Method Article

Modelo microfluídico de enterocolitis necrotizante que incorpora enteroides, enteroides, intestinos neonatales humanos y un microbioma disbiótico

DOI:

10.3791/65605

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July 28th, 2023

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1Division of Neonatal-Perinatal Medicine, Department of Pediatrics, University of North Carolina at Chapel Hill, 2University of Nebraska College of Medicine, 3Department of Surgery, Washington University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo describe un modelo in vitro de enterocolitis necrotizante (ECN), que puede utilizarse para estudios mecanicistas de patogénesis de la enfermedad. Cuenta con un chip microfluídico sembrado con enteroides intestinales derivados del intestino neonatal humano, células endoteliales y el microbioma intestinal de un neonato con ECN grave.

Abstract

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La enterocolitis necrotizante (ECN) es una enfermedad intestinal grave y potencialmente mortal que ha sido difícil de estudiar debido a su compleja patogenia, que sigue sin comprenderse completamente. La fisiopatología de la ECN incluye la alteración de las uniones estrechas intestinales, el aumento de la permeabilidad de la barrera intestinal, la muerte de las células epiteliales, la disbiosis microbiana y la inflamación desregulada. Las herramientas tradicionales para estudiar la ECN incluyen modelos animales, líneas celulares y organoides intestinales humanos o de ratón. Si bien los estudios que utilizan esos sistemas modelo han mejorado la comprensión del campo de la fisiopatología de la enfermedad, su capacidad para recapitular la complejidad de la ECN humana es limitada. Ahora se ha desarrollado un modelo in vitro mejorado de NEC que utiliza tecnología microfluídica, denominado NEC-on-a-chip. El modelo NEC-on-a-chip consiste en un dispositivo microfluídico sembrado con enteroides intestinales derivados de un neonato prematuro, cocultivado con células endoteliales humanas y el microbioma de un lactante con ECN grave. Este modelo es una herramienta valiosa para los estudios mecanicistas sobre la fisiopatología de la ECN y un nuevo recurso para las pruebas de descubrimiento de fármacos para las enfermedades intestinales neonatales. En este manuscrito, se proporcionará una descripción detallada del modelo NEC en un chip.

Introduction

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La enterocolitis necrotizante (ECN) afecta a los prematuros, con una incidencia de hasta el 10% en los nacidos con un peso < 1500 g1. La fisiopatología de la ECN es compleja e incluye daño al epitelio intestinal, alteración de las uniones estrechas intestinales, aumento de la permeabilidad de la barrera intestinal, desregulación inmunitaria y muerte de células epiteliales 2,3. Nuestra comprensión de los mecanismos implicados en la patogénesis de la ECN sigue siendo incompleta y, a pesar de décadas de investigación, todavía no existen terapias dirigidas eficaces.

Un obstáculo importante para el avance de la investigación de la ECN es la disponibilidad limitada y el pequeño tamaño del tejido intestinal primario aislado de bebés humanos. El tejido intestinal extirpado de lactantes con ECN suele estar necrótico y gravemente dañado, lo que complica los estudios sobre los mecanismos que preceden a la aparición de la enfermedad. Por ejemplo, el intestino delgado de los lactantes con ECN está inundado de células inmunitarias, y también se observa una reducción del número de células madre intestinales, una disminución de la proliferación de células epiteliales y un aumento de la apoptosis de las células epiteliales 4,5,6,7. Esto conduce a dificultades en el cultivo de células epiteliales intestinales a partir de estas muestras y en el aislamiento de ARN y proteínas, que pueden degradarse en este entorno inflamatorio hostil. Además, dado que el proceso de la enfermedad ya está avanzado en los lactantes con ECN quirúrgica, los estudios mecanicistas sobre los factores que inducen la enfermedad son inviables. Estas limitaciones han llevado a una dependencia de los modelos animales para los estudios mecanicistas de la ECN.

Se han establecido modelos animales de ECN para ratones, ratas, lechones, conejos y babuinos 5,8,9,11. Una fortaleza de los modelos animales es que la enfermedad intestinal similar a la ECN es inducida por factores asociados con la aparición de ECN en los seres humanos, incluido un microbioma disbiótico, episodios repetidos de hipoxia y la ausencia de alimentación con leche materna 5,8,10,11. Además, la respuesta inflamatoria y los cambios patológicos observados durante la ECN experimental son paralelos a la enfermedad humana 5,9,12. Si bien estos modelos imitan muchas de las características de la ECN humana, existen diferencias inherentes entre la fisiopatología de la ECN en animales y humanos. Por ejemplo, el modelo murino de ECN se induce en ratones nacidos a término, y aunque su desarrollo intestinal es incompleto, la fisiopatología de ECN es inherentemente diferente en este contexto clínico. La expresión génica intestinal murina al nacer es similar a la de un feto humano previable y no se aproxima a la de un neonato prematuro de 22-24 semanas de gestación hasta el día 14 (P14)13. Esto confunde el modelo murino de ECN porque generalmente no se puede inducir lesión intestinal en ratones después de P10. Además, las cepas endogámicas de ratones carecen de la diversidad inmunológica14 y microbiológica de los neonatos humanos15, lo que sirve como otro factor de confusión. Por lo tanto, una mayor incorporación de muestras humanas primarias en la investigación de ECN mejora la relevancia clínica de los estudios en este campo.

Los estudios sobre los mecanismos de la ECN in vitro han utilizado tradicionalmente líneas celulares monotípicas derivadas de células adultas de cáncer intestinal, como el adenocarcinoma colorrectal (Caco2) y las células del adenocarcinoma de colon humano (HT-29)16. Estos modelos son convenientes, pero tienen una relevancia fisiológica limitada debido a su crecimiento a partir de células cancerosas adultas, su arquitectura no polarizada y los cambios fenotípicos relacionados con los pasajes repetidos en el cultivo. Los enteroides intestinales mejoran estos modelos, ya que pueden crecer a partir de las criptas del tejido intestinal, diferenciarse en todos los subtipos epiteliales intestinales y formar una estructura tridimensional (3D) similar a una vellosidad17,18,19,20. Recientemente, los enteroides intestinales se han combinado con la tecnología microfluídica para desarrollar un modelo de intestino delgado en un chip y proporcionar un sistema modelo in vitro fisiológicamente más relevante21.

