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Microinyección dirigida y electroporación de organoides cerebrales de primates para la modificación genética

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DOI:

10.3791/65176

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24 de marzo de 2023

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1German Primate Center, Leibniz Institute for Primate Research, 2Max Planck Institute of Molecular Cell Biology and Genetics

En este artículo

Resumen

La electroporación de organoides cerebrales de primates proporciona un enfoque preciso y eficiente para introducir modificaciones genéticas transitorias en diferentes tipos de progenitores y neuronas en un sistema modelo cercano al desarrollo (pato)fisiológico del neocórtex de primates. Esto permite el estudio de los procesos evolutivos y del desarrollo neurológico y también se puede aplicar para el modelado de enfermedades.

Resumen

La corteza cerebral es la estructura cerebral más externa y es responsable del procesamiento de la entrada sensorial y la salida motora; Es visto como el asiento de las capacidades cognitivas de orden superior en los mamíferos, en particular, los primates. El estudio de las funciones genéticas en los cerebros de los primates es un desafío debido a razones técnicas y éticas, pero el establecimiento de la tecnología de organoides cerebrales ha permitido el estudio del desarrollo del cerebro en modelos tradicionales de primates (por ejemplo, macaco rhesus y tití común), así como en especies de primates previamente inaccesibles experimentalmente (por ejemplo, grandes simios), en un sistema éticamente justificable y menos exigente técnicamente. Además, los organoides cerebrales humanos permiten la investigación avanzada de trastornos neurológicos y del neurodesarrollo.

A medida que los organoides cerebrales recapitulan muchos procesos del desarrollo cerebral, también representan una herramienta poderosa para identificar diferencias y comparar funcionalmente los determinantes genéticos subyacentes al desarrollo cerebral de varias especies en un contexto evolutivo. Una gran ventaja del uso de organoides es la posibilidad de introducir modificaciones genéticas, lo que permite probar las funciones de los genes. Sin embargo, la introducción de tales modificaciones es laboriosa y costosa. Este documento describe un enfoque rápido y rentable para modificar genéticamente las poblaciones celulares dentro de las estructuras ventriculares de los organoides cerebrales de primates, un subtipo de organoides cerebrales. Este método combina un protocolo modificado para la generación confiable de organoides cerebrales a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) derivadas de titíes humanos, chimpancés, macacos rhesus y comunes con un enfoque de microinyección y electroporación. Esto proporciona una herramienta eficaz para el estudio de los procesos de desarrollo neurológico y evolutivo que también se puede aplicar para el modelado de enfermedades.

Introducción

Investigar el desarrollo (pato)fisiológico y la evolución de la corteza cerebral es una tarea formidable que se ve obstaculizada por la falta de sistemas modelo adecuados. Anteriormente, tales estudios se limitaban a modelos de cultivo celular bidimensionales (como progenitores neurales primarios o cultivos de células neuronales) y modelos animales evolutivamente distantes (como roedores)1,2. Si bien estos modelos son útiles para abordar ciertas preguntas, están limitados para modelar la complejidad, la composición del tipo de célula, la arquitectura celular y los patrones de expresión génica del neocórtex humano en desarrollo en estados sanos y enfermos. Estas limitaciones conducen, por ejemplo, a la escasa traducibilidad de los modelos de ratón de enfermedades humanas a la situación humana, como se describe para ciertos casos de microcefalia (por ejemplo, Zhang et al.3). Recientemente, los primates transgénicos no humanos, que son un modelo evolutivo, funcional y morfológicamente más cercano del desarrollo del neocórtex humano, se han enfocado 4,5,6,7,8 a medida que superan muchas limitaciones de los modelos basados en cultivos celulares y roedores. Sin embargo, el uso de primates no humanos en la investigación no solo es muy costoso y requiere mucho tiempo, sino que también plantea preocupaciones éticas. Más recientemente, el desarrollo de la tecnología de organoides cerebrales 9,10 ha surgido como una alternativa prometedora que resuelve muchas de las limitaciones de los modelos anteriores 11,12,13,14,15,16.

