Artículo de método

Aislamiento de células endoteliales linfáticas dérmicas murinas

DOI:

10.3791/65393

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21 de julio de 2023

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1Department of Pharmaceutical Sciences, School of Pharmacy, Texas Tech University Health Sciences Center, 2Laboratory of Molecular Pharmacology, Department of Pharmacy, University of Patras, 3Division of Flow Cytometry and Division of MDx & Life Sciences, SB BioAnalytica, 4Basic Sciences Laboratory, Department of Physiotherapy, University of Peloponnese, 5Division of Hematology, Department of Internal Medicine, Medical School, University of Patras, 6School of Basic Pharmaceutical and Toxicological Sciences, College of Pharmacy, University of Louisiana at Monroe

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

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Este artículo describe un método para el aislamiento basado en perlas magnéticas de células endoteliales murinas de capilares linfáticos dérmicos. Las células endoteliales linfáticas aisladas se pueden utilizar para experimentos in vitro posteriores y análisis de expresión de proteínas.

Resumen

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El sistema linfático participa en la regulación de la vigilancia inmunitaria, la absorción de lípidos y el equilibrio de líquidos tisulares. El aislamiento de células endoteliales linfáticas murinas es un proceso importante para la investigación linfática, ya que permite la realización de experimentos in vitro y bioquímicos en las células aisladas. Además, el desarrollo de la tecnología Cre-lox ha permitido la deficiencia de genes específicos de tejido que no se pueden abordar globalmente, lo que ha llevado a la determinación precisa de su papel en los tejidos estudiados. La disección del papel de ciertos genes en la fisiología linfática y la fisiopatología requiere el uso de promotores linfáticos específicos y, por lo tanto, la verificación experimental de los niveles de expresión de los genes objetivo.

Los métodos para el aislamiento eficiente de células endoteliales linfáticas de ratones salvajes o transgénicos permiten el uso de ensayos ex vivo e in vitro para estudiar los mecanismos que regulan las funciones linfáticas y la identificación de los niveles de expresión de las proteínas estudiadas. Hemos desarrollado, estandarizado y presentado un protocolo para el aislamiento eficiente de células endoteliales linfáticas dérmicas murinas (DLECs) mediante purificación magnética de perlas basadas en la expresión de LYVE-1. El protocolo descrito tiene como objetivo equipar a los investigadores con una herramienta para comprender mejor y dilucidar los actores importantes de las funciones de las células endoteliales linfáticas, especialmente en instalaciones donde no se dispone de equipos de clasificación de células activadas por fluorescencia.

Introducción

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El sistema linfático desempeña un papel fundamental en la fisiología humana. Se considera un factor homeostático vital, que facilita funciones importantes, como el mantenimiento del equilibrio de líquidos tejido-plasmático, la vigilancia inmunitaria y la absorción de lípidos1, así como funciones recientemente identificadas, como la capacidad de reparación del corazón2 y la capacidad regenerativa del hueso y la hematopoyesis3. A pesar del importante papel del sistema linfático, varios aspectos del papel de los linfáticos, así como los mecanismos moleculares que gobiernan ciertos parámetros fisiológ....

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Protocolo

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Los estudios en animales se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad Tecnológica de Texas (TTUHSC) para los experimentos en TTUHSC y por la Administración Veterinaria de la Prefectura de Grecia Occidental de acuerdo con la Directiva 2010/63 para los experimentos en la Universidad de Patras. Siga diligentemente las normas de eliminación de residuos al deshacerse de los materiales de desecho de animales.

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Resultados

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El método se desarrolló para identificar la expresión proteica de una pequeña GTPasa, RhoA, cuyo gen codificante se floxó en ambos alelos y se eliminó bajo el efecto del promotor endotelial específico linfático inducible por tamoxifeno Prox1-CreERT2 18. Las LEC aisladas pueden cultivarse hasta durante cuatro generaciones, después de las cuales se vuelven senescentes. Han sido congelados, descongelados y estimulados con éxito con angiopoyetina-2. Debido al número limitado de pas.......

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Discusión

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El sistema linfático es un importante regulador de la función homeostática del organismo, siendo las funciones más importantes el mantenimiento del plasma líquido, la eliminación de subproductos del metabolismo celular y moléculas tóxicas, la absorción de lípidos y el tráfico de células inmunitarias 1,19. La identificación de marcadores apropiados ha provocado una explosión de nuevos datos en el campo linfático, revelando nuevas funciones de la vasculatura linfát.......

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Divulgaciones

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Los autores declaran no tener intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

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Este trabajo fue apoyado por la Fundación Helénica para la Investigación y la Innovación (00376), los Institutos Nacionales de Salud, el Instituto Nacional del Cáncer (NCI) [subvención R15CA231339], la subvención de la Oficina de Ciencias de la Facultad de Farmacia del Centro de Ciencias de la Universidad Tecnológica de Texas (TTUHSC) (a C.M.M.), y por la financiación inicial de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Louisiana Monroe. los Institutos Nacionales de Salud (NIH) a través del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales [Subvención P20 GM103424-21] y el Subprograma de Competitividad en Investigación (RCS) de la Junta de Regentes de Luisiana a tr....

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0.2 μ m Filtros de jeringaFisher Scientific09-719C
100 mm Platos de cultivo de tejidosFisher ScientificFB012924
60 mm Platos de cultivo de tejidosFisher ScientificFB012921
Cortadora de pelo animalWahl
Solución antibiótica-antimicótica 100xPinza15240-062
Fine Science Tools11992-20
Albúmina sérica bovinaSigma-AldrichA4919
Colador de células 40 μ mFisher Scientific542040
Filtro de celdas 70 μ mFisher Scientific542070
Incubadora
Colágeno I, Alta Concentración Cola de RataCorning354249diluido en 0,02 M Ácido Acético en H2O
Colagenasa Tipo IILife Technologies17101-015
DispasaLife Technologies17105-041
DMEMFisher Scientific11-995-073
Solución de ADNasa I (2.500 U/mL)Thermo Scientific90083
Dynal MPC-L Concentrador de partículas magnéticasInvitrogen120-21D
EDTASigma-Aldrich3690
Medio base de crecimiento de células endoteliales & Suplemento (medio LEC)R& D SystemsCCM027
Cámara de eutanasiaEuthanex Corporation
Pinzas finasHerramientas de ciencia fina11255-20
Tijeras finas-afiladasHerramientas de ciencia fina14060-10
FITC anti-ratón F4/80 AnticuerpoBiolegend123107
Cabra Anti-Conejo IgG Cuentas MagnéticasNew England BiolabsS1432S
LARC-A E-Z Cámara de inducción de anestesiaEuthanex Corporation
MagnaBind Goat Anti-Rabbit IgG BeadsThermo Scientific21356
Solución de paraformaldehído al 4% en PBSFisher ScientificAAJ19943K2
solución salina tamponada con fosfato (PBS)Fisher ScientificSH30256FS
Rabbit Anti-Mouse LYVE-1ReliaTech GmbH103-PA50
Incubadora giratoria/agitadora
Tubos de polipropileno de fondo redondoFiltros de jeringa 352063
Corning w 0.2 μ mPoros Fisher Scientific09-719C
Tripsina-EDTAFisher Scientific25-300-120
roma Fisher Scientific de CO2

Referencias

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  1. Oliver, G., Kipnis, J., Randolph, G. J., Harvey, N. L. The lymphatic vasculature in the 21(st) century: novel functional roles in homeostasis and disease. Cell. 182 (2), 270-296 (2020).
  2. Liu, X., et al. Lymphoangiocrine signals promote cardiac growth and repair....

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