Los primeros dispositivos microfluídicos de órgano en un chip se introdujeron a principios de la década de 200022,23,24. El primer modelo de órgano en un chip fue el pulmón en un chip de respiración humana25. A esto le siguieron numerosos modelos de un solo órgano, como el intestino21, el hígado26, los riñones 27, la médula ósea 28, la barrera hematoencefálica29 y el corazón30. Estos modelos de órganos en un chip se han utilizado para estudiar enfermedades agudas, crónicas y raras, incluido el síndrome de radiación aguda,31 la enfermedad pulmonar obstructiva crónica,32 y las enfermedades neurodegenerativas,33. La naturaleza polarizada de las células en estos chips y la presencia de dos compartimentos celulares separados por una membrana porosa permite modelar procesos fisiológicos complejos como la perfusión, los gradientes de concentración química y la quimiotaxis de las células inmunitarias34,35. Estos sistemas microfluídicos proporcionan así una nueva herramienta para estudiar la fisiopatología y los mecanismos de las enfermedades humanas.

El modelo de intestino delgado en un chip fue descrito por Kasendra et al. en 2018, quienes utilizaron muestras de biopsia de intestino delgado pediátricas (de 10 a 14 años) diferenciadas en enteroides y cultivadas en un dispositivo microfluídico21. Las células endoteliales vasculares, el flujo continuo de medios y el estiramiento/relajación también se incorporaron a este modelo. Observaron la diferenciación de los subtipos epiteliales intestinales, la formación de ejes en forma de vellosidades en 3D, la producción de moco y los patrones de expresión génica del intestino delgado21. Este modelo microfluídico se aplicó a la enfermedad neonatal con el desarrollo del sistema NEC-on-a-chip, que incorpora enteroides intestinales neonatales, células endoteliales y el microbioma de un neonato con NEC36. La ECN en un chip recapitula muchas de las características críticas de la ECN humana, incluida la expresión génica inflamatoria, la pérdida de células epiteliales especializadas y la reducción de la función de barrera intestinal36. Por lo tanto, este modelo tiene numerosas aplicaciones en el estudio de la ECN, incluidos los estudios mecanicistas y el descubrimiento de fármacos. En este manuscrito, se proporciona un protocolo detallado para el rendimiento del modelo NEC en un chip.

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Protocol

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Los enteroides se derivaron de muestras del intestino delgado de lactantes prematuros (nacidos entre las semanas 22 y 36 de gestación) obtenidas en el momento de la cirugía por ECN u otras afecciones intestinales con etiologías no inflamatorias. Toda la recolección y el procesamiento de muestras se realizaron después del consentimiento informado y la aprobación de las Juntas de Revisión Institucional de la Universidad de Washington en St. Louis (números de protocolo 201706182 y 201804040) y de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill (número de protocolo 21-3134 del IRB).