Los organoides cerebrales son estructuras tridimensionales (3D), multicelulares que emulan las características principales de la citoarquitectura y la composición de tipo celular de una o múltiples regiones cerebrales para una ventana de tiempo de desarrollo definida 11,12,13,14,17. Estas estructuras 3D se generan a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) o, si están disponibles para las especies de interés, a partir de células madre embrionarias (ESC). En general, se pueden distinguir dos tipos de organoides cerebrales con base en la metodología utilizada: organoides cerebrales no guiados y regionalizados (guiados)18. Al generar este último tipo de organoides, se proporcionan pequeñas moléculas o factores que guían la diferenciación de las células madre pluripotentes a organoides de una región particular del cerebro (por ejemplo, organoides del cerebro anterior)18. Por el contrario, en los organoides no guiados, la diferenciación no está guiada por la adición de moléculas pequeñas, sino que se basa exclusivamente en la diferenciación espontánea de las iPSCs/ESCs. Los organoides cerebrales resultantes consisten en tipos de células que representan diferentes regiones cerebrales (por ejemplo, organoides cerebrales)18. Los organoides cerebrales combinan muchas características clave del desarrollo cerebral con una generación relativamente rentable y eficiente en el tiempo a partir de cualquier especie de interés para la cual se dispone de iPSC o ESCs11,12,13,14. Esto hace que los organoides cerebrales sean un excelente modelo para muchos tipos de estudios neurobiológicos, que van desde preguntas evolutivas y de desarrollo hasta modelos de enfermedades y pruebas de drogas15,16. Sin embargo, abordar estas preguntas utilizando organoides cerebrales depende en gran medida de la disponibilidad de diferentes métodos para la modificación genética.

Un aspecto clave del estudio del desarrollo (pato)fisiológico del neocórtex y su evolución es el análisis funcional de genes y variantes genéticas. Esto generalmente se logra por expresión (ectópica) y / o por knock-down (KD) o knock-out (KO) de esos genes. Tales modificaciones genéticas pueden clasificarse en modificaciones genéticas estables y transitorias, así como en modificaciones restringidas temporal y espacialmente o no restringidas. La modificación genética estable se define por la introducción de una alteración genética en el genoma del huésped que se transmite a todas las generaciones celulares posteriores. Dependiendo del punto de tiempo de la modificación genética, puede afectar a todas las células de un organoide o puede restringirse a ciertas poblaciones celulares. Con mayor frecuencia, la modificación genética estable se logra en organoides cerebrales a nivel de iPSC / ESC mediante la aplicación de lentivirus, sistemas similares a transposones y la tecnología CRISPR / Cas9 (revisada por, por ejemplo, Fischer et al.17, Kyrousi et al.19 y Teriyapirom et al.20). Esto tiene la ventaja de que todas las células del organoide cerebral llevan la modificación genética y que no está restringida temporal o espacialmente. Sin embargo, la generación y caracterización de estas líneas estables iPSC/ESC lleva mucho tiempo, a menudo toma varios meses hasta que se pueden analizar los primeros organoides cerebrales modificados (revisado por, por ejemplo, Fischer et al.17, Kyrousi et al.19, o Teriyapirom et al.20).

En contraste, la modificación genética transitoria se define por la entrega de carga genética (por ejemplo, un plásmido de expresión génica) que no se integra en el genoma del huésped. Si bien esta modificación puede, en principio, transmitirse a las generaciones celulares posteriores, la carga genética entregada se diluirá progresivamente con cada división celular. Por lo tanto, este tipo de modificación genética suele estar restringida temporal y espacialmente. La modificación genética transitoria puede llevarse a cabo en organoides cerebrales por virus adenoasociados o por electroporación (revisada por, por ejemplo, por Fischer et al.17, Kyrousi et al.19 y Teriyapirom et al.20), siendo este último descrito en detalle en este artículo. En contraste con la modificación genética estable, este enfoque es muy rápido y rentable. De hecho, la electroporación se puede realizar en cuestión de minutos y, dependiendo de la(s) población(es) de células diana, los organoides electroporados están listos para su análisis en cuestión de días (revisados por, por ejemplo, Fischer et al.17 y Kyrousi et al.19). Sin embargo, los cambios morfológicos macroscópicos del organoide cerebral, como las diferencias de tamaño, no se pueden detectar utilizando este método, ya que este tipo de modificación genética está restringida temporal y espacialmente. Esta restricción también puede ser una ventaja, por ejemplo, en el caso de estudiar poblaciones celulares individuales dentro del organoide o los efectos sobre los organoides cerebrales en puntos de tiempo de desarrollo específicos (revisado por, por ejemplo, Fischer et al.17 y Kyrousi et al.19).

