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Artículo de método

Caracterización de transportadores de zinc en mamíferos mediante un ensayo de transporte de zinc in vitro

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DOI:

10.3791/65217

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2 de junio de 2023

 ,  , 
1Department of Life Sciences and National Institute for Biotechnology in the Negev, Ben-Gurion University, 2Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion University

En este artículo

Resumen

El transporte de zinc ha demostrado ser difícil de medir debido a los débiles vínculos causales con la función de las proteínas y la baja resolución temporal. Este protocolo describe un método para monitorear, con alta resolución temporal, la extrusión de Zn 2+ de células vivas mediante la utilización de un colorante fluorescente sensible al Zn 2+, proporcionando así una medida directa del flujo de Zn2+.

Resumen

Los metales de transición, como los iones Zn2+, deben estar estrictamente regulados debido a su toxicidad celular. Anteriormente, la actividad de los transportadores de Zn 2+ se medía indirectamente determinando el nivel de expresión del transportador bajo diferentes concentraciones de Zn2+. Esto se hizo mediante la utilización de inmunohistoquímica, la medición del ARNm en el tejido o la determinación de los niveles celulares de Zn2+. Con el desarrollo de sensores intracelulares de Zn 2+, las actividades de los transportadores de zinc están actualmente determinadas principalmente por la correlación de los cambios en el Zn 2+ intracelular, detectados mediante sondas fluorescentes, con la expresión de los transportadores de Zn2+. Sin embargo, incluso hoy en día, solo unos pocos laboratorios monitorean los cambios dinámicos en el Zn2+ intracelular y lo utilizan para medir directamente la actividad de los transportadores de zinc. Parte del problema es que de los 10 transportadores de zinc de la familia ZnT, a excepción del ZnT10 (transporta manganeso), solo el transportador de zinc 1 (ZnT1) se localiza en la membrana plasmática. Por lo tanto, es difícil vincular la actividad de transporte a los cambios en la concentración intracelular de Zn2+. Este artículo describe una forma directa de determinar la cinética de transporte de zinc utilizando un ensayo basado en un colorante fluorescente específico de zinc, FluoZin-3. Este colorante se carga en las células de mamíferos en su forma de éster y luego queda atrapado en el citosol debido a la actividad de la diesterasa celular. Las células se cargan con Zn 2+ utilizando el ionóforo Zn2+ piritiona. La actividad de ZnT1 se evalúa a partir de la parte lineal de la reducción de la fluorescencia después del lavado celular. La fluorescencia medida a una excitación de 470 nm y una emisión de 520 nm es proporcional al Zn2+ intracelular libre. La selección de las células que expresan ZnT1 marcadas con el fluoróforo mCherry permite monitorizar solo las células que expresan el transportador. Este ensayo se utiliza para investigar la contribución de diferentes dominios de la proteína ZnT1 al mecanismo de transporte de ZnT1 humano, una proteína transmembrana eucariota que extruye el exceso de zinc de la célula.

Introducción

El zinc es un oligoelemento esencial en el medio celular. Incorpora un tercio de todas las proteínas y participa en diversos procesos celulares, como la catálisis1, la transcripción2 y los motivos estructurales3. Sin embargo, a pesar de ser redox-inerte, las altas concentraciones de zinc son tóxicas para la célula, por lo que ningún organismo mamífero ha sobrevivido sin la presencia de mecanismos que regulen la homeostasis del zinc. En los mamíferos, tres mecanismos son responsables de este proceso: (1) metalotioneínas, que son proteínas citosólicas ricas en cisteína que se unen al zinc con una alta afinidad, evitando así el exceso de zinc citosólico libre4; (2) proteínas similares a Zrt/Irt (ZIP), que son transportadores de zinc responsables de la entrada de zinc en el citosol a través de la membrana plasmática o de orgánulos intracelulares 4,5,6,7,8; y (3) ZnTs, que son un subconjunto de mamíferos de la familia de facilitadores de difusión catiónica ubicua (CDF) y son transportadores de zinc, ya que extruyen zinc desde el citosol a través de la membrana plasmática o hacia los orgánulos intracelulares 4,5,6,7,8,9. Debido a la importancia del zinc para el metabolismo celular, es vital comprender la dinámica celular del zinc.