1. Aislamiento y colocación de placas de criptas del intestino delgado neonatal humano para establecer enteroides

  1. Preparación de los medios de comunicación
    1. Prepare todos los medios necesarios como se describe en la Tabla 1. Asegúrese de que se utilice una técnica aséptica para la preparación de todos los medios. Filtre: esterilice los medios con un filtro de 0,2 μm y guárdelos a 4 °C hasta su uso.
  2. Lavar y picar el tejido intestinal
    1. Coloque el hidrogel de la matriz de cultivo celular en hielo para descongelar. Obtener tejido intestinal humano del quirófano. Coloque inmediatamente la muestra en 5 ml de medios de lavado de tejidos helados para inactivar las proteasas endógenas.
    2. Enjuague el contenido intestinal con solución salina tamponada con fosfato (D-PBS) de Dulbecco helada con una jeringa de 10 ml equipada con una punta de pipeta P1000 recortada. Transfiera el tejido intestinal a una placa de 35 mm que contenga 5 ml de D-PBS helado.
    3. Corta el tejido intestinal longitudinalmente para exponer el lumen y córtalo en trozos pequeños con unas tijeras finas. Enjuague el tejido intestinal agitando suavemente D-PBS en la placa de cultivo de tejidos.
    4. Transfiera los fragmentos de tejido a un plato limpio de 35 mm. Pica el pañuelo con unas tijeras finas. El tamaño óptimo es de 0,5cm2 por pieza. El tejido intestinal debe pasar a través de una punta de pipeta recortada de 1 ml.
  3. Disociación del tejido intestinal
    1. Añadir 1 mL de colagenasa I precalentada al tejido. Mezclar tejido con colagenasa pipeteando 10-15 veces y transferir a un tubo cónico de 15 ml.
    2. Asegure el tubo horizontalmente en un agitador ajustado a 50 rpm. Agitar durante 20 minutos a temperatura ambiente.
    3. Después de la incubación, retire los tubos del agitador y vuelva a suspender la solución pipeteando de 10 a 15 veces. Opcional: Retire una pequeña alícuota para verificar la presencia de criptas individuales mediante microscopía de contraste de fase.
  4. Aislamiento de las criptas intestinales
    1. Filtre las criptas a través de un colador de 70 μm en un tubo cónico de 50 ml sobre hielo. Lave el colador con 9 ml de medios de lavado de pañuelos helados. Transfiera el filtrado a un tubo cónico de 15 ml.
    2. Centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 °C y retirar suavemente el sobrenadante. Quedarán aproximadamente 200 μL de medio en el tubo. Vuelva a suspender el gránulo en 5 ml del medio de lavado de pañuelos helado.
    3. Centrifugar a 300 x g durante 10 min a 4 °C. Vuelva a suspender el gránulo en 1 ml de medio de lavado de tejidos y transfiéralo a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
    4. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 °C para pellet las criptas. Aspire cuidadosa y completamente el sobrenadante tanto como sea posible con una pipeta. Coloque el tubo sobre hielo.
  5. Recubrimiento de criptas intestinales
    1. Resuspenda el gránulo en hidrogel de matriz de cultivo celular (20 μL/pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 48 pocillos) utilizando una punta de pipeta preenfriada para hacer una suspensión homogénea de las criptas mientras el tubo permanece en hielo. Evite hacer burbujas al pipetear. Mantenga el tubo en hielo hasta que esté listo para usar.
      NOTA: El hidrogel de la matriz de cultivo celular se polimerizará a temperaturas superiores a 8 °C. Las criptas aisladas de un trozo de tejido intestinal de 0,5 cm-1 cm de longitud generalmente se siembran en 10 pocillos de una placa de cultivo de tejido de 48 pocillos.
    2. Coloque la suspensión de hidrogel de la cripta/matriz de cultivo celular en una placa de cultivo de tejidos precalentada de 48 pocillos. Caliente la placa para ayudar en la solidificación de la matriz. Coloque la suspensión en el centro del pozo. Evite las burbujas al emplatar.
    3. Incubar las placas durante 20 min a 37 °C para polimerizar la matriz. Es esencial que el hidrogel de la matriz de cultivo celular polimerice completamente antes de agregar medios.
    4. Después de que la matriz se polimerice, agregue 300 μL de medio acondicionado precalentado al 50% L-WRN a cada pocillo. Incubar a 37 °C, 5% CO2.
    5. Cambie el medio cada 2 o 3 días. Reemplácelo con medios acondicionados con L-WRN tibios al 50 %. Pasaje cada 7 a 10 días. Enteroides de paso cuando son 50%-90% confluentes y exhiben formación de yemas.
      NOTA: Es posible que sea necesario cambiar el medio con más frecuencia si se vuelve amarillo. La frecuencia de paso dependerá de la densidad de enteroides, y de la tasa de crecimiento de las células de un paciente en particular. Los enteroides necesitarán ser pasados si sus centros se vuelven oscuros en apariencia.
  6. Pasar los enteroides
    1. Aspire suavemente los medios de los pocillos. Lave cuidadosamente los pocillos con 500 μL de D-PBS tibio. Tenga cuidado de no alterar la matriz.
    2. Agregue 250 μL de solución de recuperación de celda fría a cada pocillo. Rasque el fondo de cada pocillo con una punta de pipeta nueva para interrumpir el hidrogel de la matriz de cultivo celular. Incubar la placa en hielo durante 30 min.
    3. Disocie los enteroides mediante pipeteo vigoroso (~25-50 veces con pipeta P200) y agregue 500 μL de medio de lavado de tejidos.
    4. Transfiera la suspensión enteroide a un tubo de 15 ml y agregue 5 ml adicionales de medios fríos para lavar pañuelos. Pipetear suavemente para formar una solución homogénea.
    5. Centrifugar a 400 x g durante 5 min a 4 °C para granular los enteroides. Coloque el tubo en hielo y aspire el sobrenadante lo más completamente posible. Quedarán aproximadamente 30-60 μL en el tubo.
      NOTA: Si hay dificultades para romper los enteroides con el pipeteo, se puede utilizar tripsina-EDTA al 0,25% o un reactivo de disociación enzimática para facilitar este proceso.
    6. Vuelva a suspender los enteroides en el volumen residual de los medios de lavado con una pipeta P200. Evite la formación de burbujas durante el pipeteo.
    7. Añadir 20 μL de hidrogel de matriz de cultivo celular por pocillo nuevo de una placa de 48 pocillos a la suspensión enteroide. Divida los enteroides 1:3, 1:4 o 1:5, dependiendo de su densidad.
    8. Agregue la suspensión a una placa precalentada de 48 pocillos. Incubar la placa a 37 °C durante 20 min para solidificar la matriz.
    9. Después de la polimerización, agregue 300 μL de medio acondicionado precalentado con L-WRN al 50% a cada pocillo. Incubar a 37 °C, 5% CO2.

2. Modelo de intestino neonatal en un chip

NOTA: Para obtener instrucciones detalladas sobre el manejo de los chips microfluídicos y el uso de este equipo, consulte el protocolo de cultivo de chips de intestino duodeno37 del fabricante.