Un enfoque clásico para estudiar la función de los genes durante el desarrollo y la evolución del cerebro es la electroporación in utero. La electroporación in utero es una técnica bien conocida y útil para la entrega de construcciones de expresión génica en cerebros de roedores 21,22,23 y hurones24,25. Primero, una solución que contiene la(s) construcción(es) de expresión de interés se microinyecta a través de la pared uterina en un determinado ventrículo del cerebro embrionario, dependiendo de la región a la que se dirija. En el segundo paso, se aplican pulsos eléctricos para transfectar las células que recubren directamente el ventrículo objetivo. Este enfoque no sólo se limita a la expresión ectópica o la sobreexpresión de genes, sino que también puede aplicarse en estudios de KD o KO mediante microinyección de horquilla corta (shRNA) o CRISPR/Cas9 (en forma de plásmidos de expresión o ribonucleoproteínas [RNPs]), respectivamente26,27. Sin embargo, la electroporación in utero de embriones de ratón, rata y hurón tiene las mismas limitaciones que se describieron anteriormente para estos modelos animales.

Idealmente, a uno le gustaría realizar electroporación in utero directamente en primates. Si bien esto es, en principio, técnicamente posible, la electroporación in utero no se lleva a cabo en primates debido a preocupaciones éticas, altos costos de mantenimiento de los animales y pequeños tamaños de camada. Para ciertos primates, como los grandes simios (incluidos los humanos), esto no es posible en absoluto. Sin embargo, estos primates tienen el mayor potencial para el estudio del desarrollo (pato)fisiológico del neocórtex humano y su evolución. Una solución a este dilema es aplicar la técnica de electroporación a organoides cerebrales de primates28.

Este artículo presenta un protocolo para la electroporación de un subtipo de organoides cerebrales de primates, los organoides cerebrales de primates. Este enfoque permite la modificación genética rápida y rentable de las poblaciones celulares dentro de las estructuras similares a ventrículos de los organoides. Específicamente, describimos un protocolo unificado para la generación de organoides cerebrales de primates a partir de iPSC humanas (Homo sapiens), chimpancés (Pan troglodytes), macacos rhesus (Macaca mulatta) y tití común (Callithrix jacchus). Además, describimos la técnica de microinyección y electroporación en detalle y proporcionamos criterios de "ir" y "no ir" para realizar la electroporación de organoides cerebrales de primates. Este enfoque es una herramienta eficaz para estudiar el desarrollo (pato)fisiológico del neocórtex y su evolución en un modelo especialmente cercano a la situación humana.

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Protocolo

1. Cultivo de iPSCs de primates

NOTA: Debido a su robustez, el método presentado aquí se puede aplicar a cualquier línea iPSC de primates. En este artículo, describimos la producción de organoides cerebrales a partir de líneas humanas (iLonza2.2)29, chimpancés (Sandra A)30, macacos rhesus (iRh33.1)29 y tití común (cj_160419_5)31 iPSC. Las condiciones de cultivo se resumen en la Tabla 1. Consulte la Tabla de materiales para obtener detalles relacionados con todos los materiales, reactivos y equipos utilizados en este protocolo.

  1. Para cultivar las iPSC respectivas, siga las condiciones de cultivo descritas originalmente. En general, para la generación exitosa y electroporación de organoides cerebrales, utilice líneas iPSC que no hayan sido cultivadas por más de 90 pasajes. Además, al comienzo de la generación de organoides cerebrales, asegúrese de que las iPSC exhiban características de pluripotencia sin signos de diferenciación.

2. Generación de organoides cerebrales a partir de iPSCs de primates

NOTA: El protocolo para la generación de organoides cerebrales se basa en una versión modificada 28,30,32,33 del protocolo original del organoide cerebral 10,34 con algunas modificaciones específicas de la especie (detalladas a continuación).

