clic aquí para descargar esta tabla.

Discussion

Puntos críticos y solución de problemas
Antes de comenzar la diferenciación EPC, los investigadores deben asegurarse de que no se hayan producido eventos espontáneos de diferenciación celular en los cultivos hiPSC. La ausencia de células espontáneamente diferenciadas y el uso de colonias puras de hiPSC es fundamental para obtener resultados reproducibles. La densidad de siembra de hiPSC en el Día -3 es importante para obtener una alta pureza de CD31⁺ EPCs después de MACS. La densidad de siembra para cada línea hiPSC y cada pasaje puede requerir optimización. Dependiendo de la línea hiPSC y el número de paso, la densidad de siembra puede oscilar entre 75 x 10 3 a 400 x 10 3 hiPSCs por pocillo de una placa de 12 pocillos (20-100 x 10 ³/cm²). El punto de control de densidad mínima de las hiPSC es la densidad celular del día 2. Las hiPSC deben alcanzar el 100% de confluencia a más tardar el día 2. Si las hiPSC no son confluentes para el día 2, la pureza de las EPC CD31⁺ después de MACS generalmente será bastante baja. En este caso, se puede aumentar la densidad de siembra de hiPSC. Si un gran número de células diferenciadoras se desprenden de la placa alrededor del Día 3 al Día 5, la densidad inicial de siembra de hiPSC puede disminuir. El CHIR99021 de 7-8 μM en nuestra experiencia es la concentración óptima para las líneas de hiPSCs utilizadas aquí, pero la concentración puede necesitar ser optimizada para otras líneas de hiPSC que pueden responder de manera diferente al tratamiento con inhibidores. La pureza de los EPC CD31⁺ debe confirmarse antes y después del MACS. Antes de continuar con MACS, la mezcla celular preclasificada debe ser >10% de células CD31⁺. Los porcentajes de células CD31⁺ del <6% suelen dar como resultado EPC del <80% después de MACS. La optimización de la densidad de siembra inicial y / o la concentración de CHIR99021 es necesaria en esta situación.

Para un paso selectivo exitoso y la generación de monocapas EC puras, la pureza post-MACS de los EPC CD31 ⁺ es crítica. Si la pureza después de MACS es <90%, se recomiendan uno o dos lavados adicionales (pasos 1.4.11-1.4.12). Idealmente, la pureza post-MACS debería ser >95%. La densidad de siembra EPC en placas recubiertas de colágeno debe optimizarse de acuerdo con la línea hiPSC para lograr una confluencia del 100% en 3-7 días. Esperar hasta que los CE sean 100% confluentes generalmente conducirá a un paso selectivo exitoso. Sin embargo, incluso para CE 100% confluentes, los SMLC de algunas líneas hiPSC también se separan temprano. En este caso, el paso selectivo en confluencia más baja (por ejemplo, ≤80%) puede ser efectivo. Si algunos SMLC se separan antes que los EC, los CE a menudo no pueden ser rescatados de la población mixta EC-SMLC. En este caso, puede ser útil acortar el tiempo de activación del reactivo de disociación en los CE de paso y el paso selectivo repetitivo. El uso de un reactivo de disociación comercial en lugar de tripsina como reactivo de disociación es beneficioso para el paso selectivo, ya que la tripsina no permite el desprendimiento separado de CE y SMLC. Nuestros ensayos de permeabilidad utilizando trazadores de moléculas pequeñas y pruebas de unión estrecha y niveles de expresión de moléculas de adhesión indican que las EPC, las células similares a EECM-BMEC y las SMLC pueden almacenarse en nitrógeno líquido durante al menos 2 años.

Significado y limitaciones del método
El método diferencia las EPC CD31⁺ de las hiPSCs mediante el uso de inhibidores químicos de GSK-3 para activar la señalización Wnt/β-catenina. Después de la selección positiva de EPC CD31⁺ por MACS, las EPC se cultivan en un medio endotelial definido que promueve la diferenciación en poblaciones endoteliales mixtas y SMLC. El paso selectivo de estas poblaciones mixtas con diferentes propiedades adhesivas permite la separación de los CE de los SMLC. Después de uno o dos pasajes, las células similares a EECM-BMEC exhiben propiedades de barrera y la expresión de moléculas de adhesión endotelial que recapitulan las de los BMEC humanos primarios. El cocultivo con SMLC o sus sobrenadantes induce la expresión inducida por citoquinas de VCAM-1.