  1. Preparación de los medios de comunicación
    1. Prepare todos los medios necesarios como se describe en la Tabla 2. Asegúrese de que se utiliza una técnica aséptica. Filtre: esterilice los medios con un filtro de 0,2 μm y guárdelos a 4 °C hasta su uso.
  2. Día (-3): Descongelación y expansión de las células endoteliales microvasculares intestinales humanas (HIMECs)
    1. Descongele un vial de HIMEC y una placa según las recomendaciones del fabricante.
    2. Cubrir un matraz de25 cm2 con una solución de recubrimiento a base de gelatina durante 2 min. Retire el exceso de solución. Añada al matraz HIMECs (aproximadamente 0,5-1 x 106 células) resuspendidas en 6 mL de medio HIMEC. Incubar a 37 °C, 5% CO2.
    3. Cambiar los medios HIMEC cada 48 h. Agregue HIMEC al canal endotelial (inferior) del chip dentro de las 48-72 h posteriores a que se vuelva 100% confluente.
  3. Día (-1): Activación y recubrimiento de las virutas antes de la adición de los enteroides
    1. Reconstituya el polvo del reactivo de activación de chip 1 (CR-1) para hacer la solución de CR-1. Asegúrese de que el polvo CR-1 y la solución del reactivo de activación de virutas 2 (CR-2) estén a temperatura ambiente para este paso.
      NOTA: Mantenga el polvo de CR-1 y la solución de CR-1 que se prepara en los siguientes pasos protegidos de la luz en todo momento. La luz debe estar apagada en el capó para estos pasos.
      1. Coloque el chip y el portador de chips en la base del chip y, a continuación, colóquelos en una placa de cultivo de tejidos en la campana de cultivo celular. Consulte el protocolo del fabricante para conocer la técnica adecuada para la colocación del chip en el soporte37.
      2. Agregue 1 ml de solución de CR-2 al vial de polvo de CR-1 y luego transfiera directamente la solución del vial de polvo de CR-1 a un tubo de 15 ml envuelto en papel de aluminio para protegerlo de la luz. No mezcle la solución con la pipeta. El objetivo es evitar la formación de burbujas.
      3. Agregue otro 1 ml de solución de CR-2 al vial de CR-1 y transfiéralo al tubo de 15 ml. Repita para un total de 4 enjuagues y un total de 4 ml de CR-2 enjuagado a través del vial de CR-1. Agregue la tapa al vial e inviértala para el último enjuague para eliminar cualquier polvo residual.
      4. Agregue 6 ml adicionales de CR-2 al tubo de 15 ml que contiene CR-1 para obtener un volumen final de 10 ml (0,5 mg/ml). Mezcle esta solución con una pipeta sin introducir burbujas. Asegúrese de que CR-1 esté completamente disuelto antes de continuar con el siguiente paso.
    2. Adición de la solución CR-1 al chip
      NOTA: Es fundamental evitar la introducción de burbujas en los canales al agregar estas soluciones. La solución CR-1 debe permanecer protegida de la luz para este paso.
      1. Con una punta de pipeta de 200 μL, agregue 20 μL de solución de CR-1 a la entrada del canal inferior hasta que la solución comience a salir por la salida del canal inferior. Agregue 50 μL de solución de CR-1 a través de la entrada del canal superior hasta que la solución comience a salir por la salida del canal superior. Retire cualquier exceso de solución de CR-1 de la superficie del chip mediante una aspiración suave.
        NOTA: Las soluciones siempre deben agregarse al canal inferior antes del canal superior. Si se observan burbujas, enjuague ambos canales con la solución de CR-1 y repita 2.3.2.1.
      2. Si la tapa de la placa de cultivo de tejidos que contiene las patatas fritas está colocada, retírela para este paso. Coloque las papas fritas bajo luz ultravioleta durante 15 minutos. Retire el CR-1 de los canales superior e inferior.
      3. Repita los pasos 2.3.2.1 a 2.3.2.2 para un total de dos pasos de activación UV. Después de este paso, los chips ya no son sensibles a la luz.
      4. Retire el CR-1 de los canales superior e inferior. Lavar ambos canales con 100 μL de solución de CR-2. Retire la solución CR-2 de los canales superior e inferior.
      5. Lavar ambos canales con 100 μL de D-PBS estéril. Repite los lavados 2 veces. Agregue 100 μL de D-PBS a ambos canales. Retire el exceso de la superficie de las virutas, pero deje los canales llenos.
    3. Recubre los canales con la matriz extracelular.
      1. Descongele la fibronectina, el colágeno IV y el hidrogel de la matriz de cultivo celular en hielo inmediatamente antes de este paso y mantenga estas soluciones en hielo durante el resto de esta sección.
      2. Prepare las siguientes soluciones de matriz extracelular (ECM) para los canales superior e inferior del chip:
        Canal superior: 100 μL de 200 μg/mL de colágeno tipo IV y 100 μg/mL de hidrogel de matriz de cultivo celular en D-PBS por chip.
        Canal inferior: 100 μL de 200 μg/mL de colágeno tipo IV y 30 μg/mL de fibronectina en D-PBS por chip.
      3. Retire completamente D-PBS de los canales superior e inferior. Agregue 50 μL de ECM a la entrada del canal inferior hasta que aparezca una gota en la salida. Repita para el canal superior. Asegúrese de utilizar las soluciones ECM adecuadas para cada canal y agregue primero la solución al canal inferior.
      4. Agregue D-PBS al depósito de la base de la viruta y vuelva a colocar la tapa en la placa de cultivo de tejidos. Coloque las virutas en una incubadora humidificada a 37 °C y 5% deCO2 durante la noche.
  4. Día (0): Siembra de chips con HIMECs y enteroides
    1. Equilibrio de vacío de medios
      1. Para completar el experimento, agregue el volumen requerido de medios HIMEC y medios de expansión de chips a un tubo cónico estéril de 50 ml. Equilibre el medio a 37 °C en un baño de agua durante al menos 1 h.
      2. Conecte el dispositivo de filtración al vacío a tubos de 50 ml que contengan medios calientes. Los tubos deben orientarse con el medio precalentado en la parte inferior del tubo cónico de 50 ml. Vacío a -70 kPa o superior durante 10 s.
      3. Voltee los tubos para que el medio se mueva a través del filtro. Continúe aspirando durante 5 minutos. Una vez finalizada la filtración al vacío, retire el dispositivo de filtración al vacío y coloque los tubos de 50 ml que contienen el medio en la incubadora a 37 °C.
    2. Lavar las patatas fritas
      1. Lave el canal endotelial enjuagando con 100 μL de medio HIMEC precalentado.
        Lave el canal epitelial enjuagando con 100 μL de medio de expansión de viruta precalentado. Retire cualquier medio que se haya extendido sobre la superficie de las virutas.
      2. Repita el paso de lavado. Los medios deben permanecer en los canales, así como en los puertos de entrada y salida después de estos lavados. Vuelva a colocar la tapa de la placa de cultivo que contiene las astillas y devuélvala a la incubadora hasta que esté lista para usar.
    3. Cosecha de HIMECs
      1. Aspire los medios del matraz de 25cm2 que contiene HIMECs. Lave la monocapa suavemente con D-PBS. Añadir 2 ml de tripsina-EDTA precalentada al 0,05% al matraz y enjuagar suavemente sobre la monocapa.
      2. Incubar el matraz a 37 °C durante 2-5 min. Neutralizar la tripsina con 10 mL de medio HIMEC. Vuelva a suspender las células en un medio y transfiéralas a un tubo de 15 ml.
      3. Centrifugar en celdas 150 x g durante 5 min. a 4 °C. Resuspender las células en 200 μL de medio HIMEC.
      4. Retire 10 μL de células y coloque el tubo en hielo. Cuente las células con un hemocitómetro o un contador de células automatizado. La concentración deseada de HIMECs es de 6 x 10 6 a 8 x 106 células/mL.
    4. Siembra de HIMECs en el chip
      1. Retire el chip de la incubadora y llévelo a la campana. Aspire cualquier medio que pueda haber tenido fugas en la superficie del chip.
      2. Enjuague el canal epitelial (superior) de la viruta con 100 μL de medio de expansión de viruta precalentado. Enjuague el canal endotelial (inferior) del chip con 100 μL de medio HIMEC precalentado.
      3. Resuspender suavemente los HIMEC para obtener una distribución homogénea. Retire completamente el medio del canal endotelial (inferior). Agregue 10 μL de HIMEC (~ 36,000 células/chip) al canal endotelial (inferior).