Los métodos anteriores para evaluar la dinámica del zinc dependían de la evaluación de los niveles de expresión de ARNm en diferentes condiciones de zinc correlacionándolos con las mediciones de zinc celular de tejidos o células fijas10,11,12. Estos métodos incluyen la detección química y la tinción inmunohistoquímica. Sin embargo, estos métodos solo producen medidas indirectas y, por lo tanto, solo determinan una correlación fuera de línea entre la concentración intracelular de zinc y la expresión de los transportadores de zinc. En consecuencia, estos métodos no pueden inferir ningún parámetro que requiera una alta resolución temporal.

Una medición más directa del transporte de Zn2+ utiliza isótopos radiactivos de zinc13. Este método se basa en la medición de Zn2+ radiomarcado para monitorear el transporte de zinc y su cinética. Sin embargo, debido a la importancia del zinc para la homeostasis celular, múltiples procesos celulares regulan la concentración intracelular de zinc. Entre ellos se encuentran la unión extracelular y varios sistemas de transporte que trabajan en conjunto para mantener un control estricto de los niveles intracelulares de Zn2+ . La combinación de estos procesos crea un ruido de fondo considerable, lo que dificulta la comprobación de las funciones de transporte individuales relacionadas con el zinc.

Este artículo demuestra un método para monitorear directamente la tasa de transporte de zinc mediante la medición de la concentración de zinc libre intracelular utilizando un colorante fluorescente específico de zinc, FluoZin-3. El colorante tiene una alta especificidad para Zn2+ y poca interferencia de otros cationes divalentes, como el calcio. Además, en su forma de éster, entra en las células por difusión no iónica y luego queda atrapado debido a la actividad de la diesterasa intracelular. Por lo tanto, su fluorescencia se correlaciona principalmente con la concentración de zinc citosólico libre. Estos experimentos se llevaron a cabo para estudiar la relación estructura-función del transportador de zinc 1 (ZnT1), un miembro de la familia ZnT.

