Un modelo de trasplante de corazón de rata heterotópico neonatal para el estudio de la transición endotelial a mesenquimal

La fibroelastosis endocárdica (EFE), definida por la acumulación de colágeno y fibras elásticas en el tejido subendocárdico, se presenta como un endocardio engrosado nacarado u opaco; La EFE experimenta un crecimiento más activo durante el período fetal y la primera infancia¹. En un estudio de autopsia, el 70% de los casos con síndrome del corazón izquierdo hipoplásico (HLHS) se asociaron con la presencia de EFE².

Las células que expresan marcadores de fibroblastos son la principal población celular en EFE, pero estas células también expresan concomitantemente marcadores endoteliales endocárdicos, lo que es una indicación del origen de estas células EFE. Nuestro grupo estableció previamente que el mecanismo subyacente de la formación de EFE implica un cambio fenotípico de células endoteliales endocárdicas a fibroblastos a través de la transición endotelial-mesenquimal (EndMT)³. La MTenda se puede detectar mediante tinción inmunohistoquímica doble para marcadores endoteliales como el grupo de diferenciación (CD) 31 o los marcadores de endotelio vascular (VE)-cadherina (CD144) y fibroblastos (p. ej., actina del músculo liso alfa, α-AME). Además, también establecimos previamente el papel regulador de la vía TGF-ß en este proceso con la activación de los factores de transcripción SLUG, SNAIL y TWIST³.

La MTenda es un proceso fisiológico que ocurre durante el desarrollo cardíaco embrionario y conduce a la formación de los tabiques y las válvulas a partir de las almohadillas endocárdicas⁴, pero también causa fibrosis orgánica en la insuficiencia cardíaca, la fibrosis renal o el cáncer y desempeña un papel clave en la aterosclerosis vascular 5,6,7,8. La EndMT en la fibrosis cardíaca se regula principalmente a través de la vía TGF-β, como hemos reportado nosotros y otros ^3,9. Se han descrito diversos estímulos para inducir la MTenda: inflamación 10, hipoxia¹¹, alteraciones mecánicas 12 y alteraciones del flujo, incluyendo alteraciones del flujo sanguíneo intracavitario 13, y la MTenda también puede ser consecuencia de una enfermedad genética ¹⁴.

Este modelo animal se desarrolló utilizando los componentes clave del desarrollo de EFE cardíaca, que son la inmadurez y las alteraciones del flujo sanguíneo intracavitario, específicamente el estancamiento del flujo. La inmadurez se cumplió utilizando corazones de ratas neonatos como donantes, ya que se sabe que las ratas neonatas son inmaduras en su desarrollo inmediatamente después del nacimiento. El trasplante cardíaco heterotópico ofrecía la provisión de restricción del flujo intracavitario¹⁵.

Desde un punto de vista clínico, este modelo animal permite investigar mejor el impacto de la MTenM en el ventrículo izquierdo (VI) en crecimiento. La restricción del crecimiento impuesta al corazón fetal y neonatal a través de la formación de EFE inducida por EndMT¹⁶ impide que los pacientes con obstrucciones del tracto de salida del ventrículo izquierdo (VOVE), como la estenosis aórtica crítica congénita y el síndrome del corazón izquierdo hipoplásico (HLHS), puedan realizar una reparación quirúrgica biventricular anatómica curativa¹⁷. Este modelo animal facilita el estudio de los mecanismos celulares y la regulación de la formación de tejidos a través de la EndMT y permite probar opciones de tratamiento farmacológico ^3,18.

La ecocardiografía transabdominal se utiliza para monitorizar la viabilidad del injerto, la contractilidad y la permeabilidad de las anastomosis. Después de la eutanasia, la formación de EFE se puede observar macroscópicamente dentro de los 3 días posteriores al trasplante. El tejido EFE presenta las mismas características histopatológicas que el tejido EFE humano de pacientes con OVCE.

Por lo tanto, este modelo animal, aunque desarrollado para uso pediátrico en el espectro de HLHS, se puede aplicar en el estudio de diversas enfermedades basadas en el mecanismo molecular de EndMT.

Todos los procedimientos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con el Consejo Nacional de Investigación. 2011. Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio: Octava Edición. Los protocolos con animales fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Boston Children's Hospital.

Antes de la cirugía, todos los instrumentos quirúrgicos se esterilizan en autoclave con vapor y se prepara como solución cardiopléjica el tampón Krebs-Henseleit modificado, con una concentración final de 22 mmol/L KCl (Tabla 1). La solución se esteriliza con filtro y se almacena a 4 °C durante la noche. Se requiere un microscopio quirúrgico (12,5x) para el procedimiento de trasplante de corazón de rata neonatal heterotópico.