        NOTA: Si es difícil llenar el canal HIMEC sin formación de burbujas cuando se utilizan 10 μL de HIMEC, aumente el volumen de células añadidas. Debe ser el mismo número de celdas por chip.
      4. Agregue medios de crecimiento de organoides adicionales al canal epitelial (superior) si no está lleno. Compruebe la densidad de siembra de los HIMEC. Si no están distribuidos uniformemente y no cubren el 80%-90% de la superficie de la viruta, enjuague el canal y repita la siembra.
      5. Invierta el chip en la base del chip en la placa de cultivo celular. Agregue D-PBS al depósito en la base del chip. Vuelva a colocar la tapa de la placa de cultivo celular y colóquela en la incubadora.
      6. Deje el chip invertido a 37 °C durante 2-3 h para permitir que los HIMEC se adhieran a la membrana del chip. Una vez completada la incubación, vuelva a colocar la viruta/cuna de virutas en posición vertical.
      7. Lave suavemente el canal endotelial (inferior) con 100 μL de medio HIMEC tibio. Deje el contenido multimedia en el canal. Lave suavemente el canal epitelial (superior) con 100 μL de medio de crecimiento de organoides. Deje el contenido multimedia en el canal.
      8. Vuelva a colocar las fichas en la incubadora a 37 °C mientras realiza los siguientes pasos.
    5. Cosecha de enteroides y siembra en chip
      NOTA: Las astillas se siembran con enteroides que se dividieron 10-14 días antes, son 50%-75% confluentes, y en el pasaje 7 y 20. Consulte la Figura 2 para ver la apariencia de los enteroides en el día 0. El tiempo requerido para que los enteroides estén listos para la siembra dependerá de la tasa de crecimiento de las células de un paciente en particular.
      1. Aspire suavemente los medios de los pocillos. Lave cuidadosamente los pocillos que contienen hidrogel de matriz de cultivo celular con 500 μL de D-PBS tibio. Tenga cuidado de no alterar el hidrogel de la matriz de cultivo celular.
      2. Agregue 250 μL de solución de recuperación de celda fría a cada pocillo. Raspe el fondo de cada pocillo con una punta de pipeta nueva para interrumpir el hidrogel de la matriz de cultivo celular. Agregue el contenido de los pocillos a un tubo frío de 15 ml sobre hielo.
      3. Incubar el tubo en hielo durante 45 minutos e invertir el tubo cada 3-5 minutos. Durante este paso, prepare los medios de disociación enteroides. Coloque este medio en el baño de agua a 37 °C cuando queden 10 minutos en el paso de incubación.
      4. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 °C para granular los enteroides. Retire el sobrenadante.
      5. Agregue 2 ml de medio de disociación enteroide por placa cosechada al gránulo y colóquelo en un baño de agua a 37 °C durante 60 s a 120 s. Gire suavemente el tubo durante la incubación. Incubar el tiempo suficiente para lograr enteroides fragmentados, pero sin disociarse en una sola suspensión celular.
      6. Después de la incubación, agregue 10 ml de medios de lavado de tejidos fríos a cada tubo de 15 ml. Centrifugar a 300 x g durante 5 min a 4 °C para granular los enteroides. Aspire el sobrenadante por completo.
      7. Vuelva a suspender el gránulo en 200 μL de medio de expansión de virutas. Disociar enteroides mediante pipeteo vigoroso (~25-50 veces con pipeta P200).
      8. Combine las células en un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml. Pipetear suavemente para formar una solución homogénea. El objetivo es sembrar el chip con enteroides fragmentados en pequeños grupos de 10 a 30 células.
      9. Retire 10 μL de suspensión celular para contar. Coloque la suspensión celular restante sobre hielo. Ajuste el volumen del medio de expansión de la viruta para lograr una concentración de 6 x 106 células/ml.
        NOTA: Puede ser necesario centrifugar los enteroides y resuspenderlos en un volumen menor de medios para lograr la densidad requerida.
      10. Introduzca los chips microfluídicos en la campana y aspire los medios desde el canal epitelial (superior) del chip. Cargue el canal superior del chip con 30 μL de células resuspendidas (~180.000 células/chip). Asegurar una cobertura completa y uniforme del canal epitelial del chip para la formación de una monocapa. Si esto no se logra, enjuague los enteroides a través del chip y vuelva a sembrar.
        NOTA: Si hay dificultades para lograr una suspensión uniforme mientras se cargan varios chips, los enteroides se pueden separar en alícuotas de 40 μL en tubos de microcentrífuga individuales de 1,5 mL. Esto minimizará la variabilidad en el número de enteroides y el tamaño de los fragmentos a medida que avanza la carga.
      11. Regrese las virutas a la base de la viruta en la placa de cultivo celular (si se han retirado). Agregue D-PBS al depósito en la base del chip. Vuelva a colocar la tapa en la placa de cultivo celular y coloque las patatas fritas a 37 °C, 5% de CO2 durante la noche.
  5. Día (1): Preparación de las vainas e introducción del flujo a las patatas fritas
    1. Coloque las virutas en la campana de cultivo de tejidos. Enjuague suavemente el canal epitelial dos veces con 100 μL de medio de expansión de viruta. Enjuague suavemente el canal endotelial dos veces con 100 μL de medio HIMEC. Retire el exceso de medios de la superficie de la viruta.
    2. Prepare las vainas y regule según el protocolo del fabricante37. Agregue 2 ml de medio apropiado a los depósitos de entrada. Añada 300 μL del medio adecuado a los depósitos de salida. El caudal será de 30 μL/h. Stretch aún no se iniciará.
  6. Día (2): Monitoreo del desarrollo de monocapas y cambio de medios
    1. Pausa el módulo de cultivo y coloca las vainas en el capó.
    2. Inspeccione las papas fritas y las vainas en busca de burbujas. Examine la monocapa epitelial con un microscopio de contraste de fase. Capture imágenes en ubicaciones consistentes en todo el chip para monitorear el progreso. Imagina los chips mientras permanecen en las cápsulas.
    3. Retire el medio de los depósitos de entrada del canal superior y reemplácelo con 2 ml de medio de diferenciación de virutas. Agregue 1 ml de medio HIMEC al depósito de entrada del canal inferior. Deje suficiente medio en los depósitos de entrada para asegurarse de que el fondo del depósito permanezca cubierto con una capa delgada de medio.
    4. Vuelva a colocar las cápsulas en el módulo de cultivo y reinicie el flujo a 30 μL/h.
  7. Día (3): Monitoreo del desarrollo de la monocapa, inicio del estiramiento y adición de medios
    1. Repita los pasos 2.6.1.1. y 2.6.1.2. Agregue 1 mL de medio de diferenciación de virutas al depósito de entrada del canal superior y agregue 1 mL de medio HIMEC al depósito de entrada del canal inferior.
      NOTA: Retire los medios de los depósitos de salida de ambos canales una vez que comiencen a alcanzar el 50-75% de su capacidad.
    2. Vuelva a colocar los pods en el módulo de cultivo. Reinicie el flujo a 30 μL/h e inicie el estiramiento al 2% de deformación y una frecuencia de 0,2 Hz.
  8. Día (4): Monitoreo del desarrollo de la monocapa, aumento del estiramiento y adición de medios
    1. Repita los pasos 2.6.1.1. y 2.6.1.2. Agregue 1 mL de medio de diferenciación de virutas al depósito de entrada del canal superior y agregue 1 mL de medio HIMEC al depósito de entrada del canal inferior.
      NOTA: Retire los medios de los depósitos de salida de ambos canales una vez que comiencen a alcanzar el 50-75% de su capacidad.
    2. Vuelva a colocar los pods en el módulo de cultivo. Reinicie el flujo a 30 μL/h y aumente el estiramiento al 10% de deformación y una frecuencia de 0,2 Hz.
  9. Día (5) a Día (7): Monitoreo del desarrollo de monocapas y adición de medios
    1. Repita los pasos 2.6.1.1. y 2.6.1.2. Agregue 1 mL de medio de diferenciación de virutas al depósito de entrada del canal superior y agregue 1 mL de medio HIMEC al depósito de entrada del canal inferior.
    2. Vuelva a colocar los pods en el módulo de referencia cultural y reinicie el flujo y la extensión. Una vez que se visualizan los ejes en forma de vellosidades, proceda al modelo NEC en un chip.