  1. Siembra de iPSCs para generar cuerpos embrioides (EBs)
    1. Una vez que las iPSCs hayan alcanzado el 80%-90% de confluencia, lávelas con solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco y agregue 500 μL de sustituto de tripsina recombinante o 1 ml de mezcla proteolítica y colagenolítica.
      NOTA: Típicamente, las iPSCs se cultivan en una placa de cultivo celular de 60 mm para obtener aproximadamente 900.000 células, lo que es suficiente para generar 96 organoides cerebrales. El número de células se puede ajustar dependiendo del número de organoides necesarios. Tenga en cuenta que no todos los organoides cerebrales generados pueden ser adecuados para la electroporación.
    2. Incubar el plato a 37 °C durante 2 min para desprender las células.
      NOTA: Puede ser necesario hasta 2 minutos adicionales de incubación a 37 °C dependiendo de la línea iPSC o enzima utilizada. Se recomienda examinar el plato bajo un microscopio para asegurarse de que las células han comenzado a desprenderse.
    3. Añadir 1,5 ml de medio de cultivo iPSC precalentado (37 °C) para detener la reacción, y pipetear hacia arriba y hacia abajo 7x-10x (no más de 10x) para disociar las células de la placa de cultivo celular y obtener una suspensión unicelular.
    4. Transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga cónica de 15 ml y centrifugar las células a 200 × g durante 5 minutos a temperatura ambiente.
    5. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet en 2 ml de medio de cultivo iPSC suplementado con 50 μM Y27632 o 50 μM pro-survival compound.
    6. Utilice 10 μL de la suspensión celular para contar las células utilizando una cámara Neubauer.
    7. Ajustar la suspensión celular a una concentración de 9.000 células por 150 μL (60.000 células/ml) utilizando medio de cultivo iPSC suplementado con 50 μM Y27632 o 50 μM compuesto pro-supervivencia.
    8. Para generar cuerpos embrioides (EB), siembre 150 μL de la suspensión celular en cada pocillo de una placa de 96 pocillos de unión ultrabaja. Durante el pipeteo, agite suavemente el tubo que contiene la suspensión celular para evitar que las células sedimenten.
    9. Cultivar los EBs en una atmósfera humificada de 5% deCO2 y 95% de aire a 37 °C (0 días después de la siembra [dps]). No perturbe los EB dentro de las primeras 24 h después de la siembra.
      NOTA: Las EB generadas a partir de iPSCs de tití deben cultivarse en una atmósfera humificada en condiciones hipóxicas (5% CO2, 5% O2 y 90%N2) a 37 °C.
    10. Después de ~48 h (2 dps), cambie el medio a medio de cultivo iPSC sin Y27632/compuesto pro-supervivencia. Eliminar 100 μL de medio por pocillo y añadir 150 μL de medio fresco precalentado (37 °C) sin Y27632. Ir fila por fila.
    11. Realizar más cambios medios cada dos días; eliminar 150 μL de medio de cada pocillo y añadir 150 μL de medio fresco precalentado (37 °C) sin Y27632/compuesto prosupervivencia por pocillo.
      NOTA: Después de 4-5 dps, la periferia de los EB debe volverse translúcida.
  2. Inducción del neuroectodermo
    NOTA: En general, los EB de buena calidad deben tener contornos suaves y bordes translúcidos en esta etapa. Los puntos de tiempo de la inducción neural difieren ligeramente entre las especies de primates y las líneas iPSC. En el caso de las líneas celulares utilizadas aquí (ver sección 1 y Tabla de materiales), la inducción neural para EB de tití generalmente debe iniciarse a 4 dps, para macaco rhesus a 5 dps, y para EBs humanas y de chimpancés a 4-5 dps (Figura 1A), dependiendo del estado de los EBs (ver arriba).
    1. Retire 150 μL de medio de cada pocillo de la primera fila de la placa de 96 pocillos y agregue 150 μL de medio de inducción neural precalentado (37 °C) (ver Tabla 2) por pocillo en la misma fila.
    2. Continúe cambiando el medio como se describió anteriormente fila por fila para toda la placa de 96 pocillos. Realice más cambios en el medio de inducción neural (NIM) cada dos días eliminando 150 μL de NIM de cada pocillo y agregando 150 μL de NIM fresco precalentado (37 °C).
