Artículo de método

Morfogénesis tridimensional en el intestino canino en un chip utilizando organoides intestinales derivados de pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal

DOI:

10.3791/65720

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9 de febrero de 2024

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1Department of Veterinary Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine, Washington State University, 2Department of Veterinary Internal Medicine, Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo

En este artículo

Resumen

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La integración de organoides intestinales caninos y un sistema microfluídico Gut-on-a-Chip ofrece modelos traslacionales relevantes para las enfermedades intestinales humanas. Los protocolos presentados permiten la morfogénesis en 3D y el modelado dinámico in vitro del intestino, lo que ayuda en el desarrollo de tratamientos efectivos para enfermedades intestinales en perros y humanos con One Health.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los intestinos caninos poseen similitudes en anatomía, microbiología y fisiología con los de los humanos, y los perros desarrollan naturalmente trastornos intestinales espontáneos similares a los humanos. La superación de la limitación inherente de los organoides tridimensionales (3D) para acceder a la superficie apical del epitelio intestinal ha llevado a la generación de cultivos monocapa bidimensionales (2D), que exponen la superficie luminal accesible utilizando células derivadas de los organoides. La integración de estos organoides y cultivos monocapa derivados de organoides en un sistema microfluídico Gut-on-a-Chip ha evolucionado aún más la tecnología, lo que ha permitido el desarrollo de modelos dinámicos in vitro in vitro más relevantes desde el punto de vista fisiológico.

En este estudio, presentamos un protocolo para generar morfogénesis 3D del epitelio intestinal canino utilizando muestras de tejido intestinal primario obtenidas de perros afectados por enfermedad inflamatoria intestinal (EII). También describimos un protocolo para generar y mantener cultivos monocapa 2D y sistemas de intestino en un chip utilizando células derivadas de organoides intestinales 3D. Los protocolos presentados en este estudio sirven como marco fundamental para establecer un sistema microfluídico Gut-on-a-Chip diseñado específicamente para caninos. Al sentar las bases de este enfoque innovador, nuestro objetivo es ampliar la aplicación de estas técnicas en la investigación biomédica y traslacional, alineándonos con los principios de la iniciativa One Health. Al utilizar este enfoque, podemos desarrollar modelos dinámicos in vitro más relevantes desde el punto de vista fisiológico para estudiar la fisiología intestinal tanto en perros como en humanos. Esto tiene implicaciones significativas para las aplicaciones biomédicas y farmacéuticas, ya que puede ayudar en el desarrollo de tratamientos más efectivos para las enfermedades intestinales en ambas especies.

Introducción

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La morfogénesis epitelial intestinal se ha estudiado en gran medida a través de modelos animales de laboratorio, que son costosos, requieren mucho tiempo y no representan con precisión los procesos de desarrollo humano1. Además, los modelos de cultivo celular estáticos 2D convencionales carecen de la capacidad de imitar la compleja organización espacial de una arquitectura epitelial 3D2. Como resultado, existe la necesidad de un protocolo para inducir la morfogénesis 3D in vitro utilizando células epiteliales intestinales de modelos animales relevantes para humanos para avanzar en nuestra comprensión de la arquitectura epitelial intestinal.

Los perros de compañía han desarrollado una anatomía intestinal y una composición del microbioma que son notablemente similares a las de los humanos debido a su entorno y dieta compartidosdurante la domesticación. Además de esta similitud, tanto los humanos como los perros comparten varias morbilidades crónicas que se cree que se atribuyen a la salud intestinal. Los perros, al igual que los humanos, pueden desarrollar espontáneamente afecciones crónicas como obesidad, disfunción cognitiva, diabetes mellitus, enfermedad inflamatoria intestinal (EII) y adenocarcinoma colorrectal 4,5,6,7,8,9,10. A pesar del desarrollo y uso de células epiteliales humanas y murinas en estudios previos de Gut-on-a-Chip 2,11,12,13,14, el epitelio intestinal canino no se ha utilizado hasta ahora. Nuestro novedoso enfoque, que utiliza epitelio organoide intestinal canino en un sistema de cultivo dinámico con una morfogénesis epitelial en 3D, tiene implicaciones significativas tanto para la medicina canina como para la humana.

Los avances recientes en el cultivo de organoides intestinales han llevado al establecimiento del cultivo de organoides intestinales caninos15. Este sistema de cultivo consiste en el cultivo de células madre intestinales bajo un condicionamiento de morfógenos definido, lo que da como resultado un modelo 3D con propiedades autorrenovadoras derivadas de células madre adultas16. Sin embargo, la realización de ensayos de transporte o cocultivos huésped-microbioma plantea dificultades con este modelo 3D debido a la naturaleza cerrada de la luz intestinal17. Para abordar esto, los investigadores han generado una monocapa 2D derivada de organoides intestinales, lo que permite la exposición de la superficie luminal18,19. Sin embargo, tanto los organoides 3D como las monocapas 2D se mantienen en condiciones estáticas, que no reflejan con precisión la biomecánica in vivo del microambiente intestinal. La combinación de la tecnología de organoides caninos derivados de pacientes con la morfogénesis 3D in vitro presenta una oportunidad para la investigación traslacional en enfermedades crónicas multifactoriales. Este enfoque permite a los investigadores desarrollar tratamientos más eficaces que beneficien tanto a los humanos como a los perros y avanzar aún más en la investigación traslacional, alineándose con la Iniciativa One Health, que es un enfoque colaborativo que reconoce la interconexión de la salud humana, animal y ambiental. Promueve la cooperación interdisciplinaria para abordar desafíos de salud complejos y lograr resultados de salud óptimos para todos. Al comprender las interdependencias entre los seres humanos, los animales y los ecosistemas, la iniciativa tiene como objetivo mitigar los riesgos de las enfermedades infecciosas emergentes, la degradación ambiental y otros problemas de salud compartidos20,21,22.

