Caracterización de transportadores de zinc en mamíferos mediante un ensayo de transporte de zinc in vitro

Tomer  Eli Ben Yosef; Raz Zarivach; Arie Moran

doi:10.3791/65217

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Artículo de método

Caracterización de transportadores de zinc en mamíferos mediante un ensayo de transporte de zinc in vitro

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DOI:

10.3791/65217

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2 de junio de 2023

Tomer Eli Ben Yosef¹ , Raz Zarivach¹ , Arie Moran²

¹Department of Life Sciences and National Institute for Biotechnology in the Negev, Ben-Gurion University, ²Department of Physiology and Cell Biology, Faculty of Health Sciences, Ben-Gurion University

En este artículo

Resumen

El transporte de zinc ha demostrado ser difícil de medir debido a los débiles vínculos causales con la función de las proteínas y la baja resolución temporal. Este protocolo describe un método para monitorear, con alta resolución temporal, la extrusión de Zn 2+ de células vivas mediante la utilización de un colorante fluorescente sensible al Zn 2+, proporcionando así una medida directa del flujo de Zn²⁺.

Resumen

Los metales de transición, como los iones Zn²⁺, deben estar estrictamente regulados debido a su toxicidad celular. Anteriormente, la actividad de los transportadores de Zn 2+ se medía indirectamente determinando el nivel de expresión del transportador bajo diferentes concentraciones de Zn²⁺. Esto se hizo mediante la utilización de inmunohistoquímica, la medición del ARNm en el tejido o la determinación de los niveles celulares de Zn²⁺. Con el desarrollo de sensores intracelulares de Zn 2+, las actividades de los transportadores de zinc están actualmente determinadas principalmente por la correlación de los cambios en el Zn 2+ intracelular, detectados mediante sondas fluorescentes, con la expresión de los transportadores de Zn²⁺. Sin embargo, incluso hoy en día, solo unos pocos laboratorios monitorean los cambios dinámicos en el Zn²⁺ intracelular y lo utilizan para medir directamente la actividad de los transportadores de zinc. Parte del problema es que de los 10 transportadores de zinc de la familia ZnT, a excepción del ZnT10 (transporta manganeso), solo el transportador de zinc 1 (ZnT1) se localiza en la membrana plasmática. Por lo tanto, es difícil vincular la actividad de transporte a los cambios en la concentración intracelular de Zn²⁺. Este artículo describe una forma directa de determinar la cinética de transporte de zinc utilizando un ensayo basado en un colorante fluorescente específico de zinc, FluoZin-3. Este colorante se carga en las células de mamíferos en su forma de éster y luego queda atrapado en el citosol debido a la actividad de la diesterasa celular. Las células se cargan con Zn 2+ utilizando el ionóforo Zn²⁺ piritiona. La actividad de ZnT1 se evalúa a partir de la parte lineal de la reducción de la fluorescencia después del lavado celular. La fluorescencia medida a una excitación de 470 nm y una emisión de 520 nm es proporcional al Zn²⁺ intracelular libre. La selección de las células que expresan ZnT1 marcadas con el fluoróforo mCherry permite monitorizar solo las células que expresan el transportador. Este ensayo se utiliza para investigar la contribución de diferentes dominios de la proteína ZnT1 al mecanismo de transporte de ZnT1 humano, una proteína transmembrana eucariota que extruye el exceso de zinc de la célula.

Introducción

El zinc es un oligoelemento esencial en el medio celular. Incorpora un tercio de todas las proteínas y participa en diversos procesos celulares, como la catálisis¹, la transcripción² y los motivos estructurales³. Sin embargo, a pesar de ser redox-inerte, las altas concentraciones de zinc son tóxicas para la célula, por lo que ningún organismo mamífero ha sobrevivido sin la presencia de mecanismos que regulen la homeostasis del zinc. En los mamíferos, tres mecanismos son responsables de este proceso: (1) metalotioneínas, que son proteínas citosólicas ricas en cisteína que se unen al zinc con una al....