Method Article

Ensayo de viabilidad de conidios de Trichoderma stromaticum dentro de macrófagos mononucleares derivados de sangre periférica humana

DOI:

10.3791/65231

⸱

October 20th, 2023

 ,  ,  ,  , 
1Laboratory of Immunobiology - Department of Biological Sciences, State University of Santa Cruz - UESC, 2Università Degli Studi di Genova

* These authors contributed equally

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La técnica que implica la fagocitosis de conidios fúngicos por macrófagos es ampliamente utilizada para estudios que evalúan la modulación de las respuestas inmunes contra hongos. El propósito de este manuscrito es presentar un método para evaluar la fagocitosis y la capacidad de depuración de macrófagos mononucleares de sangre periférica humana estimulados con conidios de Trichoderma stromaticum .

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los macrófagos representan una línea de defensa crucial y son responsables de prevenir el crecimiento y la colonización de patógenos en diferentes tejidos. La fagocitosis conidial es un proceso clave que permite la investigación de los eventos citoplasmáticos y moleculares implicados en las interacciones macrófago-patógeno, así como la determinación del momento de muerte de los conidios internalizados. La técnica que implica la fagocitosis de conidios fúngicos por macrófagos es ampliamente utilizada para estudios que evalúan la modulación de las respuestas inmunes contra hongos. La evasión de la fagocitosis y el escape de los fagosomas son mecanismos de virulencia fúngica. En este trabajo se presentan los métodos que se pueden utilizar para el análisis de la fagocitosis, aclaramiento y viabilidad de T. stromaticum conidia, un hongo que se utiliza como agente de biocontrol y biofertilizante y es capaz de inducir infecciones humanas. El protocolo consiste en 1) cultivo de Trichoderma , 2) lavado para obtener conidios, 3) el aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) utilizando el método de solución de polisacarosa y la diferenciación de los PBMCs en macrófagos, 4) un método de fagocitosis in vitro utilizando cubreobjetos de vidrio redondos y coloración, y 5) un ensayo de aclaramiento para evaluar la viabilidad de los conidios después de la fagocitosis de los conidios. En resumen, estas técnicas se pueden utilizar para medir la eficiencia de eliminación de hongos de los macrófagos.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El género Trichoderma (Orden: Hypocreales, Familia: Hypocreaceae) está compuesto por hongos saprófitos ubicuos que son parásitos de otras especies fúngicas y son capaces de producir una variedad deenzimas comercialmente útiles. Estas especies fúngicas se utilizan para la producción de proteínas heterólogas2, la producción de celulosa3, etanol, cerveza, vino y papel4, en la industria textil5, la industria alimentaria6 y en la agricultura como agentes de control biológico 7,8. Además del interés industrial en estas especies fúngicas, el creciente número de infecciones en humanos ha dado a algunas especies de Trichoderma el estatus de patógenos oportunistas9.

Trichoderma spp. crece rápidamente en cultivo, con colonias inicialmente blancas y algodonosas que se vuelven de color amarillo verdoso a verde oscuro10. Están adaptados a vivir en un amplio rango de condiciones de pH y temperatura, y las especies oportunistas son capaces de sobrevivir a pH y temperaturas fisiológicas y, por lo tanto, colonizar diferentes tejidos humanos 11,12,13. Es importante destacar que el aumento en la tasa de infección de Trichoderma spp. puede estar asociado con factores de virulencia, y estos no están bien estudiados. Además, los estudios centrados en la comprensión de la respuesta inmunitaria contra especies oportunistas de Trichoderma siguen siendo escasos.

Durante una infección, junto con los neutrófilos, los macrófagos representan la línea de defensa responsable de la fagocitosis y, por lo tanto, evitan el crecimiento y la colonización de patógenos en diferentes tejidos. Utilizando receptores de reconocimiento de patrones, como los receptores tipo Toll y los receptores de lectina de tipo C, los macrófagos fagocitan hongos y los procesan en fagolisosomas, promoviendo así un estallido respiratorio, la liberación de citoquinas proinflamatorias y la destrucción de los microorganismos fagocitados14. El mecanismo de fagocitosis, sin embargo, puede verse afectado y evadido por diferentes estrategias microbianas, como el tamaño y la forma de las células fúngicas; la presencia de cápsulas que dificultan la fagocitosis; disminuir el número de receptores inductores de fagocitosis; la remodelación de la estructura de las fibras de actina en el citoplasma; dificultar la formación de seudópodos; y el escape de fagosomas o fagolisosomas después del proceso de fagocitosis14.