Este protocolo describe métodos integrales para cultivar células epiteliales intestinales caninas obtenidas de organoides de pacientes en un microdispositivo Gut-on-a-Chip con una membrana porosa basada en polidimetilsiloxano (PDMS). Establecer la morfogénesis epitelial 3D mediante la integración de organoides intestinales caninos y esta tecnología Gut-on-a-Chip nos permite estudiar cómo el intestino desarrolla y mantiene su organización celular y su nicho de células madre. Esta plataforma ofrece una valiosa oportunidad para investigar el impacto de las comunidades del microbioma en la salud intestinal y comprender cómo estas comunidades generan metabolitos microbianos que contribuyen a la fisiopatología intestinal 14,23. Estos avances ahora se pueden extender a muestras intestinales caninas, lo que brinda a los investigadores la oportunidad de explorar la intrincada relación entre el microbioma intestinal y la fisiología del huésped. Esto abre vías para obtener información valiosa sobre los mecanismos subyacentes de la fisiopatología intestinal y comprender el papel potencial de los metabolitos microbianos en la salud canina y humana, así como en diversas enfermedades. El protocolo utilizado para el Gut-on-a-Chip canino es reproducible, lo que lo convierte en un modelo experimental adecuado para la medicina comparativa, ya que este enfoque permite investigar las interacciones entre el huésped y el microbioma, las infecciones por patógenos y los efectos terapéuticos basados en probióticos tanto en perros como en humanos.

Protocolo

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El estudio fue aprobado y realizado de acuerdo con el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Estatal de Washington (ASAF# 6993). En este protocolo, utilizamos un dispositivo microfluídico Gut-on-a-Chip bien establecido hecho de PDMS que se fabricó internamente2 (Figura 1D). Los métodos detallados de la fabricación del microdispositivo Gut-on-a-Chip se pueden encontrar en informes anteriores 2,24. Este protocolo demuestra una integración única de organoides intestinales y un sistema microfluídico (Figura 2).

1. Activación superficial de un Gut-on-a-Chip hecho de PDMS

  1. Prepare una solución de polietileno (PEI) al 1% agregando 1 ml de solución de PEI al 50% en 49 ml de agua destilada (DI) en un tubo cónico de 50 ml. Invierta el tubo dos o tres veces para mezclar bien la solución, luego filtre la solución con un filtro de jeringa de 0,2 μm.
    NOTA: Manténgalo almacenado a 4 °C.
  2. Prepare una solución de glutaraldehído (GA) al 0,1 % añadiendo 100 μl de solución de GA al 50 % en 49,9 ml de DI en un tubo cónico de 50 ml. Invierta el tubo dos o tres veces para mezclar bien la solución, luego filtre la solución con un filtro de jeringa de 0,2 μm.
    NOTA: Guárdelo a 4 °C y asegúrese de protegerlo de la exposición a la luz directa.
  3. Coloque el dispositivo Gut-on-a-Chip en un horno seco a 60 °C e incélelo durante un mínimo de 30 minutos para eliminar cualquier resto de humedad.
  4. Exponga el dispositivo Gut-on-a-Chip al tratamiento UV y de ozono durante 60 minutos con un generador de UV/ozono.
    NOTA: Para garantizar una activación óptima de las superficies del PDMS durante el tratamiento, mantenga una distancia de aproximadamente 3 cm o menos entre la lámpara UV y el dispositivo. Evite el hacinamiento de los dispositivos en el generador para lograr una activación eficiente de la superficie.
  5. Asegure los tubos de entrada, derivación y salida del microcanal superior utilizando clips de aglutinante para sujetarlos. También sujete el tubo de entrada para el microcanal inferior.
  6. Desconecte el tubo de salida del microcanal inferior. Asegúrese de que el tubo de derivación del microcanal inferior permanezca abierto.
  7. Con una micropipeta P100, introduzca 100 μL de una solución de PEI al 1% a través del orificio de salida del microcanal inferior.
    NOTA: Se recomienda realizar este proceso mientras el dispositivo aún está caliente por la exposición a los rayos UV/Ozono. Observe la solución de PEI que fluye a través del microcanal y la solución de PEI cae para salir del tubo de derivación para el microcanal inferior.
  8. Vuelva a conectar el tubo de salida del microcanal inferior.
  9. Asegure los tubos de entrada, derivación y salida del microcanal inferior utilizando clips de aglutinante para sujetarlos. También sujete el tubo de entrada para el microcanal superior.
  10. Desconecte el tubo de salida del microcanal superior. Asegúrese de que el tubo de derivación del microcanal superior permanezca abierto.
  11. Con una micropipeta P100, introducir 100 μL de una solución de PEI al 1% a través del orificio de salida del microcanal superior.
    NOTA: Observe que la solución de PEI fluye a través del microcanal y la solución de PEI cae para salir del tubo de derivación para el microcanal superior.
  12. Vuelva a conectar el tubo de salida del microcanal superior.
  13. Una vez que los microcanales superior e inferior estén llenos con una solución de PEI al 1%, deje que el dispositivo se incube a temperatura ambiente (RT) durante 10 minutos.
  14. Realice los pasos 1.5-1.12 con una solución de GA al 0,1 %.
  15. Una vez que los microcanales superior e inferior estén llenos con una solución de GA al 0,1%, deje que el dispositivo se incube en RT durante 20 minutos.
  16. Realice los pasos 1.5-1.12 con agua desionizada para eliminar cualquier exceso de solución de activación de la superficie.
  17. Coloque la viruta en un horno seco a 60 °C y déjela secar durante la noche.
    NOTA: Asegúrese de quitar las pinzas de la carpeta de todos los tubos para evitar cualquier impacto en los tubos. Este proceso de secado es fundamental para la activación uniforme de la superficie del microcanal dentro del Gut-on-a-Chip12.