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Protocolo

1. Transfección celular

  1. Cultivo HEK293T células en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con suero fetal bovino (FBS) al 10%, 2 mM de L-glutamina y 1x penicilina/estreptomicina (ver Tabla de Materiales) en una incubadora humidificada a 37 °C/5% CO2 hasta la confluencia en una placa de 10 cm (8,8 x 106 células totales).
  2. Coloque un cubreobjetos de 13 mm en cada uno de los pocillos de una placa de 12 pocillos. Diluir 0,44 x 106 células tripsinizadas del paso 1,1 en 12 ml de DMEM completo. Mezcle bien pipeteando hacia arriba y hacia abajo de tres a cinco veces. Llene cada pocillo con 1 ml de la solución mezclada. Cultivar en una incubadora humidificada a 37 °C/5% deCO2 durante la noche.
  3. Reemplace el DMEM completo en cada pocillo con 1 ml de DMEM sin suero (consulte la Tabla de materiales) en cada pocillo. Regrese la placa de 12 pocillos a la incubadora humidificada como en el paso 1.1.
  4. Para cada pocillo de transfección, diluir 1 μg de plásmido pAAV2 que contenga la proteína de interés marcada con proteína fluorescente mCherry (Archivo suplementario 1) en 100 μL de DMEM sin suero en un tubo de 1,5 mL.
  5. Agregue 3 μg de polietileneimina (PEI, consulte la tabla de materiales) a 100 μl de DMEM sin suero por transfección, con cada transfección en un tubo diferente de 1,5 ml. La relación plásmido:PEI debe ser de 1:3 (μg:μg).
  6. Agitar ambos tubos desde el paso 1.4 y el paso 1.5 durante 10 s, y dejar reposar a temperatura ambiente durante al menos 5 min.
  7. Mezcle una parte (100 μL por pocillo) de la solución de ADN del paso 1.4 con una parte (100 μL por pocillo) de la solución de PEI del paso 1.5. Agitar la solución final durante 10 s y dejarla reposar a temperatura ambiente durante al menos 20 minutos y hasta 6 h.
  8. Tome la placa de 12 pocillos de la incubadora. Agite la solución final del paso 1.7 y agregue 200 μL a cada uno de los pocillos en la placa de 12 pocillos del paso 1.3. Regrese la placa de 12 pocillos a la incubadora humidificada (paso 1.1).
  9. Después de 3 h, reemplace el medio en cada pocillo con 1 mL de DMEM completo. Regrese la placa de 12 pocillos a la incubadora humidificada como en el paso 1.1.
  10. Después de 2 días, tome el cultivo celular transfectado de la incubadora de 37 °C/5% de CO2 y colóquelo en un microscopio de fluorescencia invertida con un aumento de 10x.
  11. Usando la rueda de enfoque del microscopio, enfoque las células mientras usa luz de campo claro.
  12. Cambie a las longitudes de onda fluorescentes de excitación mCherry (587 nm) y emisión (610 nm) y apague la luz de campo claro. Compruebe la fluorescencia de las células para confirmar la expresión de ZnT1 mCherry.
  13. Prepare la solución de carga de tinte.
    1. Tome una alícuota de 4 μL de colorante fluorescente específico de zinc (ver Tabla de Materiales) en su forma de éster de acetoximetilo (AM), disuelto en DMSO (1 μg/μL), de un caldo protegido a la luz almacenado en un congelador a -20 °C. Esta forma permite que el colorante entre en la célula a través de la membrana plasmática por difusión simple.
    2. Añadir 4 μl de ácido plurónico al 10% (o 2 μl de ácido plurónico al 20%, véase la tabla de materiales) a la alícuota del paso 1.13.1. Mezcle bien la solución pipeteando hacia arriba y hacia abajo tres veces, y luego agregue los 8 μL a un tubo de 1,5 mL.
    3. Añadir 750 μL de solución de Ringer (preparada internamente, ver Tabla de Materiales para la composición) suplementada con 1 mg/mL (~0,1%) de albúmina sérica bovina al tubo a partir del paso 1.13.2, y vórtice vigorosamente. Agregue otros 750 μL de la misma solución y vuelva a vórtice para garantizar la máxima mezcla.
  14. Agregue 750 μL de la solución final del paso 1.13.3 a dos pocillos en una nueva placa de cultivo de 6 pocillos. Cubra con papel de aluminio.
    NOTA: Para evitar el blanqueamiento, la placa de 6 pocillos siempre está cubierta con papel de aluminio a partir de este paso.
  15. Con una pinza fina, tome hasta cuatro cubreobjetos replicados de la placa de cultivo celular transfectada y colóquelos en el primer pocillo lleno (hasta cuatro portaobjetos por pocillo) de la nueva placa de 6 pocillos del paso 1.14. Repita este proceso para el segundo pocillo lleno.
    NOTA: Todos los cubreobjetos en el mismo pocillo lleno deben ser de la misma condición. Sin embargo, cada pozo puede contener condiciones diferentes.
  16. Cubra con papel de aluminio y agite suavemente durante 15-20 min.
  17. Retire la solución de carga de tinte y reemplácela con una nueva solución de lavado de albúmina de Ringer, como se usa en el paso 1.13.3. Cubra con papel de aluminio. Dejar agitar de nuevo durante 20 min. Esto permite la escisión del éster AM por las esterasas intracelulares.

2. Preparación del microscopio

  1. Disponer las herramientas necesarias (ver Tabla de Materiales) como se mencionó: un microscopio de fluorescencia invertida capaz de detectar fluoróforos GFP y mCherry, un sistema de perfusión que permita cambiar entre al menos dos soluciones, un sistema de succión y una cámara de perfusión.
  2. Encienda el microscopio, su fuente de luz y la cámara. Encienda el sistema de succión.
  3. Lave el sistema de perfusión. Lavar la primera cámara con la solución de Ringer y la segunda cámara con la solución de Ringer que contiene 7 μM de solución de zinc suplementada con 7 μM de piritionato (ionóforo de zinc, ver Tabla de Materiales). Para evitar burbujas de aire o huecos, deje un poco de líquido en cada cámara.
    NOTA: Dado que ambos recipientes están conectados al mismo tubo conectado a la cámara de perfusión, asegúrese siempre de lavar el segmento compartido con la solución de Ringer.
  4. Cierre los grifos y llene las cámaras apropiadas con la solución de Ringer y la solución de zinc de Ringer, como en el paso 2.3.