3. Modelo NEC en un chip

  1. Cultivo de bacterias intestinales
    NOTA: Este paso requiere un stock congelado pretitulado de bacterias entéricas de un paciente con ECN que se prepare antes de iniciar este protocolo. Para estos experimentos, se utilizó una suspensión de bacterias entéricas polimicrobianas previamente descrita de un paciente con ECN quirúrgica grave38.
    1. Prepare una reserva de glicerol al 50% de bacterias entéricas y guárdela en un congelador a -80 °C hasta su uso posterior.
    2. Descongelar una alícuota de las bacterias intestinales e inocular 10 μL en 3 mL de medio Luria-Bertani (LB). Incubar a 37 °C con agitación a 150 rpm durante la noche.
    3. El mismo día, lave suavemente los canales con 100 μL de medios de diferenciación de chips precalentados sin antibióticos (canal superior) o 100 μL de medios HIMEC precalentados sin antibióticos (canal inferior). Aspire completamente el medio y repita el lavado durante un total de 3 lavados.
    4. Después de aspirar el tercer lavado, vuelva a colocar los medios en los canales y déjelos en su lugar.
    5. Enjuague los depósitos de entrada de los canales superior e inferior con D-PBS estéril y luego llénelos con 3 ml de los medios libres de antibióticos adecuados. Cebar las vainas y regular como en 2.5.2.
    6. Vuelva a colocar el chip en el módulo de cultivo y vuelva a iniciar el estiramiento y el flujo.
    7. A la mañana siguiente, tome 1 ml del cultivo bacteriano durante la noche e inocule en 25 ml de medio LB fresco.
    8. Vuelva a colocar este nuevo cultivo en el agitador a 37 °C hasta que el diámetro exterior600 alcance 0,6 ± 0,02 medido con una cubeta de 1 cm. Diluir el cultivo bacteriano a 7 x 108 unidades formadoras de colonias/mL en medios de expansión de virutas libres de antibióticos.
    9. Guarde una alícuota de este cultivo para confirmar la concentración del inóculo39. Puede ser necesario ajustar la concentración de las bacterias en función de la respuesta del epitelio.
    10. Retire el medio del canal epitelial (superior). Añada 30 μL del cultivo bacteriano diluido en un medio de expansión de virutas sin antibióticos en el canal superior de la viruta. Tenga mucho cuidado de evitar la contaminación cruzada del canal HIMEC (endotelial) con bacterias. Retire cualquier medio adicional de la superficie del chip.
    11. Deje que los chips permanezcan en condiciones estáticas durante 30 minutos para facilitar la adherencia bacteriana al lado apical del epitelio neonatal. Después de la incubación, enjuague el canal superior con 100 μL de medio de expansión libre de antibióticos para eliminar las bacterias no adheridas. Devuelva las virutas al módulo de cultivo y reinicie el estiramiento y el flujo.
    12. Cada 24 h, retire las cápsulas del módulo de cultivo y enjuague lentamente 100 μL de medio de expansión de chips sin antibióticos a través del canal epitelial. Esto ayudará a prevenir el crecimiento excesivo de bacterias.