2. Recubrimiento de matriz extracelular (ECM) y preparación del medio de cultivo para el cultivo Gut-on-a-Chip

  1. Preparar una mezcla de ECM con medio basal organoide de forma que la concentración final de Colágeno I y Matrigel sea de 60 μg/mL y 2 % (vol/vol), respectivamente.
    NOTA: Prepare 50 μL de mezcla de ECM por chip intestinal (es decir, 20 μL de mezcla de ECM por cada microcanal superior e inferior y 10 μL extra). Prepárelo el día de su uso y guárdelo a 4 °C o colóquelo en hielo hasta que esté listo para su uso.
  2. Saque el Gut-on-a-Chip que ha sido tratado con UV/Ozono, PEI y GA del horno seco.
    NOTA: Inspeccione bajo un microscopio de contraste de fase para ver si hay humedad residual.
  3. Deje que el Gut-on-a-Chip se enfríe en una cabina de bioseguridad durante 10 minutos.
  4. Asegure los tubos de entrada, derivación y salida del microcanal superior utilizando clips de aglutinante para sujetarlos. También sujete el tubo de entrada para el microcanal inferior.
  5. Desconecte el tubo de salida del microcanal inferior.
  6. Con una micropipeta P100, introduzca 20 μL de mezcla de ECM a través del orificio de salida del microcanal inferior.
    NOTA: Observe la mezcla de ECM que fluye a través del microcanal sin que quede atrapamiento de burbujas de aire. Si hay alguna burbuja de aire presente, introduzca una mezcla adicional de ECM en el microcanal inferior hasta que la burbuja desaparezca.
  7. Vuelva a conectar el tubo de salida para el microcanal inferior.
  8. Asegure los tubos de entrada, derivación y salida del microcanal inferior utilizando clips de aglutinante para sujetarlos. También sujete el tubo de entrada para el microcanal superior.
  9. Desconecte el tubo de salida del microcanal superior.
  10. Con una micropipeta P100, introduzca 20 μL de mezcla de ECM a través del orificio de salida del microcanal superior.
  11. Vuelva a conectar el tubo de salida para el microcanal superior.
  12. Coloque el chip en una incubadora de CO 2 humidificada con 5% de CO2 a 37 °C durante 1 h para formar la capa de ECM en la membrana de PDMS tratada con PEI y GA (Figura 3A).
    NOTA: Asegúrese de que todos los tubos estén sujetos durante la incubación.
  13. Durante la incubación del recubrimiento de ECM, prepare dos jeringas de 1 ml que contengan medio de siembra en frío, que es el medio de cultivo de organoides que carece de A8301 pero que contiene 10 μM de Y-27632 y 2,5 μM de CHIR99021, como se informó anteriormente en Gut-on-a-Chip derivado de organoides humanos2.
    NOTA: A8301 se retiró del medio para mejorar la unión de las células a la MEC recubierta como se informó anteriormente2. El día 0 del cultivo Gut-on-a-Chip solo requiere un flujo de microcanal superior. Por lo tanto, prepare una jeringa llena para el canal superior y un mínimo de 0,2 ml para el canal inferior.
  14. Una vez que se complete el recubrimiento de ECM, saque el chip de la incubadora y suelte la abrazadera al tubo de derivación conectado al microcanal inferior.
  15. Conecte una jeringa de 1 ml llena de medio de siembra a la aguja de extremo romo que está unida al microcanal inferior del Gut-on-a-Chip. Introduzca con cuidado el medio de siembra (~50 μL) en el tubo de derivación. Una vez que el tubo esté lleno con el medio introducido, asegure el tubo de derivación conectado al microcanal inferior con un clip de aglutinante.
  16. Suelte la abrazadera del tubo de salida conectado al microcanal inferior. Introduzca con cuidado el medio de siembra en el microcanal inferior permitiendo que fluya suavemente a través del sistema. Asegure el tubo de salida conectado al microcanal inferior con un clip de aglutinante después de la perfusión.
  17. A continuación, abra el tubo de derivación conectado al microcanal superior.
  18. Conecte una jeringa de 1 ml llena de medio de siembra a la aguja de extremo romo que está conectada al microcanal superior del Gut-on-a-Chip. Introduzca con cuidado el medio de siembra (~50 μL) en el tubo de derivación. Una vez que el tubo esté lleno con el medio introducido, asegure el tubo de derivación conectado al microcanal superior con un clip de aglutinante.
  19. Suelte el tubo de salida conectado al microcanal inferior. Introduzca con cuidado el medio de siembra en el microcanal superior permitiendo que fluya suavemente a través del sistema. Asegure el tubo de salida conectado al microcanal superior con un clip de aglutinante después de la perfusión.