3. Preparación de la muestra

  1. Tome la cámara de perfusión y colóquela con el lado estrecho de la ranura hacia arriba.
    NOTA: La ranura es un orificio en el medio de la cámara de perfusión. Permite el acceso del líquido de perfusión a las células. Un lado de la ranura es estrecho y el lado opuesto es ancho.
  2. Aplique una silicona de sellado (consulte la Tabla de materiales) alrededor de la ranura. Limpie la silicona de sellado de la ranura con una punta de pipeta.
    NOTA: Asegúrese de que haya suficiente sello de silicona alrededor de la ranura para sellar un cubreobjetos de 22 mm.
  3. Con una pinza fina, tome un cubreobjetos de la solución de lavado y colóquelo encima de la ranura con las celdas hacia abajo. De esta manera, las células estarán expuestas a la solución que perfunde el surco durante el experimento.
  4. Coloque un cubreobjetos de 22 mm encima del cubreobjetos de 13 mm y apriételo con la pinza. Tenga cuidado de no romper los cubreobjetos.
  5. Dale la vuelta a la cámara y presiona sobre ella para liberar todos los líquidos presentes. Llene la ranura con 100 μL de solución de lavado de Ringer y presione nuevamente para asegurarse de que no haya fugas.
    NOTA: Si se detecta una fuga, aplique un agente sellador en el sitio de la fuga y vuelva a realizar la prueba.
  6. Monte la cámara de perfusión en la plataforma y asegúrela. Coloque los tubos de perfusión y succión para permitir la perfusión sobre las células en la ranura.
  7. Cambie la velocidad de perfusión a aproximadamente 2 ml/min y encienda la perfusión de la solución de Ringer. Asegúrese de que el sistema de perfusión funcione sin fugas ni derrames.

4. Preparación de la medición

  1. Abra el software de imágenes (consulte Tabla de materiales) haciendo doble clic en el icono. Inicie sesión con las credenciales pertinentes. Elija la cámara conectada y presione Aceptar.
  2. Ajuste el aumento del microscopio a 10x usando el botón en el lado izquierdo del microscopio.
  3. Al elegir la visualización en directo y utilizar el joystick, mueva la plataforma para enfocar las celdas de la ranura.
  4. Mientras la perfusión está encendida, apague las luces y cambie la longitud de onda a mCherry presionando el botón dedicado en la interfaz. Ajuste el enfoque con la rueda de enfoque del microscopio.
  5. Una vez que el microscopio esté enfocado en las células, mueva la plataforma con el joystick para permitir la selección de los parches celulares apropiados.
    NOTA: Un área adecuada se considera un área con al menos 10 celdas para un ROI y un área vacía para el fondo.
  6. Seleccione el menú desplegable Activar/desactivar ROI y elija Dibujar ROI circulares.
  7. Dibuje ROI de grupos de células con las células que expresan mCherry (indica la expresión de ZnT1).
  8. En la misma barra de herramientas que el paso 4.6, haga clic en el botón Activar/desactivar el ROI de fondo y ajuste la ubicación y el tamaño del ROI de fondo a un área sin celdas.
    1. Verifique con las longitudes de onda mCherry y EGFP para asegurarse de que no haya celdas en el ROI de fondo seleccionado.
      NOTA: Las longitudes de onda se ajustaron de modo que mCherry utilizara una longitud de onda de excitación de 520 nm y una longitud de onda de emisión de 610 nm y EGFP utilizara una longitud de onda de excitación de 470 nm y una longitud de onda de emisión de 520 nm.
  9. Seleccione la subpestaña Longitud de onda (λ). Marque su casilla de verificación y asegúrese de que la longitud de onda GFP esté presente y su casilla de verificación marcada. Si no es así, agréguelo y márquelo.
  10. Seleccione la subpestaña Duración . Defina el intervalo de medición cada 5 s y cambie el número de intervalos para adaptarlo a la duración del experimento.
  11. En la sección Enfoque en el panel del microscopio debajo del ocular, haga clic en el botón Activado para habilitar el sistema de enfoque perfecto (PFS).
  12. Con la rueda de enfoque PFS, ajuste el enfoque. En la interfaz del software, en ND Acquisition, asegúrese de que PFS activado esté marcado.
  13. Haga clic en Ejecutar ahora.

5. Procedimiento experimental

  1. Comience con una medición del período de referencia de 90 s utilizando la perfusión en solución de Ringer.
  2. Una vez finalizado el período de referencia, apague la perfusión de la solución del Ringer y, a continuación, active la perfusión de la solución de zinc del Ringer. Marque el cambio de la solución haciendo clic en la bandera roja en la parte inferior derecha del panel de interfaz principal. Se espera que aparezca un aumento de la fluorescencia.
  3. Una vez que el aumento de la fluorescencia comience a saturarse, vuelva a la perfusión con la solución de Ringer. Apague la perfusión de la solución de zinc del Ringer y, a continuación, encienda la perfusión de la solución del Ringer.
  4. Espere hasta que expire el tiempo del experimento. Se espera una disminución notable pero constante de la fluorescencia si el ZnT1 funciona correctamente.