Muchos patógenos, incluido Cryptococcus neoformans, utilizan los macrófagos como nicho para sobrevivir en el huésped, diseminarse e inducir la infección15. El ensayo de fagocitosis y aclaramiento se utiliza para evaluar la respuesta inmune frente a patógenos e identificar las estrategias microbianas empleadas para evadir el sistema inmune innato 15,16,17. Este tipo de técnica también se puede utilizar para examinar la cinética diferencial de la fagocitosis, la acidificación retardada del fagosoma y el estallido oxidativo que dan lugar a una reducción de la muerte fúngica18.

Se pueden utilizar diferentes métodos para evaluar la fagocitosis, la supervivencia fúngica y la evasión del proceso de maduración del fagosoma. Entre ellas se encuentran la microscopía de fluorescencia, que se utiliza para observar la fagocitosis, la ubicación celular y las moléculas producidas durante la fagocitosis19; citometría de flujo, que proporciona datos cuantitativos sobre la fagocitosis y se utiliza para evaluar los diferentes marcadores implicados en el proceso20,21; microscopía intravital, que se utiliza para evaluar la captura microbiana y la maduración del fagosoma22; fagocitosis mediada por anticuerpos, que se utiliza para evaluar la especificidad del proceso de fagocitosis de un patógeno23; y otros 24,25,26,27.

El protocolo presentado aquí emplea un método común, de bajo costo y directo que utiliza un microscopio óptico y un ensayo de crecimiento en placa para evaluar la fagocitosis y la eliminación de los conidios fúngicos. Este protocolo proporcionará a los lectores instrucciones paso a paso para realizar el ensayo de fagocitosis y aclaramiento utilizando macrófagos mononucleares derivados de sangre periférica humana expuestos a T. stromaticum. Los PBMC se utilizaron porque los conidios de Trichoderma se aplican como biocontrol contra fitopatógenos y biofertilizante para cultivos de plantas en todo el mundo y han causado varias infecciones humanas, llamadas Trichodermosis. Además, solo hay dos trabajos previos centrados en la interacción entre los conidios de Trichoderma y el sistema inmune humano, en los que examinamos los neutrófilos28 y la autofagia en macrófagos29. Este artículo muestra, en primer lugar, cómo se puede estudiar la fagocitosis de los conidios de T. stromaticum por macrófagos derivados de PBMC, y luego cómo se puede evaluar la viabilidad de los conidios engullidos utilizando técnicas simples basadas en microscopía. Este protocolo puede facilitar aún más las investigaciones sobre la respuesta inmunitaria asociada a macrófagos o los mecanismos relacionados con la modulación del sistema inmunitario.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Consideraciones éticas y sujetos humanos
Todos los experimentos con seres humanos descritos en este estudio fueron realizados de acuerdo con la Declaración de Helsinki y las leyes federales brasileñas y aprobados por el Comité de Ética de la Universidad Estadual de Santa Cruz (código de identificación del proyecto: 550.382/ 2014).

Se colectó sangre periférica humana de voluntarios sanos de la ciudad de Ilhéus, Bahía, Brasil, no expuestos a actividades ocupacionales relacionadas con el hongo estudiado. Se excluyeron las personas con afecciones médicas de salud reportadas o que usaban medicamentos. Todos los sujetos aceptaron voluntariamente participar y firmaron un consentimiento informado antes de su inclusión en este estudio.

1. Preparación de los reactivos y soluciones

NOTA: Prepare los siguientes reactivos y soluciones antes de continuar. Consulte la Tabla de materiales (TOM) para obtener la información sobre el reactivo y el proveedor de materiales.