3. Preparación de células organoides intestinales caninas para la siembra

NOTA: Para generar el modelo Gut-on-a-Chip, en este protocolo se utilizaron organoides de colon canino (denominados colonoides) derivados de perros pacientes con EII. Estos colonoides se derivaron de tres a cinco pequeños fragmentos de tejido colónico biopsiado, siguiendo un método previamente reportado15,18. Para obtener resultados óptimos, es crucial utilizar colonoides caninos que hayan sido sometidos a un mínimo de tres pases de cultivo para establecer organoides estables adecuados para aplicaciones in vitro. Se recomienda cultivar los colonoides caninos durante al menos 3-4 días para facilitar la adecuada diferenciación de las células multilinaje dentro de los organoides, asegurando su madurez funcional y su idoneidad para experimentos posteriores en el modelo Gut-on-a-Chip. El límite máximo del pasaje para este trabajo es menor a 20, como lo indica un estudio previo que demostró el fenotipo y el cariotipo inalterados a lo largo de 20 pasajes consecutivos25. La señalización de estos donantes se presenta en la Tabla Suplementaria S1.

  1. Cultivar los colonoides caninos en placas de 24 pocillos incrustadas en 30 μL de Matrigel 15,18 con medio de cultivo organoide listado en la Tabla de Materiales, el cual es modificado del medio previamente reportado 15,26,27. El medio acondicionado se obtuvo mediante el cultivo de células Rspo1 y células HEK293 diseñadas para secretar Noggin28.
  2. Deseche el medio de cultivo de organoides mediante succión al vacío e introduzca 500 μL de solución de recuperación celular a una temperatura helada en cada pocillo. Incubar durante 30 minutos a 4 °C.
    NOTA: Por lo general, tres pocillos de una placa de 24 pocillos de organoides intestinales caninos maduros proporcionan una cantidad suficiente de células disociadas para sembrar un solo dispositivo Gut-on-a-Chip con 40-50 organoides/un campo de visión con un aumento de x10.
  3. Interrumpa mecánicamente las cúpulas Matrigel durante 5 s con una micropipeta P1000. Posteriormente, reúna la suspensión organoide en un tubo cónico de 15 mL.
  4. Centrifugar el tubo cónico a 200 × g y 4 °C durante 5 min, seguido de la eliminación del sobrenadante.
  5. Introducir 1 mL de proteasa similar a la tripsina a temperatura ambiente, suplementada con 10 μM de Y-27632, y resuspender el gránulo celular pipeteando con una micropipeta P1000.
  6. Colocar la suspensión celular en un baño de agua a 37 °C e incubar durante 10 minutos agitando periódicamente la mezcla.
  7. Introducir 5 mL de medio basal organoide tibio y pipetear vigorosamente la suspensión celular con una micropipeta P1000 hasta que se vuelva turbia, sin grumos celulares visibles.
  8. Pase la suspensión celular a través de un filtro celular con un corte de 70 μm para eliminar cualquier residuo de Matrigel y grupos de células grandes.
  9. Centrifugar el tubo cónico a 200 × g y 4 °C durante 5 min, seguido de la resuspensión del pellet en el medio de siembra. Para la siembra de un dispositivo Gut-on-a-Chip canino, use 20 μL de medio de siembra para resuspender el gránulo celular (es decir, use 20 μL de medio de siembra cuando siembre un dispositivo Gut-on-a-Chip).
  10. Modificar la concentración de células viables a 1 × 107 células/mL con medio de siembra como se informó anteriormente2. Realizar una evaluación de viabilidad utilizando un hemocitómetro combinando 10 μL de la suspensión celular con 10 μL de azul de tripano, y luego observar las células bajo un microscopio.
    NOTA: Es crucial ajustar la concentración celular de manera adecuada para garantizar una adhesión celular óptima y la formación de una monocapa uniforme en la membrana del chip. Si el número inicial de células es insuficiente, puede dar lugar a un retraso o a un fracaso en el establecimiento de una monocapa confluente. Por el contrario, si el número de células es excesivo, las células no adherentes pueden agruparse en grupos dentro del canal, lo que provoca efectos de concentración indeseables.