      NOTA: A partir de este momento, los EB de tití deben cultivarse en las mismas condiciones que los otros EB de primates (atmósfera humificada de 5% deCO2 y 95% de aire a 37 °C).
  3. Incrustación en matriz de membrana basal
    NOTA: Una vez que los EB han desarrollado un neuroepitelio pronunciado, translúcido y organizado radialmente en la superficie, se debe proporcionar soporte estructural para el desarrollo de estructuras similares a ventrículos. Esto se logra incrustando los EB en una matriz de membrana basal. Debido a las diferencias en las tasas de desarrollo, los EB de tití y macaco rhesus están listos para incrustarse ya a 7 dps, mientras que los EB humanos y chimpancés generalmente están incrustados a 8-9 dps. Para simplificar, la matriz de membrana basal se refiere solo a Matrigel en este protocolo. Sin embargo, Geltrex se puede utilizar como un reemplazo.
    1. En preparación para la incrustación, esterilice con UV tijeras, pinzas, un pequeño bastidor para tubos de 0,2 ml y de tres a seis cuadrados de parafilm tratados con etanol al 70% (vol/vol) debajo de la campana de flujo laminar durante 15 min. Deje que la matriz de la membrana basal se descongele en hielo durante varias horas (~ 1.5 ml de matriz de membrana basal suele ser suficiente para 96 EB).
      NOTA: Siempre mantenga la matriz de la membrana basal en hielo.
    2. Cree una cuadrícula de hoyuelos de 4 x 4 en el parafilm. Coloque la rejilla de parafilm en el bastidor de tubos de 0,2 ml de modo que el lado envuelto en papel quede hacia arriba y presione suavemente un dedo enguantado contra cada orificio del bastidor.
    3. Retire el papel y corte la rejilla de hoyuelos del cuadrado de parafilm con tijeras para ajustar su tamaño para que quepa en una placa de cultivo celular de 60 mm. Coloque el parafilm con hoyuelos de nuevo en el bastidor de tubos de 0,2 ml para proporcionar una base para la generación de gotitas de la matriz de membrana basal.
    4. Usando una pipeta con una punta de pipeta cortada de 200 μL, transfiera cuidadosamente los EB uno tras otro desde el pozo de la placa de cultivo a los hoyuelos de parafilm.
    5. Después de mover 16 EB a la red, tome una nueva punta de pipeta de 200 μL y retire el medio restante de los hoyuelos.
    6. Pipetear una gota (~15 μL) de matriz de membrana basal sobre cada hoyuelo que contenga un EB.
    7. Tome una punta de pipeta de 10 μL y mueva rápidamente los EB al centro de cada gota sin alterar los bordes de las gotas.
    8. Coloque la parapelícula con hoyuelos con las gotas de la matriz de membrana basal en una placa de cultivo celular de 60 mm e incube durante 15-30 min a 37 °C para permitir que la matriz polimerice.
    9. Para separar los EB incrustados en la matriz del parafilm, agregue 5 ml de medio de diferenciación (MS) sin vitamina A ( ver Tabla 2) al plato, y voltee el cuadrado de parafilm boca abajo usando fórceps para que el lado con los EB quede hacia el fondo del plato.
    10. Agite cuidadosamente el plato para que las gotas de la matriz de la membrana basal que contienen los EB se desprendan de la parapelícula. Si algunos de ellos todavía están unidos, tome un borde del cuadrado de parafilm con pinzas y enróllelo rápidamente hacia el centro del plato varias veces.
    11. Cultivar los organoides cerebrales en un agitador orbital a 55 rpm en una atmósfera humificada de 5% deCO2 y 95% de aire a 37 °C. Manténgalos en DM sin vitamina A con cambios medios cada dos días. Para inducir la producción de neuronas, cambie a DM con vitamina A (ácido retinoico, AR) después de 13 dps para organoides cerebrales de tití y macaco rhesus o 14-15 dps para organoides cerebrales humanos y chimpancés (Figura 1A). A partir de este momento, cambie el medio cada 3-4 días.
      NOTA: Para apoyar la supervivencia neuronal, la DM con vitamina A se puede complementar con 20 μg/ml de neurotrofina humana 3 (NT3), 20 μg/ml de factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) y 1 μL/ml de matriz de membrana basal a partir de 40 dps.