  1. Prepare una solución salina estéril balanceada tamponada con fosfato 1x (PBS).
    NOTA: En este protocolo, no se utilizó PBS libre de endotoxinas.
  2. Prepare agar papa dextrosa (PDA) medio y vierta 20 ml en cada placa de Petri para el cultivo de T. stromaticum . Prepare seis placas con PDA para cada donante y use una placa para cada condición: 3 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h y 120 h. Además, utilice tres placas para cada control: tres para el control de Trichoderma y tres para el control del medio R10. Utilice placas de Petri de 60 mm x 15 mm o 100 mm x 15 mm para una recuperación óptima de los conidios.
  3. Esterilizar glicerol al 100%.
  4. Preparar un medio R10 para el cultivo celular: medio RPMI suplementado con un 10% de suero fetal bovino y un 1% de antibiótico (penicilina/estreptomicina).
  5. Esterilizar el agua destilada para la lisis celular.
  6. Prepare agua a pH 7.0 para el proceso de coloración.
    NOTA: Si es necesario, ajuste el pH con un medidor de pH y soluciones de 0,1 M/L de NaOH y 0,1 M/L de HCl.
  7. Esterilizar cubreobjetos redondos de vidrio (13 mm) y pinzas.

2. Cultivo y procesamiento de Trichoderma stromaticum

  1. Preparación de una cepa madre (M1) de T. stromaticum:
    NOTA: Se requiere una cepa madre (M1) para garantizar que todos los experimentos se realicen a partir del cultivo de la misma generación fresca (F1).
    1. Cultivar un inóculo de T. stromaticum en placas de Petri con PDA a 28 °C en la oscuridad durante 7-10 días hasta que se observen los conidios y el cultivo se vuelva verde.
    2. Lavar el cultivo de T. stromaticum. Añadir 3-5 mL de PBS a la superficie de cultivo con una pipeta. Recoja el PBS de la placa y vuelva a dispensarlo sobre el cultivo para eliminar gradualmente los conidios con la pipeta. Repita este proceso tantas veces como sea necesario hasta que la suspensión se vuelva verde oscuro.
      NOTA: Alternativamente, se sugiere un lavado suave del cultivo agregando 3-5 mL de PBS a la placa seguido de un movimiento circular hasta que la suspensión se vuelva verde para recuperar los conidios. Con el pipeteo repetido, se pueden recolectar más conidios.
    3. Transfiera la suspensión recuperada de la placa a un tubo estéril de 15 ml con una pipeta. Repita los pasos 2.1.2-2.1.3 tantas veces como sea necesario para obtener más conidios.
    4. Centrifugar la suspensión a 1.160 x g durante 5 min a 12 °C, y resuspender el pellet en 5 mL de PBS. Repita este paso (2.1.4) tres veces para obtener una suspensión sin hifas.
      NOTA: Para resuspender el gránulo correctamente, después de la centrifugación, se recomienda un breve vórtice.
    5. Vuelva a suspender el gránulo final en 2-3 ml de PBS y cuente los conidios en una cámara de Neubauer utilizando una dilución de 1:100 o 1:1.000.
      NOTA: En condiciones óptimas, se puede recuperar una concentración final de 2 x 108 conidios/mL del cultivo. La evaluación de la viabilidad de los conidios mediante el método de exclusión de azul de tripano es opcional.
    6. Alícuota de la suspensión en tubos estériles de 1,5 mL añadiendo 0,5 mL de la suspensión de conidios (del paso 2.1.5) a cada tubo. A continuación, añadir 0,5 ml de glicerol estéril al 100% para obtener las existencias de M1. Vórtice brevemente, identifique los tubos y guárdelos a -20 °C o -80 °C.
  2. Cultivo de T. stromaticum y obtención de conidios para el experimento
    1. Placa de 10 μL de la suspensión M1 (preparada en el paso 2.1) en PDA a 28 °C en la oscuridad durante 7-10 días hasta que se observen los conidios y el cultivo se vuelva verde para obtener la nueva generación de F1.
      NOTA: Para asegurar un nuevo cultivo de T. stromaticum para el experimento, evalúe el tiempo requerido para el crecimiento del hongo y el tiempo requerido para la diferenciación de macrófagos.
    2. Recoja los conidios, repitiendo los pasos 2.1.2-2.1.4.
    3. Vuelva a suspender el gránulo final en 2-3 ml de PBS. Evalúe la viabilidad de los conidios utilizando el método de exclusión de azul de tripán, o cuente los conidios como se menciona en el paso 2.1.5.