1. Preparación y anestesia

1. Utilice ratas Lewis macho/hembra con un peso de alrededor de 150 g (5-6 semanas de edad) como recipientes.
2. Para empezar, afeita generosamente el abdomen de la rata con una navaja.
3. Coloque a la rata en una cámara de isoflurano y abra el flujo de oxígeno a 2 L/min con isoflurano al 2% hasta que el animal esté debidamente sedado pero aún respire espontáneamente. Inyectar 45 mg/kg de ketamina y 5 mg/kg de xilacina por vía intraperitoneal (IP), así como 300 U/kg de heparina. Confirme la anestesia adecuada con una prueba de pellizco en el dedo del pie.
   NOTA: Monitorizar cuidadosamente la respiración espontánea y la frecuencia cardíaca a través de la palpación del tórax para asegurar un estado hemodinámico estable durante todo el proceso.
4. Para la intubación, coloque la rata en un estante oblicuo (Figura 1), asegure los dientes frontales con una cuerda y coloque la cabeza mirando hacia el cirujano.
5. Coloque la luz en la parte exterior del cuello en el área de las cuerdas vocales, agarre la lengua con dos dedos y empújela ligeramente hacia arriba y hacia la izquierda para proporcionar una visión óptima para la intubación. Use una cánula de 18 g y 2 pulgadas para una rata de 100-150 g. Asegure el tubo intratraqueal con cinta adhesiva.
   NOTA: Se recomiendan lupas quirúrgicas con un aumento de 3,5x para la intubación.
6. Conecte la cánula de intubación al ventilador para animales pequeños y ajuste la configuración de acuerdo con las instrucciones del fabricante según el tamaño del animal.
   NOTA: Utilice los siguientes ajustes para una rata de 150 g: modo de volumen; frecuencia respiratoria, 55/min; volumen corriente, 1,3 mL 50 % I/E, pero esto se puede ajustar adecuadamente según sea necesario. Asegure un movimiento torácico bilateral e igualitario adecuado, y administre isoflurano continuamente al 0,5 % al 2 % a través del ventilador.
7. Coloque a la rata sobre una almohadilla térmica (para mantener la temperatura corporal normal) en posición supina con la cola mirando hacia el cirujano. Esterilizar el abdomen tres veces con solución de betadine y etanol al 70% alternativamente. Administre lubricante para los ojos y cubra a la rata con un paño quirúrgico estéril, dejando el abdomen descubierto.