4. Ensayo de permeabilidad intestinal

NOTA: Esto se puede realizar en cualquier paso durante el protocolo. Si se inicia cuando se siembran las virutas, el ensayo de permeabilidad intestinal se puede utilizar para evaluar en serie la confluencia de monocapas. Si se inicia con la adición de bacterias intestinales, este ensayo se puede utilizar para determinar la influencia de las bacterias intestinales en la integridad de la monocapa epitelial intestinal.

  1. Retire el medio del depósito de entrada para el canal epitelial (superior). Agregue medios apropiados que contengan colorante de permeabilidad (50 μg/mL) al depósito de entrada. Utilice medios de diferenciación de chips libres de antibióticos para el modelo NEC-on-a-chip.
  2. Recoger los efluentes de los canales epiteliales y endoteliales cada 24 h. Cuantificar la concentración de colorante de permeabilidad mediante el uso de un lector de microplacas según Lanik et al.36.

5. Inmunohistoquímica

  1. Lave suavemente el canal inferior y el canal superior del chip con 200 μL de D-PBS. Aspire completamente D-PBS de los canales.
  2. Fije las celdas enjuagando ambos canales con paraformaldehído al 4%, dejando la solución en los canales. Aspire el exceso de la superficie de la viruta. Incubar a temperatura ambiente durante 30 min.
  3. Lavar ambos canales con 200 μL de D-PBS. Deje D-PBS en el canal inferior y retírelo completamente del canal superior.
  4. Permeabilizar la capa epitelial enjuagando el canal superior con 100 μL de solución detergente al 0,1%, dejando la solución en los canales. Aspire el exceso de la superficie de la viruta e incube a temperatura ambiente durante 45 min.
  5. Lavar ambos canales con 200 μL de D-PBS. Deje D-PBS en el canal inferior y retírelo completamente del canal superior.
  6. Añadir un 10% de suero de burro (o un agente bloqueador adecuado) al canal superior durante 1 h a temperatura ambiente. Lavar ambos canales con 200 μL de D-PBS. Deje D-PBS en el canal inferior y retírelo completamente del canal superior.
  7. Diluir los anticuerpos primarios en suero de burro al 5% y añadirlos al canal superior del chip (los anticuerpos y las concentraciones previamente analizadas están disponibles en Lanik et al.36). Incubar a 4 °C durante la noche.
  8. Lave ambos canales 3 veces con 200 μL de D-PBS. Deje D-PBS en el canal inferior y retírelo completamente del canal superior.
  9. Anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia diluidos 1:200 en suero de burro al 5% en D-PBS y Hoechst 33342 o DAPI (tinciones nucleares). Agregue anticuerpos secundarios al canal superior del chip. Incubar a temperatura ambiente durante 1 h, protegido de la luz.
  10. Lave ambos canales 3 veces con 200 μL de D-PBS. Deje los canales llenos de D-PBS después del lavado final. Coloque el chip en una antena parabólica de imágenes con D-PBS para la adquisición de imágenes mediante microscopía confocal.
    NOTA: Las virutas fijas, teñidas o sin teñir, pueden almacenarse a 4 °C durante un máximo de 1 semana en PBS. Asegúrese de que los canales no se sequen durante este período.