4. Siembra y formación de una monocapa celular 2D

  1. Desconecte el tubo de salida del microcanal superior. Asegúrese de que el tubo de derivación del microcanal superior permanezca abierto. Asegure tanto la entrada como la salida del microcanal inferior utilizando clips de aglutinante para sujetarlos.
  2. Con una micropipeta P100 o P20, introduzca 20 μL de la suspensión celular del Protocolo 3 en el orificio de salida del microcanal superior (Figura 3B Siembra).
  3. Asegure el tubo de derivación y entrada del microcanal superior utilizando clips de unión para sujetarlo. Luego, vuelva a conectar el tubo de salida al orificio de salida del microcanal superior, asegurándose de que el tubo permanezca abierto durante todo el proceso para evitar que se aplique presión al microcanal superior. Después de este paso, asegure lentamente el tubo de salida del canal superior con un clip de unión para sujetarlo.
  4. Verifique con un microscopio que las células estén distribuidas uniformemente por todo el microcanal superior.
    NOTA: Es importante sujetar el tubo para detener el movimiento del medio dentro del canal para permitir condiciones estáticas estables hasta que se logre la unión de celda deseable.
  5. Coloque el chip en una incubadora deCO2 humidificada a 37 °C.
    NOTA: Las células organoides intestinales caninas tardan aproximadamente 3 horas en adherirse al recubrimiento de la MEC (Figura 3B Adjunto).
  6. Conecte la jeringa conectada al microcanal superior del Gut-on-a-Chip a una bomba de jeringa colocada dentro de una incubadora deCO2 .
    NOTA: Enjuague con cuidado el medio en el microcanal con la perilla de la bomba de jeringa y retire las células no unidas. Examine el chip bajo un microscopio para asegurarse de que las células no adheridas se hayan eliminado de manera efectiva.
  7. Iniciar el flujo del medio de cultivo a 30 μL/h con el medio de siembra. Este flujo continuo es solo para el microcanal superior inicialmente hasta el establecimiento de la monocapa 2D en un Gut-on-a-Chip. Para el microcanal inferior, deje los microcanales sujetos y el medio sin enjuagar.
  8. A partir del día siguiente a la siembra de las células, cambie el medio de cultivo por un medio de cultivo de organoides, que contiene A8301 y carece de 10 μM Y-27632 y 2,5 μM de CHIR99021, del medio de siembra.
  9. Una vez establecida la monocapa, inicie también el flujo continuo del medio hacia el microcanal inferior. Por lo general, las células epiteliales organoides intestinales caninas tardan de 2 a 3 días en establecer monocapas epiteliales (Figura 3C).

5. Establecimiento de la morfogénesis 3D en el intestino en un chip canino

NOTA: Después de que se forman las monocapas confluentes en Gut-on-a-Chip, se introdujo un flujo medio tanto del canal superior como del canal inferior y de la cepa celular para iniciar la morfogénesis 3D a la monocapa 2D como se presenta en la Figura 2.

  1. Introducir el medio de cultivo de organoides en los microcanales superior e inferior para iniciar el desarrollo de la morfogénesis 3D en un sistema Gut-on-a-Chip. Para lograr un esfuerzo cortante de 0,02 dinas/cm2 en el diseño existente de Gut-on-a-Chip (es decir, microcanal de 500 μm de altura), aumente el caudal a 50 μL/h29.
  2. Iniciar el 10% de la tensión celular y 0,15 Hz de frecuencia, como se recomienda antes2, utilizando un biorreactor regulado por ordenador que aplique una deformación cíclica a las células cultivadas in vitro. Este proceso aplicaría succión al vacío al dispositivo Gut-on-a-Chip.
  3. Mantenga estas condiciones de cultivo durante un mínimo de 2 a 3 días. La morfogénesis 3D de la monocapa intestinal canina suele ocurrir de 2 a 3 días después de que se haya iniciado el flujo del canal dural y la succión al vacío (Figura 3C).

6. Caracterización del Gut-on-a-Chip canino

  1. Obtención de imágenes de células vivas
    1. Elimine las burbujas de aire en el Gut-on-a-Chip haciendo fluir suavemente el medio con la bomba de jeringa.
    2. Desconecte el dispositivo Gut-on-a-Chip de la bomba de jeringa.
      NOTA: Evite cualquier maniobra que pueda aplicar presión dentro del Gut-on-a-Chip.
    3. Coloque el dispositivo en un microscopio para capturar imágenes del epitelio 3D establecido. Para visualizar la estructura de las capas epiteliales 3D utilizando el contraste de fase, utilice objetivos de 10x y 20x (Figura 3C).
  2. Tinción por inmunofluorescencia
    1. Prepare la solución de bloqueo disolviendo 1 g de BSA en 50 ml de solución salina tampón fosfato (PBS) para obtener BSA al 2%. Pasar la solución a través de un filtro de jeringa de 0,2 μm para la filtración. Mantenga esta solución almacenada a 4 °C.
    2. Prepare la solución permeabilizante combinando 150 μL de Triton X-100 con 50 mL de solución de bloqueo, lo que da como resultado una concentración final de 0,3% de Triton X-100. Pasar la solución a través de un filtro de jeringa de 0,2 μm para la filtración. Mantenga esta solución almacenada a 4 °C.
    3. Realice la fijación de las células inyectando 100 μL de un PFA al 4% en los microcanales superior e inferior como se describe en los pasos 2.4-2.11.
    4. Enjuague las células inyectando 100 μL de PBS en los microcanales superior e inferior como se describe en los pasos 2.4-2.11.
    5. Realice la permeabilización de las células inyectando 100 μL de Triton al 0,3% en los microcanales superior e inferior como se describe en los pasos 2.4-2.11. Coloque el dispositivo en RT durante 30 min.
    6. Enjuague las células inyectando 100 μL de PBS en los microcanales superior e inferior como se describe en los pasos 2.4-2.11.
    7. Realice el bloqueo de las células para evitar la unión inespecífica inyectando 100 μl de BSA al 2% en los microcanales superior e inferior, como se describe en los pasos 2.4-2.11. Coloque el dispositivo en RT durante 1 h.
    8. Inyectar 20 μL de la solución de anticuerpos primarios diluida en BSA al 2% y colocarla a RT durante 3 h, seguida de incubación nocturna a 4 °C.
      NOTA: Asegúrese de que todos los tubos estén sujetos durante la incubación a 4 °C durante toda la noche. La concentración de un anticuerpo primario debe ser de 2 a 5 veces mayor que la concentración recomendada para la tinción de monocapa o organoide 3D (Figura suplementaria S1).
    9. Enjuague las células inyectando 100 μL de PBS en los microcanales superior e inferior como se describe en los pasos 2.4-2.11.
    10. Inyectar 20 μL de la solución de anticuerpos secundarios diluida en BSA al 2% y colocarla a RT durante 1 h.
      NOTA: Asegúrese de que todos los tubos estén sujetos durante la incubación. A partir de este paso, es necesario proteger la configuración del dispositivo con papel de aluminio para evitar el fotoblanqueo.
    11. Enjuague las células inyectando 100 μL de PBS en los microcanales superior e inferior como se describe en los pasos 2.4-2.11.
    12. Prepare una solución combinada para la contratinción de F-actina y DAPI (diamidino-2-fenilindol). Inyectar 20 μl de la solución combinada en los microcanales superior e inferior como se describe en los pasos 2.4-2.11.
    13. Enjuague las células inyectando 100 μL de PBS en los microcanales superior e inferior como se describe en los pasos 2.4-2.11.
      Realice imágenes de fluorescencia de la arquitectura de las células epiteliales 3D utilizando un microscopio de fluorescencia o un microscopio confocal.