3. Electroporación de organoides cerebrales de primates

NOTA: Desde un punto de vista técnico, la electroporación de organoides cerebrales se puede realizar tan pronto como las estructuras en forma de ventrículo son lo suficientemente pronunciadas como para ser atacadas por microinyección. La ventana de tiempo de electroporación óptima depende de la cuestión biológica y de la(s) población(es) celular(es) de interés. Por ejemplo, si los progenitores apicales (AP) son el objetivo principal, entonces los organoides cerebrales a alrededor de 30 dps ya son adecuados. Si los progenitores basales (PA) o las neuronas son los objetivos principales, se deben utilizar organoides cerebrales más antiguos de más de 50 dps (véase, por ejemplo, Fischer et al.28).

  1. Preparación de la configuración de electroporación
    NOTA: La eficiencia de electroporación se ve fuertemente afectada por el tamaño y la concentración de los plásmidos electroporados (consulte la sección de discusión para obtener más detalles).
    1. Preparar una cantidad suficiente de mezcla de electroporación para el control y el gen de interés (GOI), por ejemplo, 10 μL de mezcla de electroporación para cada control y GOI para electroporate aproximadamente 30 organoides cerebrales por condición.
      NOTA: Para la composición de las mezclas de electroporación, ver Tabla 3.
    2. Precaliente (no estéril) la mezcla modificada de Dulbecco Eagle medio/nutriente F-12 (DMEM/F12) y DM con vitamina A a 37 °C. Prepare una espátula pequeña y unas tijeras finas y normales, y rocíe los instrumentos con etanol al 70% (vol/vol).
      NOTA: Los siguientes pasos se pueden realizar en condiciones estériles o no estériles, ya que la DM contiene antibióticos (ver Tabla 2). En nuestra experiencia, la ausencia de esterilidad nunca ha causado ninguna contaminación.
    3. Prepare placas de cultivo celular de 35 mm y conecte la cámara de electrodos de la placa de Petri al electroporator.
      NOTA: Las cámaras de electrodos de placa de Petri están disponibles comercialmente. Sin embargo, se pueden producir fácilmente de una manera rentable (consulte el Archivo complementario 1).
    4. Usando puntas de microcargador, llene las agujas de microinyección con 8 μL de cada mezcla de electroporación. Cortar las puntas de las agujas con tijeras finas antes del primer uso para lograr un flujo estable. Sin embargo, retire solo una pequeña parte de la punta, ya que una punta roma y ancha puede dañar gravemente los organoides.
      NOTA: Las agujas de microinyección están disponibles comercialmente como agujas de microinyección pre-tiradas o se pueden extraer en el laboratorio si hay un extractor de agujas disponible. Siga las instrucciones del fabricante del extractor de agujas para generar agujas de microinyección con un cono largo y un diámetro de punta de 10 μm.
  2. Microinyección y electroporación
    1. Bajo un microscopio, elija cinco organoides cerebrales con bordes lisos y estructuras similares a ventrículos claramente visibles. Trasladarlos a una placa de cultivo celular de 35 mm que contenga DMEM/F12 precalentado (37 °C) utilizando una punta de pipeta cortada de 1.000 μL.
      NOTA: Elija organoides cerebrales con estructuras similares a ventrículos pronunciadas y accesibles (ver Figura 1B).
    2. Para inyectar una estructura similar a un ventrículo, inserte cuidadosamente la aguja a través de su pared e infundirla con la mezcla de electroporación hasta que esté visiblemente llena. No aplique una presión excesiva sobre las estructuras similares a los ventrículos para evitar que se rompan. Proceda con seis a ocho estructuras similares a ventrículos de cada organoide cerebral de esta manera.
      NOTA: Si la aguja se obstruye durante el proceso de microinyección, la punta debe recortarse ligeramente.