2. Preparación quirúrgica y trasplante heterotópico del corazón del donante neonatal en la rata receptora

1. Realice una laparotomía de la línea media con un bisturí de 15 hojas para la incisión en la piel y use tijeras para abrir la pared abdominal anterior, seguida de una exposición roma de la aorta abdominal retroperitoneal y la vena cava inferior (VCI) con aplicadores de punta de algodón.
2. Moviliza los intestinos (incluido el colon descendente) y colócalos hacia el cuadrante superior derecho. Cubra los intestinos con una gasa tibia empapada en solución salina. Utilice retractores para asegurar una exposición óptima de la VCI y la aorta abdominal.
3. Realizar disección roma de la VCI infrarrenal y de la aorta abdominal hacia la bifurcación. Ligar todas las arterias y venas que se ramifican infrarrenales (p. ej., arteria mesentérica inferior y arterias de ganglios linfáticos) con una sutura de nailon 10-0.
   NOTA: Existe una gran variabilidad en la anatomía de estas ramas laterales. Controlar visualmente el pulso y la frecuencia cardíaca de la aorta cuando no se dispone de otro control hemodinámico. Evalúe la profundidad adecuada de la anestesia cada 15 minutos a través de una prueba de pellizco en los dedos de los pies. Ajuste la concentración de isoflurano en consecuencia.
4. Después de que se haya extraído el corazón del donante de una rata neonata, se entregará el corazón extirpado en condiciones estériles en un recipiente quirúrgico que contenga tampón Krebs-Henseleit al campo quirúrgico. Irrigar el corazón del donante de forma intermitente con una solución cardiopléjica helada.
   NOTA: Cuando se dispone de un segundo cirujano, el corazón debe prepararse al mismo tiempo, ya que un segundo cirujano reduce el tiempo total de anestesia del animal receptor y el tiempo de isquemia del corazón donante. Cuando no haya un segundo cirujano disponible, cubra el abdomen del receptor con solución salina tibia y controle al animal durante el procedimiento de recolección.
5. Aplique cuatro pinzas vasculares atraumáticas pequeñas en los segmentos distal y proximal de la aorta infrarrenal y la VCI. Si es necesario, ocluya temporalmente un vaso renal desfavorable con una sutura de seda 7-0 y suelte la sutura después del procedimiento. Colocar una sutura de nylon 10-0 verticalmente en la pared anterior de la aorta para facilitar la aortotomía. Realizar una aortotomía con dos pequeños cortes horizontales (en forma de cuña) con unas microtijeras tirando ligeramente hacia arriba de la sutura.
   NOTA: Para eliminar cualquier coágulo de sangre, se recomienda enjuagar la luz aórtica con solución salina heparinizada.
6. Coloque el corazón del donante en el lado izquierdo (desde la perspectiva del animal) de la aorta y asegure la aorta infrarrenal del receptor y la aorta ascendente del donante de extremo a lado en las posiciones de las 12 en punto y las 6 en punto de la aortotomía con suturas. Continúe con la tercera y cuarta sutura en las posiciones de las 3 en punto y las 9 en punto, volteando suavemente el corazón hacia el lado derecho de la aorta después de la tercera sutura. Completar la anastomosis arterial añadiendo una o dos suturas a cada espacio intersectorial.
   NOTA: Se debe tener cuidado de evitar tocar la aorta ascendente del donante o la aorta abdominal del receptor con fórceps al crear la anastomosis para evitar daños tisulares.
7. Gire la rata en sentido contrario a las agujas del reloj, con la cabeza mirando hacia la mano izquierda del cirujano. Mueva la aorta del donante hacia el lado izquierdo de la aorta abdominal para permitir una visión óptima de la VCI.
8. Realizar una venotomía en la VCI, ligeramente proximal a la anastomosis aórtica, utilizando una cuchilla de 11 para la punción y microtijeras para un adecuado ajuste del tamaño según el diámetro del tronco pulmonar del donante. Nuevamente, enjuague la luz intracava con solución salina heparinizada.
9. Comience con la anastomosis venosa entre la VCI del receptor y el tronco pulmonar del donante, que se logra mejor colocando suturas de nailon 11-0 interrumpidas en la pared posterior del vaso, comenzando en las posiciones de las 12 en punto y las 6 en punto (relacionadas con la VCI), y luego coloque una sutura continua de nailon 11-0 en la pared frontal (desde las 6 en punto hacia la posición de las 12 en punto).
10. Cubra las anastomosis con pequeñas tiras de una esponja de gelatina absorbible y retire las pinzas microvasculares comenzando distalmente. Utilice un aplicador de punta de algodón para comprimir ligeramente las esponjas para obtener una hemostasia óptima.
11. Observe el llenado de los vasos coronarios del injerto en el momento de la liberación de las pinzas microvasculares distales y asegúrese de que el corazón del donante comience a latir inmediatamente cuando se suelta la pinza proximal.
    NOTA: La viabilidad del injerto se puede calificar de 0 a 4 intraoperatoriamente de acuerdo con una puntuación de Stanford modificada¹⁹ para confirmar la función adecuada del injerto.
12. Vuelva a colocar los intestinos en el abdomen asegurándose de no distorsionar la anastomosis arterial y venosa.
13. Administrar meloxicam (1 mg/kg) y ethiqa XR (0,65 mg/kg) por vía subcutánea mientras el animal está completamente anestesiado para determinar la analgesia postoperatoria. A continuación, cierre la pared abdominal con una sutura continua de vicryl absorbible 5-0 antes de cerrar la piel con una sutura de vicryl absorbible 6-0 por vía intracutánea.
    NOTA: En la Tabla 2 se presentan instrucciones sobre fallas comunes y solución de problemas.