3. Aislamiento de células mononucleares de sangre periférica (PBMC)

NOTA: Las PBMC se obtienen por el método de barrera de densidad utilizando una solución de polisacarosa de densidad 1.077 g/mL30.

  1. Alícuota 15 mL de la solución de polisacarosa a un tubo de 50 mL por cada muestra de donante que se recogerá.
  2. Recolectar 20 ml de sangre de cada donante usando tres o cuatro tubos de EDTA. Reclutar un mínimo de cuatro donantes por experimento. No junte la sangre de los donantes; En su lugar, use cada muestra por separado como una réplica biológica. Para cada donante, transfiera la sangre a un tubo de 50 mL y agregue PBS para obtener un volumen final de 35 mL.
  3. Transfiera la suspensión de sangre (paso 3.2) lentamente a lo largo de la pared del tubo que contiene la solución de polisacarosa (paso 3.1) para formar una suspensión bifásica.
    NOTA: Para evitar que la sangre se mezcle con la solución de polisacarosa, agregue la sangre lentamente. Se recomienda el uso de un mínimo de 7 mL de sangre de cada donante para el aislamiento de PBMC.
  4. Centrifugar inmediatamente el tubo que contiene la suspensión bifásica a 1.600 x g durante 30 min a 24 °C. Programe la centrifugación de los PBMC: utilice la aceleración 1 y la desaceleración 0 para evitar una parada brusca de la centrifugación.
  5. Observe la formación de un anillo blanco que contiene los PBMC después de la centrifugación. Los glóbulos rojos y los granulocitos residen en la capa inferior, la siguiente capa contiene la solución de polisacarosa y los PBMC residen en el anillo blanco entre la solución de polisacarosa y el plasma (capa superior). Recoja el anillo blanco aspirando suavemente con una pipeta o una pipeta Pasteur estéril para no atrapar glóbulos rojos, plasma o solución de polisacarosa, y transfiéralo a un tubo de 15 ml.
  6. Añadir PBS al tubo de 15 mL que contiene las PBMC para obtener un volumen final de 10 mL. Homogeneizar la suspensión y centrifugar el tubo a 1.600 x g durante 30 min a 24 °C.
  7. Lavar las células tres veces a 1.600 x g durante 5 min a 24 °C con 10 mL de PBS. A continuación, vuelva a suspender el gránulo final en 2 ml de medio R10.
  8. Evaluar la viabilidad celular utilizando el método de exclusión de azul de tripano y contar las células en una cámara de Neubauer.

4. Cinética de fagocitosis

NOTA: Los macrófagos mononucleares de sangre periférica humana se tratan con conidios de T. stromaticum en una multiplicidad de infección (MOI) de 1:10 o solo en medio R10 como control. La multiplicidad de infección (MOI) representa la proporción de los agentes infecciosos añadidos a las dianas de infección y se presenta como números absolutos: MOI = agentes:dianas31. Aquí, usamos 1 conidio de T. stromaticum (agente) para 10 macrófagos (dianas). Luego, las células se incuban a 37 °C y 5% de CO2 durante diferentes períodos de tiempo (3 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h y 120 h). A continuación, se utiliza un cubreobjetos de vidrio redondo para visualizar los macrófagos adherentes implicados en el proceso de fagocitosis bajo un microscopio. Se proporciona una figura de diseño experimental (Figura 1).

NOTA: Se sugiere el uso de placas de 24 pocillos.