    3. Transfiera un organoide cerebral microinyectado a la cámara de electrodos de la placa de Petri con una pequeña cantidad de DMEM/F12. Coloque el organoide de manera que las superficies de las estructuras similares a ventrículos microinyectadas miren hacia el electrodo conectado al polo positivo del electroporador.
      NOTA: La orientación de las estructuras de esta manera asegura que las células se transfecten en el lado de la estructura similar a un ventrículo que no se ve afectada por una estructura adyacente.
    4. Electroporar los organoides cerebrales uno por uno utilizando los siguientes ajustes: 5 pulsos de 80 V, una duración del pulso de 50 ms y un intervalo de 1 s. Mover los organoides electroporados a una nueva placa de cultivo celular de 35 mm llena de DMEM/F12 precalentado (37 °C).
      NOTA: Los ajustes de electroporación pueden depender del electroporador de onda cuadrada disponible. Estos ajustes están optimizados para el sistema de electroporación al que se hace referencia. El aumento del voltaje puede conducir al desplazamiento de las células.
    5. Proceda de la misma manera con los siguientes cinco organoides cerebrales utilizando la segunda mezcla de electroporación (por ejemplo, GOI).
      NOTA: Repita los pasos 3.2.1-3.2.5 hasta alcanzar el número deseado de organoides cerebrales electroporados.
    6. Si la microinyección y la electroporación se realizaron en condiciones no estériles, transferir los organoides electroporados a una placa de cultivo celular estéril de 35 mm bajo una campana de flujo laminar mientras se mueve la menor cantidad posible de DMEM/F12 a la nueva placa de cultivo celular.
  3. Cultivo adicional y fijación de organoides cerebrales
    1. Cultivar los organoides electroporados en DM con vitamina A en un agitador orbital a 55 rpm en una atmósfera humificada de 5% deCO2 y 95% de aire a 37 °C.
    2. Al día siguiente después de la electroporación, verifique los organoides cerebrales para una electroporación exitosa bajo un microscopio de fluorescencia invertida convencional.
      NOTA: Dependiendo de la duración del cultivo adicional después de la electroporación, diferentes poblaciones celulares dentro del organoide cerebral se ven afectadas (ver también la sección de resultados representativos).
    3. Proceder con las aplicaciones posteriores después de cultivar los organoides cerebrales electroporados durante un período de tiempo adecuado para la cuestión biológica de interés.
      NOTA: Los organoides cerebrales electroporados pueden procesarse para diferentes aplicaciones posteriores (por ejemplo, fijación para tinción de inmunofluorescencia o congelación instantánea para aislamiento de ARN y qRT-PCR). Aquí, describimos la fijación de organoides cerebrales electroporados.
    4. Transfiera los organoides electroporados a un tubo de centrífuga cónica de 15 ml utilizando una punta de pipeta cortada de 1.000 μl y elimine el exceso de medio.
    5. Añadir una cantidad suficiente de paraformaldehído (PFA) al 4% en DPBS (pH 7,5) e incubar durante 30 min a temperatura ambiente.
      PRECAUCIÓN: El PFA está clasificado como carcinógeno humano y puede causar daños irreparables a la salud. Se recomiendan encarecidamente medidas de precaución adicionales, incluidos guantes y gafas de nitrilo.
    6. Aspire el PFA, agregue 5 ml de DPBS, agite un poco y aspire el DPBS. Repita esto 2x. Conservar los organoides en DPBS a 4 °C hasta su uso posterior.
      NOTA: El protocolo se puede pausar aquí, ya que los organoides cerebrales fijados con PFA se pueden almacenar a 4 °C durante varios meses. Los organoides electroporados fijados por PFA pueden analizarse mediante criosección y tinción por inmunofluorescencia 10,28 o por tinción y limpieza de montaje completo 35,36. Para ver imágenes de ejemplo, consulte la sección de resultados representativos (consulte la Tabla 4 para obtener detalles sobre anticuerpos).