3. Extracción del corazón del donante neonatal

1. Colocar a la rata donante neonata en una cámara insuflada con isoflurano (2%) para su sedación. Administrar ketamina (75 mg/kg) y xilacina (5 mg/kg), así como heparina (300 U/kg) por vía intraperitoneal.
2. Confirme la profundidad de la anestesia pellizcando los dedos de los pies y coloque a la rata en posición supina con la cola hacia usted. Esterilizar todo el tórax y la pared abdominal con betadine y etanol al 70% tres veces alternativamente. Cubre a la rata con un paño quirúrgico estéril.
3. Con un microscopio quirúrgico de 12,5x, extirpe toda la pared torácica anterior comenzando con una incisión horizontal con un bisturí de 15 hojas en la xifoides, seguida de incisiones verticales lateralmente hasta las axilas en ambos lados con tijeras. La pared torácica anterior se puede extirpar continuando con otra incisión horizontal justo debajo del cuello.
4. Diseccionar la vena cava superior, la vena cava superior derecha e izquierda y los vasos pulmonares con unas tijeras, y luego rodear y ligar todos los vasos con una sutura de seda 7-0. Administre 3 ml de solución Krebs-Henseleit helada y modificada con alto contenido de potasio en la aurícula derecha perforando la VCI con una aguja de 30 G y empujando ligeramente el diafragma hacia abajo con fórceps.
5. Cortar la vena ventricular, las venas venculosas venosas, los vasos pulmonares y la aorta con unas tijeras. Transecte las arterias pulmonares lo más lejos posible y la aorta distal al tronco braquiocefálico para asegurar la longitud adecuada utilizando un bisturí de 11 hojas.
6. Separe el tronco pulmonar y la aorta ascendente con unas tijeras, y enjuague el corazón con una solución cardiopléjica helada con una jeringa de 3 ml.

4. Recuperación del receptor y seguimiento del injerto

1. Después de la cirugía, dale a la rata tiempo suficiente para que se despierte, lo que generalmente ocurre en una ventana de tiempo de 15 minutos, y deja que se recupere en una almohadilla térmica.
   NOTA: No se necesitan antibióticos debido al muy bajo riesgo de infección y para no comprometer el modelo experimental, y no se aplica ninguna restricción a la comida o al agua.
2. Después del trasplante, controle la función del injerto mediante la palpación del corazón trasplantado diariamente, pero tenga en cuenta que esto a veces puede ser difícil de evaluar debido a la superposición intestinal.
   NOTA: La ecocardiografía abdominal puede medir con mayor precisión la viabilidad del injerto. Para la ecocardiografía, seda ligeramente a la rata con isoflurano (1-2%) inhalado a través de un cono nasal y colóquela sobre una almohadilla térmica. La ecocardiografía generalmente se realiza en el día postoperatorio (POD) 1, POD 7 y POD 14. Para permitir la evaluación de la frecuencia cardíaca y la contractilidad, se pueden obtener fácilmente vistas de eje largo y eje corto (Figura 2A, B). Para evaluar las anastomosis, se utilizó la ecocardiografía Doppler (Figura 3A) y se confirmó la formación de tejido EFE como una capa endocárdica ecobrillante dentro de la cavidad ventricular izquierda (Figura 3B, C).

Viabilidad y batido del injerto
En este trabajo, se evaluó visualmente la viabilidad del injerto después de que se retiraron todas las pinzas, y se permitió un tiempo aproximado de reperfusión de 10-15 min con el abdomen abierto para la observación del injerto. El mismo sistema de puntuación para verificar objetivamente la viabilidad del injerto se utilizó para la evaluación visual al final de la cirugía y para la ecocardiografía en el POD 1, POD 7 y POD 14.

0 = ausencia de función orgánica; 1 = función del órgano (en reposo), solo contracción mínima; 2 = función débil o parcial de los órganos; 3 = velocidad o intensidad contráctil reducida, pero función homogénea del órgano; 4 = contracción óptima de la aurícula y el ventrículo (120-160 latidos/min). Una puntuación de 3 o 4 fue calificada como un éxito. Se utilizó la evaluación palpatoria del injerto de donante abdominal para monitorizar la viabilidad del injerto entre los momentos de la evaluación ecocardiográfica.

Mortalidad y tasa de éxito de viabilidad del injerto
El procedimiento se presentó a un nuevo equipo quirúrgico en el centro del estudio entre octubre de 2022 y diciembre de 2022, y se realizaron 19 trasplantes de corazón de rata heterotópica neonatal en el centro del estudio durante este período. La tasa de supervivencia operatoria inmediata fue del 79 % y la tasa de éxito de la viabilidad del injerto (con un corazón de donante viable y palpitante) fue del 84 %. Las características del procedimiento se presentan en la Tabla 3.

Entre los 12 animales que sobrevivieron, 2 requirieron eutanasia antes del objetivo del estudio de 2 semanas, 1 debido a un íleo (n = 1) y el otro debido al dolor no aliviado con analgésicos (n = 1), y 2 fueron sacrificados por diseño 1 semana después de la cirugía.