7. Función de barrera epitelial

  1. Elimine las burbujas de aire en el Gut-on-a-Chip haciendo fluir suavemente el medio con la bomba de jeringa. Asegúrese de que todos los tubos estén abiertos durante la medición.
  2. Retire el Gut-on-a-Chip de la bomba de jeringa y colóquelo a RT durante al menos 10 minutos.
  3. Retire los electrodos de Ag/AgCl de la solución de EtOH al 70%.
  4. Coloque dos electrodos de Ag/AgCl en la entrada superior y en la salida inferior, respectivamente, para medir la resistencia de la capa epitelial con un multímetro.
  5. Coloque dos electrodos de Ag/AgCl en la entrada inferior y en la salida superior, respectivamente. Indique la media de estos dos valores como un valor de resistencia para el Gut-on-a-Chip.
    NOTA: El TEER en blanco debe medirse en un Gut-on-a-Chip con solo recubrimiento de ECM sin el epitelio.
  6. El valor de la resistencia eléctrica transepitelial (TEER) (kΩ × cm2) se puede calcular utilizando la ecuación (1).
    TEER = (Ωt - Ωen blanco) × A (1)
    DondeΩ t es un valor de resistencia medido en el momento específico desde el inicio del experimento, Ωblanco es un valor de resistencia medido en el momento sin el epitelio, y A es el área de la superficie cubierta por una capa celular (aproximadamente 0,11cm2 para este diseño Gut-on-a-Chip29).
    1. Calcule el TEER normalizado usando la ecuación (2).
      TEER = figure-protocol-1 (2)
      DondeΩ 0 es un valor de resistencia en el punto de tiempo de lectura inicial del experimento, como se informó anteriormente30 (Figura 4C).

Resultados

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Este protocolo facilita de forma fiable el desarrollo espontáneo de la morfogénesis intestinal en 3D en un sistema Gut-on-a-Chip. Este enfoque utiliza células epiteliales intestinales caninas obtenidas de organoides intestinales derivados de perros afectados por enfermedad inflamatoria intestinal (EII) (Figura 1B). Se puede observar un agrupamiento ocasional de la morfogénesis 3D de las células epiteliales intestinales caninas a lo largo del microcanal después de 6-9 días de flujo medio (Figura 3C). Estos cambios morfológicos pueden ser monitorizados mediante técnicas de contraste de fases. En este estudio, utilizamos organoides derivados de dos perros diagnosticados con EII. En particular, se observó una morfogénesis 3D exitosa en dos réplicas biológicas, cada una de las cuales se realizó con dos réplicas técnicas. Los hallazgos de este estudio proporcionan una base para futuras investigaciones que involucren organoides intestinales derivados de otros donantes caninos. Estos resultados demuestran la potencial aplicabilidad y repetibilidad de nuestro enfoque experimental, que se ha informado previamente en muestras humanas. Estos hallazgos proporcionan una confirmación adicional de que la tecnología Gut-on-a-Chip es aplicable a las células epiteliales intestinales caninas, como se informó anteriormente con los estudios que utilizan células epiteliales intestinaleshumanas.

Este protocolo demostró que la tinción de inmunofluorescencia se puede utilizar para evaluar la estructura 3D de monocapas derivadas de organoides que han formado estructuras similares a vellosidades en chips microfluídicos utilizando microscopía de fluorescencia convencional (Figura 4 A, B). Este protocolo se puede adaptar para validar los fenotipos celulares diferenciados y organizados espacialmente mediante tinción de inmunofluorescencia. La visualización de una morfogénesis 3D dentro de un Gut-on-a-Chip proporciona una excelente oportunidad para investigar la respuesta del huésped durante diversas interacciones patológicas 14,23,31. Cuando se combina con células epiteliales derivadas de pacientes donantes, como se describió previamente en humanos, esta tecnología puede utilizarse para construir modelos personalizados de enfermedades intestinales13. A través de la integración de imágenes de inmunofluorescencia con técnicas de visualización de ARN dirigido, como la hibridación fluorescente in situ, puede ser factible analizar visualmente los transcriptomas y proteomas del huésped dentro de un sistema Gut-on-a-Chip.