6. Aislamiento de ARN, preparación de ADNc y PCR cuantitativa en tiempo real

  1. Lave suavemente el canal inferior y el canal superior del chip con 200 μL de D-PBS. Aspire completamente D-PBS de los canales.
  2. Extraiga el ARN total de las células utilizando un reactivo de extracción de ARN según las instrucciones del fabricante. Para aislar el ARN solo del epitelio, infunda solo a través del canal superior.
  3. Cuantifique la concentración de ARN utilizando un espectrofotómetro de nanovolumen. Transcribir inversamente 1 μg de ARN total. Realice PCR cuantitativa en tiempo real. Los cebadores utilizados anteriormente en este modelo están disponibles en Lanik et al. 36.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los enteroides se sembraron en el dispositivo microfluídico (Figura 1) y se cultivaron como se describió anteriormente. El crecimiento de los enteroides en el hidrogel de la matriz de cultivo celular antes de la siembra y luego la posterior expansión de la monocapa de células epiteliales intestinales después de la siembra del dispositivo se monitoreó mediante microscopía de campo claro (Figura 2). Se formó una monocapa de células epiteliales intestinales conflue...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este sistema de ECN en un chip es una nueva y poderosa herramienta que se puede utilizar para modelar la fisiopatología de la ECN. Esta plataforma proporciona un microambiente complejo que se asemeja más al medio intestinal in vivo que los modelos anteriores al incorporar un sistema de cocultivo con flujo y estiramiento luminal continuo. Estas condiciones promueven el desarrollo de una arquitectura 3D similar a una vellosidad revestida por un epitelio altamente polarizado que consiste en subtipos epiteliales mad...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran no tener conflictos de intereses relacionados con este manuscrito.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este manuscrito fue apoyado por R01DK118568 (MG), R01DK124614 (MG) y R01HD105301 (MG) de los Institutos Nacionales de Salud, la Subvención de la Iniciativa Chan Zuckerberg 2022-316749 (MG), un Premio de Carrera Temprana (LCF) del Fondo de Investigación Thrasher, una Subvención de Investigador de Carrera Temprana (LCF) de Desarrollo Infantil de la UNC a través del generoso apoyo de los donantes de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill, y el Departamento de Pediatría de la Universidad de Carolina del Norte en Chapel Hill.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
[Leu15]-Gastrin I humanoSigma-AldrichG9145
A 83-01Sigma-AldrichSML0788
Avanzado Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12Gibco12634010
B-27 Suplemento, sin suero (50x)Gibco17504044
Basic Bio-kitEmulateN/A
Lector de microplacas multimodo BioTek Synergy 2Agilent  7131000
CUBETAS DE metacrilato (PMMA) a MARCA, semimicroBrandTech759085D
Solución de recuperaciónCorning354270
CFX Opus Sistemas de PCR en tiempo realBio-Rad12011319
Chip CradleEmulateN/A
Chip-S1 Emular chip estirableN/A
CHIR99021Sigma-AldrichSML1046
Placas de pocillos múltiples transparentes tratadas con TC,  48 pocillos Corning3548
Colágeno de placenta humanaSigma-AldrichC5533
Colagenasa, Tipo I, polvoGibco17018029
Medio Completo de Células Endoteliales Humanas con Kit Cell BiologicsH-1168
Tubos de centrífuga de polipropileno cónicos, 15 mLFisher Scientific05-539-12
Tubos cónicos de centrífuga de polipropileno, 50 mLFisher Scientific05-539-8
Countess Cámara de recuento de células PortaobjetosInvitrogen C10283
Contador de células automatizado Countess IIInvitrogen 
DAPTSigma-AldrichD5942
Dextrano, Azul en cascada, 3000 MW, Aniónico, Invitrogen fijable en lisina  D7132Tinte de permeabilidad 
Dimetilsulfóxido (DMSO)Sigma-AldrichD8418
Unidades de filtro PES desechables, membrana aPES de 0,2 umFisher ScientificFB12566504
DMEM/F-12Gibco 11320033
Donkey serumSigma-AldrichD9663
Dulbecco′ s Eagle&prime modificado; s Glucosa media - altaSigma-AldrichD5796
Dulbecco′ s Solución salina tamponada de fosfato (DPBS)Gibco14190-136
EDTA, 0,5 M,  pH 8.0Corning46-034-CI
Reactivo de activación de superficie ER-1Emularreactivo de activación de chipER-1
Reactivo de activación de superficie ER-2 Emularreactivode activación de chip ER-2
2 fibronectina proteína humana, plasmaGibco33016015
Fisherbrand  Placas de Petri con tapa transparente,Fisher ScientificFB0875713
 Productos biológicos celulares6950
Genie Temp-Shaker 300Industrias Científicas, Inc.SI-G300
Gentamicina Gibco15750060
HEPES, Solución líquida 1M (238,3 mg/mL)Corning25-060-CI
Hoechst 33342, triclorhidrato, trihidrato InvitrogenH3570
Colágeno Humano Tipo ISigma-AldrichCC050
Células Endoteliales Microvasculares Primarias Humanas del Intestino DelgadoProductos Biológicos CelularesH-6054
Microscopio InvertidoFisher Scientific03-000-013
Isotemp Baños de agua de lujo de uso generalFisher ScientificFSGPD10
L-Glutamina Gibco25030-081
Agar Caldo Luria (LB), MillerSupelcoL3027
L-WRN Cells Colección de cultivos tipo americanoCRL-3276
Matrigel Factor de crecimiento Matriz de membrana basal reducida, sin LDEV Corning356231Matriz de Cultivo Celular
N-2 Suplemento (100x)Gibco17502048
N-acetil-L-cisteínaSigma-Aldrich1009005
LÁMPARA UV NAILSTARNailStarNS-01-US
NanoDrop OneC  Espectrofotómetro UV-Vis de microvolumenThermo Scientific840-274200
nicotinamidaSigma-Aldrich72340
Orb-HM1 Módulo de concentradorEmulateN/A
ParaformaldehídoThermoFisher047392.9L
Penicilina-Estreptomicina Gibco15140122
solución salina tamponada con fosfato (PBS)Gibco10010023
Pipet-Lite Multi Pipeta L8-200XLS+Rainin17013805
Puntas de pipeta TR LTS 1000µ L S 768A/8Rainin17014966
Pod Módulo portátilEmularN/A
Suero bovino fetal de grado superior (FBS) (Calor inactivado) Avantor Seradigm1500-500
QuantiTect  QIAGEN205313
Factor de crecimiento epidérmico murino recombinante (EGF)PeproTech315-09
SB 431542Tocris1614
Plato de bioensayo cuadrado con asas, no tratado con TC Corning431111
SsoAdvanced Universal SYBR  Green SupermixBio-Rad1725271
Steriflip-GV Unidad de filtro superior de tubo de centrífuga estérilMilliporeSE1M179M6
filtros de células estériles, 70umFisher Scientific22-363-548
Jeringas estériles, 10 mlFisher Scientific14-955-453
Tijeras rectas, finas y de punta afiladaMiltex  InstrumentosMH5-300
Thermo Scientific Sorvall X4R Pro-MD CentrífugaThermo Scientific75016052
Triton  X-100 Sigma-AldrichT8787Detergente
TRIzol Reactivo extracción de 15596026 ARNInvitrogen
Solución de azul de tripano, 0,4 % (p/v) en PBS, pH 7,5 y plusmn; 0,5Corning25-900-CI
Enzima TrypLE Express (1X), sin rojo de fenol Gibco12604013Reactivo de disociación enzimática
Solución de tripsina-EDTASigma-AldrichT4174
VIOS 160i Incubadora de CO2, 165 LThermo Scientific13-998-252
Y-27632Tocris1254
Zoë-CM1 Módulo de cultivoEmularN/A
celular AMQAX1000 el solución de recubrimiento a base de gelatina de 100 mmKit de transcripción inversa Reactivo de

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