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Resultados

El protocolo descrito aquí permite la generación eficiente de organoides cerebrales a partir de líneas iPSC humanas, de chimpancés, de macaco rhesus y tití común con alteraciones mínimas de tiempo requeridas entre especies (Figura 1A). Estos organoides pueden electroporarse en el rango de 20 dps a 50 dps, dependiendo de la accesibilidad de las estructuras similares a ventrículos y la abundancia de la(s) población(es) celular(es) de interés. Sin embargo, antes de la electroporación, es import...

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Discusión

Los procedimientos descritos aquí representan un protocolo unificado para la generación de organoides cerebrales de diferentes especies de primates con un enfoque de electroporación dirigido. Esto permite la expresión ectópica de un GOI en un sistema modelo que emula el desarrollo (pato)fisiológico del neocórtex de los primates (incluido el humano). Este protocolo unificado para la generación de organoides cerebrales de primates utiliza los mismos materiales (por ejemplo, medios) y pasos de protocolo para las cuatro espe...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.

Agradecimientos

Pedimos disculpas a todos los investigadores cuyo trabajo no pudo ser citado debido a limitaciones de espacio. Agradecemos a Ulrich Bleyer de los servicios técnicos de DPZ y a Hartmut Wolf del taller de MPI-CBG por la construcción de las cámaras de electrodos de la placa de Petri; Stoyan Petkov y Rüdiger Behr por proporcionar iPSC humanas (iLonza2.2), macacos rhesus (iRh33.1) y titíes (cj_160419_5); Sabrina Heide para la criosección y tinción por inmunofluorescencia; y Neringa Liutikaite y César Mateo Bastidas Betancourt por la lectura crítica del manuscrito. El trabajo en el laboratorio de W.B.H. fue apoyado por una subvención de ERA-NET NEURON (MicroKin). El trabajo en el laboratorio de M.H. fue apoyado por una subvención inicial del ERC (101039421).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
20 y micro; L MicrocargadorEppendorf5242956003
2-MercaptoetanolMerck8.05740.0005
Placas de cultivo celular de 35 mmSarstedt83.3900
Placas de cultivo celular de 60 mmCytoOneCC7682-3359
Activina ASigma-AldrichSRP3003
AOC1SelleckchemS7217
Microscopio de fluorescencia invertida Axio Observer.Z1Zeissreemplazable por microscopios fluorescentes comparables
AZD0530Selleckchem S1006
B-27 Suplemento con Vitamina A (ácido retinoico, AR) (50x)Gibco17504-044
B-27 Suplemento sin Vitamina A (50x)Gibco12587-010
BTX ECM 830 Sistema de Electroporación de Onda CuadradaBTX45-2052
CGP77675 Sigma-AldrichSML0314
Línea de células madre pluripotentes inducidas por chimpancé Sandra Adoi: 10.7554/elife.18683 
Línea de células madre pluripotentes inducidas por tití común cj_160419_5doi: 10.3390/cells9112422
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mix F-12 (DMEM/F12)Gibco11320-033
Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS)Gibco14190-094pH 7.0&menos; 7.3; calentar a temperatura ambiente antes de usar
Fast GreenSigma-AldrichF7252-5G
ForskolinSelleckchem2449
GlutaMAX Suplemento (100x)Gibco35050-061suplemento sustituto de glutamina
Heparina (1 mg/mL de existencia)Sigma-AldrichH3149
Línea de células madre pluripotentes inducidas humanas iLonza2.2doi: 10.3390/cells9061349
Neurotrofina humana-3 (NT-3)PeproTech450-03
InsulinaSigma-Aldrich19278
IWR1Sigma-AldrichI0161
Microscopio estereoscópico Leica MS5 (base de luz transmitida MDG 17)Leica10473849reemplazable por microscopios estereoscópicos comparables
MatrigelCorning354277/354234matriz de membrana basal; alternativamente, se puede utilizar Geltrex (ThermoFisher Scientific, A1413302)
MEM Solución de aminoácidos no esenciales (100x)Sigma-AldrichM7145
N-2 Suplemento (100x)Gibco17502-048
Medio neurobasalGibco21103-049
ParafilmSigma-AldrichP7793
Paraformaldehído Mangode 818715con causión debido a la cancerogenicidad
Penicilina/Estreptomicina (10.000 U/mL)PanBiotechP06-07100
Cámara de electrodos de placa de Petride producción propia (ver Archivo Complementario 1)también disponible comercialmente
Pipetas de vidrio pre-extraídasWPITIP10LTpipetas de vidrio de borosilicato con cono largo, 10 y micro; m diámetro de la punta
Compuesto Pro-SupervivenciaMerckMillipore529659
Factor neurotrófico (BDNF) derivado del cerebro humano recombinante humano/murino/rataPeproTechAF-450-02
Línea de células madre pluripotentes inducidas por macaco rhesus iRh33.1doi: 10.3390/cells9061349
StemMACS iPS-Brew XFMiltenyi Biotech130-104-368
Reactivo de disociación celular StemPro AccutaseGibcoA1110501mezcla de enzimas proteolíticas y colagenolíticas
TrypLEGibco12604-013sustituto recombinante de tripsina; calentar a temperatura ambiente antes de usar
Accesorio ultrabajo Placas de 96 pocillosCostar7007
Y27632Tecnologías de células madre72305
Merck

Referencias

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