6. Exportación de datos

  1. Para exportar los datos con la resta de línea base, presione el botón Restar línea base y vea los cambios en la "ventana de adquisición ND".
  2. Haga clic en el botón Exportar en la interfaz del software en la "ventana de adquisición ND". Se abrirá una hoja de datos de Excel. Guarde en la ubicación deseada.

7. Análisis de datos

  1. Para cada ROI, cree una fluorescencia de referencia promedio de los primeros 90-100 s.
  2. Exprese la fluorescencia calculada para cada ROI como un porcentaje del fondo para ese ROI.
  3. Cree un promedio de filas de todos los ROI y represente el resultado como un gráfico de líneas. Esto crea un promedio de todos los ROI en función del tiempo.
  4. Utilizando la función de ajuste lineal, seleccione la tasa inicial para la disminución de la fluorescencia después del lavado con la solución de Ringer. El valor de la pendiente de la ecuación se correlaciona con la velocidad de transporte.

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Resultados

El ZnT1 es un transportador de zinc de mamíferos localizado en la membrana plasmática celular13. Es un miembro de la familia de proteínas facilitadoras de difusión catiónica (CDF) que extruyen zinc desde el citosol hasta el medio extracelular14. ZnT1 tiene una arquitectura de dos dominios: el dominio transmembrana, que transporta los iones a través de la membrana, y un dominio C-terminal14. A diferencia de otras proteínas CDF conocidas, ZnT1 tiene un...

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Discusión

El método descrito anteriormente permite la medición directa de la concentración intracelular de zinc con alta resolución temporal. En comparación con otros métodos, este método que implica la monitorización de los cambios en el Zn2+ intracelular puede disminuir sustancialmente el ruido de fondo. Además, la selectividad del colorante para el zinc elimina las posibles interacciones cruzadas con otros cationes metálicos18,19. Por último, su falta de cito...

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Divulgaciones

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

Raz Zarivach cuenta con el apoyo de la Fundación de Ciencias de Israel (subvención nº 163/22). Tomer Eli Ben Yosef y Arie Moran cuentan con el apoyo de la Fundación de Ciencias de Israel (subvención n.º 2047/20). Nos gustaría agradecer a Daniel Gitler y a su grupo de la Universidad Ben-Gurion por su cooperación, apoyo y experiencia.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Placa de 10 cmGreiner Bio-One664160
Placa de cultivo celular de 12 pocillosGreiner Bio-One665180
Cubreobjetos de 13 mmSuperior Marienfeld111530
Portaobjetos de 22 mmSuperior Marienfeld101050
Placa de cultivo de 6 pocillosGreiner Bio-One657160
Suero bovino albúminabioWorld22070008 Cloruro
de calcio anhidro, granularSigma AldrichC1016Concentración en solución Ringer: 1 mM
D-(+)-GlucosaGlentham Life ScienceGC6947Concentración en solución Ringer: 10 mM
Dubelco' s Medios de águila modificados (DMEM) Microscopio invertido Sartorius01-055-1A
Eclipse TiNikonTI-DHDescatalogado. Reemplazado por Eclipse Ti2
Suero Fetal Bovino (FBS)CytivaSH30088.03
Pinzas finasDumont0203-55-PS
Fluozin-3AMInvitrogenF24195
HyClone Penicilina-Estreptomicina 100x soluciónCytivaSV30010 
Sistema de iluminación LEDCoolLEDpE-4000
L-glutaminaIndustrias Biológicas03-020-1B
Cloruro de magnesio hexahidratadoMerck1.05833Concentración en solución de Ringer: 0,8 mM
N[2-hidroxietil]piperazina-N'-[ácido 2-etanosulfónico] (HEPES)ParaHEPES10Concentración en solución de Ringer: 10 mM
Cámara Neo 5.5 SCMOSANDORDC-152Q-Fi
Software de imagen NIS-ElementsNikonAR
Ácido plurónico F-127Millipore540025
Cloruro de potasioBio-Lab163823Concentración en solución Ringer: 5,4 mM
PyrithioneSigma AldrichH3261Concentración en solución de zinc Ringer: 7 μ M
Kit de grasa de siliconaWarner InstrumentsW4 64-0378
Cloruro de sodioBio-Lab190305 Concentración en solución Ringer: 120 mM
Sulfato de zincSigma Aldrich31665Concentración en solución de zinc Ringer: 7 μ M
medio

Referencias

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