  1. Tratamiento de macrófagos de origen humano con conidios de T. stromaticum
    1. Agregue un cubreobjetos de vidrio redondo estéril (13 mm) a cada pocillo con pinzas estériles.
    2. Ajustar el volumen de la suspensión celular obtenida en los pasos 3.7-3.8 a la placa 8 x 105 celdas por pocillo a un volumen final de 1 mL con medio R10. Utilice un microscopio invertido para evaluar la morfología celular.
      NOTA: Las células deben estar suspendidas en el medio y tener una morfología redondeada.
    3. Incubar las células a 37 °C bajo una atmósfera de CO2 al 5% durante 7 días, y sustituir el medio por medio R10 fresco cada 2 días para la diferenciación de los monocitos en macrófagos32. Observar la morfología celular con un microscopio invertido. Los macrófagos presentarán morfología fusiforme, con formas aplanadas y extendidas; También se puede observar un aumento de la relación citoplasmática y la presencia de seudópodos. Busca macrófagos mononucleares adherentes.
      NOTA: Una proporción muy pequeña de monocitos indiferenciados puede permanecer suspendida en el medio.
    4. Retire el medio de cada pocillo con una pipeta y lave las células con 1 ml de PBS para eliminar los residuos y las células no adherentes.
    5. Utilizar la suspensión preparada en el paso 2.2 para preparar una nueva suspensión de conidios de T. stromaticum a una concentración final de 8 x 104 conidios/ml en medio R10.
    6. Añadir 1 ml de la suspensión de conidios preparada en el paso 4.1.5 a cada pocillo de tratamiento (3 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h y 120 h) para obtener un MOI de 1:10. A los controles, agregue solo 1 ml de medio R10 al pocillo.
    7. Desafiar a los macrófagos durante 3 h con conidios de T. stromaticum a 37 °C bajo una atmósfera de 5% de CO2 . Después de 3 h, retire el medio y lave las células para eliminar los conidios no fagocitados.
    8. Agregue 1 mL de medio R10 a cada pocillo e incube la placa durante diferentes tiempos (3 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h y 120 h) a 37 °C bajo una atmósfera de 5% de CO2 .
  2. Coloración y análisis
    1. Retire el medio de cada pocillo después de que se complete la incubación correspondiente (paso 4.1.8) y agregue 1 ml de PBS a ese pocillo.
    2. Retire los cubreobjetos redondos de vidrio de los pocillos con pinzas estériles y una aguja para colorear con un kit de tinción.
      NOTA: Alternativamente, la tinción se puede realizar con la tinción de May Grünwald-Giemsa33.
    3. A cada uno de los cubreobjetos redondos de vidrio, agregue fijador de manchas (5 s), Tinte 1 (5 s), Tinte 2 (2 s) y agua tamponada pH 7.0 (5 s), que son los componentes del kit de tinción. Espere hasta que estén secos y fije los cubreobjetos en un portaobjetos de vidrio con un agente de montaje.
    4. Cuantificar el resultado: Cuente un total de 100 macrófagos (Mø) para cada condición de tiempo. Usando un microscopio óptico, cuente el número de macrófagos con conidios fagocitados usando un objetivo de 100x y aceite de inmersión (ecuación [1]).
      figure-protocol-1 (1)
    5. Obtener el número de conidios fagocitados por macrófago: Correlacionar los conidios presentes en 100 macrófagos divididos por el número de macrófagos con al menos un conidio fagocitado (ecuación [2])34.
      figure-protocol-2 (2)
      NOTA: Para evaluar y contar los conidios, se puede utilizar el software ImageJ35.
    6. Fotografíe la fagocitosis de cada muestra y condición de tiempo utilizando objetivos de 40x y 100x para presentar los resultados.

figure-protocol-3
Figura 1: Representación esquemática del ensayo de fagocitosis y viabilidad conidial utilizando macrófagos mononucleares derivados de sangre periférica humana. (1-10) Ensayo de fagocitosis: El T. stromaticum debe cultivarse en PDA, y los conidios se recuperan lavando la placa con PBS. Las PBMC deben aislarse por el método de barrera de densidad utilizando el protocolo descrito, cultivarse en placas de 24 pocillos con cubreobjetos de vidrio redondos estériles durante 7 días para su diferenciación en macrófagos, y luego tratarse con un MOI de 1:10 con diferentes intervalos de tiempo. Los cubreobjetos redondos de vidrio se retiran y se tiñen con el kit de tinción, y los resultados se analizan mediante microscopía óptica. (1-8,11-13) Ensayo de viabilidad de conidios: Después del aislamiento, los PBMC se cultivan en placas de 24 pocillos sin cubreobjetos de vidrio redondos durante 7 días para su diferenciación en macrófagos y luego se tratan con un MOI de 1:10 durante diferentes intervalos de tiempo. Las células deben ser lisadas por incubación con agua destilada; luego se centrifuga la suspensión y luego el gránulo resuspendido se recubre en PDA para analizar la cinética de crecimiento de Trichoderma. Esta figura fue diseñada a partir de una base de datos de imágenes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

5. Ensayo de viabilidad de conidios después de la fagocitosis

NOTA: Se proporciona una figura de diseño experimental (Figura 1).