Preservar la integridad de la membrana intestinal es vital para mantener la homeostasis intestinal, y la plataforma Gut-on-a-Chip proporciona una valiosa ventaja al permitir un seguimiento y una cuantificación precisos de esta función crucial. La medición de TEER mediante la tecnología Gut-on-a-Chip ofrece varias ventajas. Por ejemplo, estudios anteriores han evaluado con éxito el TEER mientras se cocultivan células intestinales con bacterias no patógenas y probióticas32, así como en condiciones de intestino permeable23. Esto permite a los investigadores estudiar el impacto de diferentes afecciones en la función de la barrera intestinal e identificar posibles intervenciones para promover la salud intestinal.

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Figura 1: Establecimiento de la EII canina derivada del paciente Gut-on-a-Chip. (A) Integración de los organoides intestinales derivados del paciente y la plataforma Gut-on-a-Chip. La biopsia endoscópica se puede realizar para aislar las células de la cripta intestinal y desarrollar organoides intestinales específicos del donante. Las células epiteliales se pueden disociar en células individuales de los organoides, luego sembrarse en un Gut-on-a-Chip basado en PDMS y cultivarse en un microambiente dinámico único. (B) Imágenes representativas de colonoides de un perro con EII. Barra de escala = 100 μm. (C) Este esquema ilustra un dispositivo Gut-on-a-Chip que consiste en una membrana porosa colocada entre los microcanales superior e inferior. El microcanal superior se indica con el área azul, mientras que el microcanal inferior se indica con el área roja. A cada lado del microcanal hay cámaras de vacío que deforman la membrana porosa para imitar el movimiento peristáltico24. (D) Una configuración de Gut-on-a-Chip canino incluye un Gut-on-a-Chip basado en PDMS ensamblado con tubos que se colocan en un cubreobjetos 2,24. El tubo de derivación es fundamental para evitar la acumulación de presión dentro del microcanal durante la manipulación (es decir, la conexión a las jeringas). Los clips de aglutinante se utilizan para sujetar el tubo. Los materiales sensibles al volumen se pueden infundir a través de los orificios abiertos de la salida superior o inferior. El medio de cultivo de organoides se puede infundir conectando las jeringas a las agujas de extremo romo y el flujo a través de la entrada superior e inferior. Abreviaturas: EII = enfermedad inflamatoria intestinal; PDMS = polidimetilsiloxano. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Formación de estructuras en forma de vellosidades en el intestino en un chip canino de EII. Las células epiteliales disociadas se sembraron en un Gut-on-a-Chip recubierto de ECM. Una vez que las células disociadas se unieron a la membrana de PDMS, se inició el flujo apical durante 3 días (D0-D3). Cuando se forma una monocapa 2D confluente (D3), se inicia el flujo basolateral con estiramientos frecuentes (Stretching, AP y BL Flow). Después de 2-3 días de flujo dual y estiramiento de la membrana, la monocapa 2D comienza a desarrollar morfogénesis 3D y se forman estructuras similares a vellosidades después de 9 días de cultivo (morfogénesis 3D, D9-D12). Abreviaturas: ECM = matriz extracelular; PDMS = polidimetilsiloxano; PA = apical; BL = basolateral. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 3: Siembra de organoides intestinales caninos y morfogénesis 3D en un Gut-on-a-Chip. (A) Los pasos experimentales para la activación superficial de una membrana porosa en un Gut-on-a-Chip basado en PDMS. La utilización del tratamiento UV/Ozono, el tratamiento PEI y GA en conjunto facilita la reticulación de las aminas presentes en las soluciones de ECM. Este proceso conduce a la inmovilización estable de las proteínas de la MEC en la membrana porosa. (B) Las imágenes de contraste de fase demuestran las morfologías de las células inmediatamente después de la siembra (izquierda) y 3-5 h después de la siembra (derecha). La membrana porosa después de 3 h de siembra muestra áreas más delgadas y oscuras donde se han adherido células individuales, destacando el proceso de adhesión. (C) Las imágenes de contraste de fase representan la morfogénesis 3D de las monocapas intestinales dentro de un sistema Gut-on-a-Chip. Estas monocapas se derivaron de perros afectados con EII y estas células organoides se cultivaron durante un período de 12 días en condiciones dinámicas, que involucraron flujo de fluidos y movimientos de estiramiento. Barras de escala = 50 μm (B,C). Abreviaturas: EII = enfermedad inflamatoria intestinal; MEC = matriz extracelular; PDMS = polidimetilsiloxano; PEI = polietilenimina; GA = glutaraldehído. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 4: Evaluación del desarrollo morfológico 3D en el Gut-on-a-Chip canino derivado del paciente . (A) Imágenes de inmunofluorescencia de un intestino en un chip de EII canina, que muestra una vista de arriba hacia abajo de un epitelio 3D completamente desarrollado después de 12 días de cultivo, que se evalúa con un microscopio de fluorescencia. La proteína de unión estrecha (ZO-1) se visualiza en amarillo; la membrana del borde del cepillo (F-actina) aparece en rojo; y los núcleos se tiñen con DAPI y aparecen azules. (B) Imágenes de inmunofluorescencia de un intestino en un chip de EII canina utilizando un microscopio confocal con una lente de larga distancia. Como se muestra en el esquema, se muestra una imagen fluorescente de una sección transversal de una estructura similar a una vellosidad de un epitelio 3D completamente desarrollado después de 12 días de cultivo. Además, el apilamiento en Z muestra una vista lateral del epitelio 3D, que revela la formación de estructuras en forma de vellosidades. La membrana del borde en cepillo (F-actina) aparece en rojo, y los núcleos se tiñen con DAPI y aparecen azules. (C) La función de la barrera intestinal se evaluó y midió mediante TEER en Gut-on-a-Chips caninos derivados de pacientes. Se alcanzaron valores estables de TEER en el día 5 de cultivo en Gut-on-a-Chip. Las barras de error expresan el SEM de las mediciones. El valor de TEER se midió entre dos réplicas biológicas con una réplica técnica. Barras de escala = 50 μm (A), 25 μm (B). Abreviaturas: EII = enfermedad inflamatoria intestinal; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenilindol; TEER = resistencia eléctrica transepitelial. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura suplementaria S1: Caracterización del anticuerpo policlonal anti-ZO-1 en monocapas derivadas de colonoides caninos y en dispositivos Gut-on-a-Chip. (A) Tinción por inmunofluorescencia de ZO-1 en amarillo con F-actina en rojo y su imagen superpuesta. Barra de escala = 25 μm. (B) La visualización por inmunofluorescencia de ZO-1 en amarillo en 'Leaky Gut Chips' se llevó a cabo en diversas condiciones, incluida la estimulación con bacterias probióticas (LGG + Citoquinas o VSL # 3 + Citoquinas) y controles libres de gérmenes sin estimulación probiótica (Citoquinas). Barra de escala = 50 μm. Esta figura se reproduce de Min et al.23. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Tabla suplementaria S1: Resumen de la información de los donantes de tejidos. Tabla resumen de la edad, el sexo, la raza, la evaluación histopatológica y la puntuación del índice de actividad de la EII canina (CIBDAI) de los donantes. El CIBDAI es un sistema de puntuación numérica utilizado para inferir la gravedad clínica en la EII canina33. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Discusión