In vivo, la BHE mantiene la homeostasis del SNC estableciendo una baja permeabilidad paracelular y transcelular de las moléculas, a través del transporte de nutrientes a través de transportadores específicos y el control del tráfico de células inmunes hacia el SNC. Para los estudios de la BBB, es esencial un modelo adecuado que muestre las respectivas moléculas y funciones de interés. La producción de células similares a EECM-BMEC utilizando reactivos definidos y muestras de pacientes o sujetos sanos proporciona un modelo BBB humano escalable. Las ventajas de un modelo que utiliza células similares a EECM-BMEC sobre otros modelos de BBB son: 1) una morfología y un perfil de transcriptoma endotelial³⁰ que se asemeja al de los BMEC humanos primarios; 2) la presencia de uniones estrechas maduras; 3) propiedades de barrera deseables; y 4) la expresión robusta de moléculas de adhesión endotelial, incluyendo ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1, E- y P-selectina, CD99, molécula de adhesión celular melanoma (MCAM) y molécula de adhesión de células leucocitarias activadas (ALCAM)²². Por lo tanto, este modelo es particularmente útil para estudiar las interacciones entre las células inmunes y los BMEC. Aunque la permeabilidad de los trazadores de moléculas pequeñas es mayor para las células similares a EECM-BMEC que la reportada previamente para las células similares a BMEC derivadas de iPSC^14,15, las propiedades de barrera se comparan bastante bien con las descritas para los BMEC humanos primarios. Esta similitud indica que es probable que las células similares a EECM-BMEC sean un buen modelo in vitro de la BBB. La expresión de E-selectina en células similares a EECM-BMEC en condiciones fisiológicas debe tenerse en cuenta al utilizar este modelo para estudiar BBBs no inflamadas que carecen de expresión constitutiva de E-selectina in vivo³¹. En nuestro estudio anterior, demostramos que las células similares a EECM-BMEC podrían fenocopiar la barrera hematoencefálica, como se observó en los cerebros de pacientes con EM con respecto a las uniones estrechas interrumpidas. Esto resulta en una mayor permeabilidad de moléculas pequeñas y una mayor expresión de la molécula de adhesión funcional, mediando el aumento de la adhesión y la transmigración de las células inmunes a través de las células similares al BMEC³². Además, demostramos que la activación de la señalización Wnt/β-catenina puede mejorar la interrupción de las uniones estrechas y el aumento de la expresión de VCAM-1 en células similares a EECM-BMEC derivadas de MS³². Estos resultados indican que el modelo es realmente útil para estudiar el papel de la BHE en enfermedades neuroinmunológicas, como la EM.