NOTA: Utilice placas de 24 pocillos.

  1. Desafía a los macrófagos de origen humano con conidios de T. stromaticum .
    1. Repita los pasos 4.1.2-4.1.8 para diferenciar los monocitos y tratar los macrófagos con conidios de T. stromaticum .
      NOTA: No utilice cubreobjetos de vidrio redondos en los pozos. Utilice los mismos intervalos de tiempo utilizados para analizar la cinética de la fagocitosis de modo que la fagocitosis pueda correlacionarse con la viabilidad de los conidios.
    2. Evaluar el impacto del medio R10 sobre el crecimiento de T. stromaticum utilizando pocillos con la suspensión preparada en el paso 4.1.5 (medio R10 + conidios) como control.
  2. Ensayo de viabilidad de conidios
    1. Retire el medio después de cada período de incubación (3 h, 24 h, 48 h, 72 h, 96 h y 120 h) y lave las células dos veces con PBS para eliminar los conidios que no han sido fagocitados.
      NOTA: El control que contiene medio R10 + conidios no debe lavarse.
    2. Añadir 0,5 mL de agua destilada estéril a cada pocillo e incubar la placa a 37 °C y 5% de CO2 durante 30 min. Después de este tiempo, observe la morfología celular bajo un microscopio invertido para asegurarse de que las células hayan sido lisadas.
    3. Recoja la suspensión y transfiérala a tubos de 1,5 ml. Centrifugar la suspensión con una mini centrífuga a 6.000 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
    4. Deseche el sobrenadante con cuidado, vuelva a suspender el gránulo en 10 μL de agua destilada estéril e inocule 10 μL de la suspensión en la placa que contiene PDA a 28 °C en la oscuridad.
    5. Preparar un control positivo para el crecimiento de T. stromaticum : Utilice la suspensión de conidios de T. stromaticum (paso 2.2) para preparar una nueva suspensión con una concentración final de 8 x 106 conidios/mL. Placa de 10 μL de esta suspensión en PDA a 28 °C en la oscuridad.
      NOTA: 10 μL de esta suspensión contendrán el mismo número de conidios (8 x 104) que se utilizaron para infectar los macrófagos mononucleares derivados de la sangre. La diferencia entre este control positivo y el mencionado en el paso 5.1.2 es que el control mencionado anteriormente en el paso 5.1.2 se utiliza para evaluar el posible impacto del medio R10 en el crecimiento de Trichoderma durante el tiempo de fagocitosis. Este control positivo en el paso 5.2.5 utilizando la suspensión de conidios de T. stromaticum recolectados en PBS representa un control para el crecimiento de Trichoderma sin la influencia del medio R10 para reflejar cómo crece el hongo de forma natural. Con este control, es posible evaluar si el medio R10 influye en el crecimiento de Trichoderma .
    6. Observe la cinética de crecimiento de T. stromaticum en PDA todos los días y fotografíe el cultivo.
    7. Análisis: Se pueden utilizar dos puntos para evaluar los resultados: 1) el tiempo (en días) requerido para que el cultivo ocupe toda la placa de cultivo, y 2) el tiempo (en días) hasta la aparición de la pigmentación verde característica de los conidios de T. stromaticum en cultivo.