En tres ratas, la puntuación de Stanford modificada aplicada aumentó de 3 a 4 entre la graduación visual postoperatoria inmediata y la evaluación ecocardiográfica en POD 1. Entre las ocho ratas supervivientes en el criterio de valoración de 14 días, las puntuaciones modificadas de Stanford en la ecocardiografía fueron de cuatro para siete animales y tres para un animal. La causa más frecuente de muerte en esta serie fue el fallo hemodinámico debido a la pérdida excesiva de sangre como consecuencia de la inmadurez del corazón y, por tanto, de la fragilidad de los vasos donantes para la anastomosis o los largos tiempos de anestesia.

Valoración histológica del tejido EFE
Después de la eutanasia con CO2 de la rata receptora, se realizó una relaparotomía bajo preparación estéril. El injerto del donante se extirpó e inmediatamente se colocó en una solución salina fisiológica sobre hielo para su posterior procesamiento. Se resecó un corte horizontal a nivel del ventrículo medio del ventrículo derecho e izquierdo, se colocó en medio de inclusión a temperatura óptima de corte (OCT) y se congeló en nitrógeno líquido (Figura 4A). El resto del tejido se congeló con nitrógeno líquido y se almacenó en un congelador a -80 °C para su posterior análisis. Las imágenes se adquirieron con un microscopio invertido (Figura 4B-D).

La tinción inmunohistoquímica como estándar de oro para identificar la MTend se realizó utilizando 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (azul), VE-cadherina como marcador endotelial (rojo) y α-SMA como marcador de fibroblastos (verde). Las proteínas SMAD fosforiladas y el factor de transcripción SLUG/SNAIL también se tiñeron en el tejido EFE (Figura 5A-E)3,20.

Figura 1: Estante oblicuo para intubación. La rata se coloca boca arriba, con los dientes frontales asegurados con una cuerda y la cabeza mirando hacia el cirujano. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Vista ecocardiográfica de eje largo del VI . (A) Corazón de rata nativa que indica llenado normal durante la diástole. (B) Injerto donante con estancamiento del flujo dentro del VI. Disminución de la carga de volumen durante la diástole. Abreviaturas: VI = ventrículo izquierdo; MV = válvula mitral; TSVI = tracto de salida del ventrículo izquierdo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Anastomosis y evaluación de EFE. (A) Estudio ecocardiográfico Doppler color que indica anastomosis arteriales (flecha roja) y venosas (flecha azul) persistentes. (B,C): Superficie endocárdica ecobrillante dentro de la cavidad del VI indicativa de EFE (flechas blancas). Abreviaturas: VI = ventrículo izquierdo; EFE = fibroelastosis endocárdica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Evaluación macroscópica y microscópica de los tejidos . (A) Sección transversal del ventrículo medio a través del VI y el VD. Las flechas blancas apuntan hacia el tejido EFE. (B) Hematoxilina-eosina, (C) tricrómico de Masson (MTS) y (D) tinción de elastina van Gieson (EVG). El gran aumento indica que el tejido EFE (flechas negras) contiene altas cantidades de colágeno organizado (azul en MTS) y fibras de elastina (negro en EVG). Abreviaturas: VI = ventrículo izquierdo; VD = ventrículo derecho; EFE = fibroelastosis endocárdica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Comparación de imágenes histológicas e inmunohistológicas. (A) Tinción de hematoxilina-eosina. (B-E) Tinción inmunohistoquímica; Tejido EFE doblemente teñido para (B,C) VE-Cadherina y α-SMA, (D) CD31 y fosfo-SMAD2/SMAD3 (colocalizado con los núcleos teñidos con DAPI en azul), y (E) CD31 y SLUG/SNAIL (colocalizado con los núcleos teñidos con DAPI en azul), indicativo de EndMT, como muestran las flechas blancas. Abreviaturas: VI = ventrículo izquierdo; EFE = fibroelastosis endocárdica; EndMT = transición endotelial a mesenquimatosa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Composición del tampón Krebs-Henseleit modificado. Se prepara una solución cardiopléjica con alto contenido de potasio (22 mmol/L KCl), se esteriliza con filtro y se almacena a 4 °C durante la noche.

Tabla 2: Fallos comunes y solución de problemas. El monitoreo exhaustivo y la reevaluación de los procedimientos fallidos son cruciales para lograr una alta tasa de supervivencia en este modelo.

Tabla 3: Características del procedimiento. Selección de receptor y donante, tiempo de isquemia del injerto y tasa de supervivencia. Abreviatura: IQR = rango intercuartílico.

Ninguno.