En conjunto, las células tipo EECM-BMEC son una herramienta prometedora para la comprensión profunda de los mecanismos fisiopatológicos a nivel de la BHE y como una herramienta para desarrollar nuevos objetivos terapéuticos para la estabilización de la BHE. En el futuro, el modelo se puede aplicar para estudiar la disfunción de la BHE en un espectro más amplio de enfermedades y podría abrir vías para nuevos enfoques terapéuticos.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,22 mm Filtro de jeringa	TPP	99722
15 mL Tubo de centrífuga	Falcon	352196
40 μ m Filtro de células Falcon		Falcon 352340
5 mL Tubo de fondo redondo	SPL	40005
50 mL Tubo de centrífuga	Falcon	352070
Placa de 96 pocillos, fondo redondo	SPL	34096
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964-500ml
Ácido acético	Sigma-Aldrich	695092
avanzado DMEM/F12	Life Technologies	12634
	Keyence	BZ-X810
B-27 Suplemento (503), sin suero	Thermo Fischer Scientific	17504044
Albúmina sérica bovina (BSA), 7,5% en dPBS	Sigma-Aldrich	A8412
Tampón de dilución CellAdhere	STEMCELL Technologies	ST-07183
CellTracker Green CMFDA Dye	Invitrogen	C7025
Portaobjetos de cámara	Thermo Fischer Scientific	178599
CHIR99021	Selleck Chemicals	S1263
Colágeno IV de placenta humana	Sigma-Aldrich	C5533
Placas de cultivo de tejidos Corning (12 pocillos)	Corning	3512
Placas de cultivo de tejidos Corning (6 pocillos)	Corning	3506
Cryo tube innercap 2.0 mL	Watson	1396-201S
Dimetilsulfóxido (DMSO), estéril	Sigma-Aldrich	D2650
DMEM (13), [+] 4.5 g/L D-glucosa, [-] L-glutamina, [-] piruvato	Thermo Fischer Scientific	31053-028
Dulbecco' s (d) PBS (sin calcio, magnesio)	Thermo Fisher	14190250
Dulbecco' Águila modificada' s mezcla de medio/nutriente F-12 (DMEM-F12)	Thermo Fischer Scientific	11320074
EasySepFITC Kit de Selección Positiva II	STEMCELL Technologies	18558
EasySepMagnet	Stemcell Technologies	18000
Solución de ácido etilendiaminotetraacético0.02% en DPBS	Sigma	E8008-100ML
Suero fetal bovino, calificado	Thermo Fischer Scientific	10270106
Fibronectina de plasma bovino	Sigma-Aldrich	F1141
Ficoll-Paque PLUS	Sigma-Aldrich	GE17144002
software FIJI (Versión 2.0.0)	Imagen J, EE. UU
FlowJo versión10	BD
Fluoresceína sal sódica	Sigma-Aldrich	F6377
GlutaMAX Suplemento	Thermo Fischer Scientific	35050-061
Solución de glutaraldehído	Sigma-Aldrich	G6257
HCL	Sigma-Aldrich	H1758
Solución tampón HEPES	Thermo Fischer Scientific	15630-056
Suero endotelial humano medio libre (hESFM)	Thermo Fischer Scientific	11111-044
Factor de crecimiento de fibroblastos humanos 2 (FGF2)	Tocris	233-FB-500
iPS células madre pluripotentes inducidas humanas	Riken RBC
Sulfato de kanamicina (100x)	Thermo Fischer Scientific	15160-047
L-Ácido ascórbico 2-fosfato sesquimagnesio sal hidrato	Sigma-Aldrich	A8960-5G
L-Glutamina 200 mM (1003)	Thermo Fischer Scientific	25030-024
Matrigel, factor de crecimiento reducido	Corning	354230
MEM NEAA (1003)	Thermo Fischer Scientific	11140-035
Metanol	Sigma-Aldrich	32213
Mowiol	Sigma-Aldrich	81381
mTeSR Plus-cGMP	STEMCELL Technologies	ST-100-0276
mTeSR1 kit completo (medio basal más 53 suplemento)	STEMCELL Technologies	85850
	NaCl Sigma-Aldrich	71376
Paraformaldehído	Millipore 104005
Pen Strep Thermo	Fischer Scientific	15140-122
Proteína IFN-gamma humana recombinante	R& D Systems	285-IF-100
IL-2 Humana Recombinante	BD Biosciences	554603
Proteína TNF-alfa humana recombinante	R& D Systems	210-TA-020
Inhibidor de ROCK Y-27632	Tocris	1254
RPMI medio 1640	Thermo Fischer Scientific	21875-034
Bisturí	FEATHER	2975-11
Leche desnatada	BD Biosciences	232100
Azida de sodio (NaN3)	Sigma-Aldrich	71290
Sodio piruvato	Thermo Fischer Scientific	11360-039
Transwells, Membrana de PC, 0,4 mm, 12 mm, tratada con TC	Base Corning	3401
Tris	Sigma-Aldrich	93362
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100
Vitronectina XF	STEMCELL Technologies	078180
Agua, estéril, cultivo	celularSigma-Aldrich	W3500