6. Análisis estadístico

  1. Utilice una prueba de Kruskal-Wallis para determinar diferencias estadísticamente significativas entre los 8 grupos/tratamientos. Considere p < 0,05 como estadísticamente significativo. Todos los datos se presentan como medias ± desviación estándar (DE). En las figuras, # indica significación estadística en p < 0,05.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La técnica que implica la fagocitosis de conidios fúngicos por macrófagos es ampliamente utilizada para estudios que evalúan la modulación de las respuestas inmunes contra hongos. Utilizamos la fagocitosis de los conidios de T. stromaticum para evaluar la viabilidad de los conidios después de la fagocitosis, ya que la evasión de la fagocitosis y el escape de los fagosomas son mecanismos de virulencia fúngica. Los investigadores deben realizar estas técnicas como uno de los primeros ensayos cuando se investiga un...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para varios patógenos fúngicos, incluyendo Aspergillus fumigatus, Cryptococcus, Candida albicans y otros, la fagocitosis conidial o de levadura es un proceso clave que permite la investigación de los eventos citoplasmáticos y moleculares en las interacciones macrófago-patógeno, así como la determinación del momento de muerte de los conidios internalizados 14,39,40. La fagocitosis es el proceso clave en...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo contó con el apoyo de las siguientes instituciones financieras brasileñas: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) con subvenciones RED0011/2012 y RED008/2014. U.R.S., J.O.C. y M.E.S.M. reconocen la beca otorgada por la Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) y la FAPESB, respectivamente.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Tubos de centrífuga de 15 mLCorningCLS431470tubos de centrífuga de 15 mL, polipropileno, fondo cónico con tapa, estéril individualmente
Placa de cultivo celular de fondo plano de 24 pocillosKasviK12-024Fabricado en poliestireno con identificación alfanumérica; La placa de cultivo celular está libre de ADNasa, RNasa y pirógenos y libre de sustancias citotóxicas; Esterilizado por radiación gamma;
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GlicerolMerck 24900988El agente crioprotector glicerol se utiliza para congelar células y esporas
Histopaque-1077solución de polisacarosa
Imagen J  Software de análisis
de imágenes Portaobjetos de microscopíaPrecision7105Portaobjetos para Microscopía 26 x 76 mm Mate Lapeado Espesor 1,0 a 1,2 mm. Fabricado en vidrio óptico especial y empaquetado con papel de seda Divisor de alta calidad Transparencia libre de imperfecciones
Mini centrífugaPrismaC1801La mini centrífuga Prism fue diseñada para ser extremadamente compacta con un tamaño excepcionalmente pequeño. Incluye 2 rotores de liberación rápida intercambiables que giran hasta 6000 rpm. Un freno electrónico proporciona una desaceleración rápida y la tapa de apertura automática permite un fácil acceso a la muestra, lo que reduce el tiempo de manipulación.
Cámara de NeubauerKasviK5-0011La cámara de recuento de Neubauer se utiliza para contar células u otras partículas en suspensión.
Ayuno panóptico Laborclin620529el panóptico fast c de Laborclin es un kit para la tinción rápida en hematología
Solución de penicilina/estreptomicina - 10.000ULGC- Biotecnología BR3011001antibiótico se utiliza con el fin de evitar una posible contaminación por manipulación externa al flujo laminar.
Placa de Petri 90 x 15 mm SmoothCralplast18248Placa de Petri desechable; Fabricado en poliestireno (PS) de alta transparencia; fondo plano; Suave; Tamaño: 90 x 15 mm.
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)thermo fisher Scientific10010001PBS es una solución salina a base de agua con una formulación simple. Es isotónico y no tóxico para la mayoría de las células. Incluye cloruro de sodio y tampón de fosfato y está formulado para prevenir el choque osmótico mientras mantiene el equilibrio hídrico de las células vivas.
Pipeta Pasteur 3 mL estérilAccumaxAP-3-B-SPIPETA ESTÉRIL ACCUMAX PASTEUR 3 ML con capacidad de 3 mL, fabricada en polietileno transparente de baja densidad (LDPE) y estéril individualmente
Centrífuga refrigeradaThermo ScientificTS-HM16RLa centrífuga refrigerada Thermo Scientific Heraeus Megafuge 16R es una centrífuga refrigerada con un panel de control fácil de usar que facilita el preajuste de la velocidad, el valor RCF, tiempo de ejecución,  temperatura y perfil de funcionamiento. El Megafuge 16R puede alcanzar velocidades máximas de  15.200 RPM y RCF máximo de 25.830 x g.
RPMI-1640 MedioMerckMFCD00217820Modificación HEPES, con L-glutamina y 25 mM HEPES, sin bicarbonato de sodio, en polvo, apto para cultivo celular
Las micropipetas monocanalEppendorfZ683809Las micropipetas monocanal se utilizan para transferir y medir con precisión cantidades muy pequeñas de líquidos.
punta para micropipetacorning4894capacidad de 10 y micro; L y 1.000 µ L
Microscopio invertido triocularLABOMEDVU-7125500permite observar células en el interior de tubos y botellas, sin tener que abrirlos, evitando así problemas de contaminación.
El esterilizable en autoclave

References

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