Aislamiento, cultivo y caracterización de fibroblastos dérmicos primarios a partir de tejido queloide humano

Resumen

Este estudio describe un protocolo optimizado para establecer fibroblastos primarios a partir de tejidos queloides que puedan proporcionar fibroblastos puros y viables de manera efectiva y constante.

Resumen

Los fibroblastos, el principal tipo de célula en el tejido queloide, juegan un papel esencial en la formación y desarrollo de los queloides. El aislamiento y cultivo de fibroblastos primarios derivados del tejido queloide son la base para futuros estudios de la función biológica y los mecanismos moleculares de los queloides, así como nuevas estrategias terapéuticas para su tratamiento. El método tradicional de obtención de fibroblastos primarios tiene limitaciones, como el mal estado celular, la mezcla con otros tipos de células y la susceptibilidad a la contaminación. En este trabajo se describe un protocolo optimizado y fácilmente reproducible que podría reducir la aparición de posibles problemas a la hora de obtener fibroblastos. En este protocolo, los fibroblastos se pueden observar 5 días después del aislamiento y alcanzan casi el 80% de confluencia después de 10 días de cultivo. A continuación, los fibroblastos se hacen pasar y se verifican utilizando anticuerpos PDGFRα y vimentina para ensayos de inmunofluorescencia y anticuerpos CD90 para citometría de flujo. En conclusión, los fibroblastos del tejido queloide se pueden adquirir fácilmente a través de este protocolo, lo que puede proporcionar una fuente abundante y estable de células en el laboratorio para la investigación de queloides.

Introducción

El queloide, una enfermedad fibroproliferativa, se manifiesta como el crecimiento continuo de placas que a menudo invaden la piel normal circundante sin autolimitación y causan diversos grados de picazón, dolor y cargas cosméticas y psicológicas para los pacientes¹. Los fibroblastos, las principales células implicadas en los queloides, desempeñan un papel esencial en la formación y desarrollo de esta enfermedad a través de la proliferación excesiva, la producción redundante de matriz extracelular y el desorden de los colágenos ^2,3. Sin embargo, la patogenia subyacente sigue sin estar cl....

Protocolo

Este estudio fue aprobado por la junta de revisión institucional del Hospital de Dermatología de la Universidad Médica del Sur (2020081). Se obtuvo el consentimiento informado del paciente antes de que se recolectaran tejidos de los individuos.

1. Preparación

NOTA: Los siguientes procedimientos deben realizarse en un ambiente estéril bajo una cabina de seguridad biológica.

1. Prepare un medio de cultivo completo añadiendo suero fetal bovino (FBS) al 10 % y solución de penicilina, estreptomicina y anfotericina B (PSA) al medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) con alto contenido de glucos....

Resultados

La cronología del protocolo se resume en la Figura 1A. En la Figura 2 se muestran algunas imágenes representativas del proceso de aislamiento; las capas de epidermis y adiposa se eliminaron cuidadosamente, y la capa de dermis se separó en pequeños fragmentos de 3-4^mm2, que se inocularon en las placas de Petri.

Como se muestra en la Figura 3A, se observaron varias excrecencias de fibroblasto.......

Discusión

La obtención de fibroblastos primarios a partir de tejidos queloides es una base fundamental para futuras investigaciones. Hasta el momento, existen dos métodos para la adquisición de fibroblastos primarios: la digestión enzimática y el cultivo de explantes^11,12,13,14. Sin embargo, ambos métodos tradicionales tienen limitaciones, como la susceptibilidad a la contaminación, la mezcla con otros t.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Tubo de centrífuga estéril de 1,5 mL	JETBIOFIL	CFT002015
tubo de centrífuga estéril de 15 mL	JETBIOFIL	8076
4% de poliformaldehído	Beyotime Biotechnology	P0099	Fijación celular
tubo de centrífuga estéril de 50 mL	JETBIOFIL	8081	Poner tejido queloide
Alexa Fluor-555 cabra anti-conejo IgG	Abcam	Alexa  Fluor  555 y nbsp;	Segundo anticuerpo para el ensayo de tinción de inmunofluorescencia
Anti humano CD90	BioLegend	B301002	Identificar la pureza de los fibroblastos Diluyente de
anticuerpos	Beyotime Biotechnology	P0262
Cabina de seguridad biológica	Thermo Scientific	1300 serie A2	Células de aislamiento y cultivo
Albúmina sérica bovina	B265993		Bloqueo para el ensayo de tinción de inmunofluorescencia
Incubadora de dióxido de carbono	ESCO	CCL-170B-8	Uso para el cultivo de células
Criotubos celulares	Corning	43513	Almacene las células en la
máquina centrífuga	Thermo Fisher	ST 16R	Descartar sobrenadante
DAPI	Beyotime Biotechnology	C1006	Teñir el núcleo celular
DMSO	MP Biomedicals	196055	Uso para la conservación
de células Medio de águila modificado de Dulbecco	Gibco	C11995500BT	Solución de medio de cultivo
Suero fetal bovino	BI	04-001-1A
Citómetro de flujo	BD	BD FACSCelesta	Observación la identidad de las células
caja congelada	Thermo Scientific	5100-0050
Microscopio invertido	Nikon	ECLIPSE Ts2
Microscopio confocal láser	Nikon	AIR-HD25	Observación del ensayo de tinción de inmunofluorescencia
PDGFR-α anticuerpo	CST	3174T	Primer anticuerpo para el ensayo de tinción de inmunofluorescencia
Solución de penicilina-estreptomicina-Am	Solarbio	P1410	Añadir en la solución del medio de cultivo para evitar la contaminación
placa de Petri	JETBIOFIL	7556	Fibroblastos
de cultivo Solución salina tamponada con fosfato	Gibco	C10010500BT	Solución de medio de cultivo
Conejo (DAIE) mAB IgG XR (R) Control de isotuge (PE)	Tecnología de señalización celular	5742S	Como control para citometría
de flujo Cubreobjetos redondos	Biosharp	801007	Cultivo celular
Triton X 100	Solarbio	T8200	Perforaciones en la membrana celular
Tripsina-EDTA	Gibco	25200072	Se utiliza para el paso de células
Anticuerpo de vimentina	Abcam	ab8978	Primer anticuerpo para el ensayo de tinción de inmunofluorescencia

de baja temperatura