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Este estudio marca la demostración pionera de la compatibilidad de los organoides intestinales caninos con el desarrollo de un modelo canino de EII Gut-on-a-Chip. La integración de organoides intestinales y cultivos monocapa derivados de organoides en un sistema microfluídico (es decir, el sistema Gut-on-a-Chip) ha evolucionado aún más la tecnología, lo que ha permitido la creación de modelos intestinales in vitro que imitan de cerca la dinámica fisiológica y son más representativos de las condiciones biológicas. En particular, dado que hay muy pocos informes de cultivo de Gut-on-a-Chip utilizando organoides derivados de la EII en humanos, el estudio actual que utiliza Gut-on-a-Chip derivado de la EII canina puede proporcionar información líder en el estudio de la EII en humanos.

El desarrollo exitoso de la morfogénesis 3D del epitelio intestinal canino en un Gut-on-a-Chip requiere una cuidadosa atención a varios pasos críticos. En primer lugar, la superficie hidrofóbica de los canales microfluídicos de PDMS puede impedir la adhesión de la MEC y la posterior unión celular, lo que requiere la activación de la superficie de la MDP antes del recubrimiento de la MEC y la siembra de células (ver sección 1 del protocolo). Para lograr un cultivo monocapa estable, la eliminación del exceso de células no adheridas es crucial después de la unión celular (pasos del protocolo 4.6-4.7). Además, la estimulación dinámica, como el flujo medio constante y el movimiento de vacío peristáltico, es necesaria para la morfogénesis 3D del epitelio intestinal (paso 5.2 del protocolo). El manejo cuidadoso es esencial para evitar burbujas de aire en el microcanal durante cualquier paso del cultivo Gut-on-a-Chip.

Si se encuentra con una mala siembra de células en el Gut-on-a-Chip, podría deberse a un bajo número de células o a una mala adhesión celular. Para solucionar problemas de bajo número de células, es importante inspeccionar la salud de los organoides intestinales preparados observando su crecimiento en Matrigel. La viabilidad celular se puede evaluar mediante la tinción con azul de tripano después de la disociación celular para garantizar que no más del 20% de las células estén muertas. Si el número de células viables es insuficiente, se puede intentar optimizar las condiciones del medio organoide. Otra posibilidad es la disociación incompleta de los organoides, lo que da lugar a un exceso de grupos celulares de más de 70 μm que quedan atrapados por el filtro. Para resolver esto, una opción es extender la duración del pipeteo durante la disociación celular. Alternativamente, el tubo cónico de 15 ml se puede agitar suavemente cada minuto mientras se somete al tratamiento con una proteasa similar a la tripsina. Una mala adhesión de la célula al Gut-on-a-Chip puede deberse a un recubrimiento inadecuado de la ECM. Durante el proceso de recubrimiento, se recomienda verificar cuidadosamente la presencia de burbujas de aire y evitar su formación agregando suavemente más solución de recubrimiento según sea necesario. El hacinamiento de las células y la falta de lavado de las células no adheridas pueden dar lugar a una monocapa inicial insuficiente. En tal caso, se puede aplicar una pulsación leve al empujar el émbolo de la jeringa. Estos pasos de solución de problemas pueden ayudar a identificar y abordar problemas durante el proceso de cultivo de Gut-on-a-Chip.

Si bien esta plataforma Gut-on-a-Chip permite la creación de capas epiteliales 3D onduladas, reconocemos la necesidad de una complejidad biológica adicional para replicar completamente el microambiente intestinal. Es crucial considerar las interacciones entre las células epiteliales y mesenquimales, el depósito de MEC para la regeneración 3D y la presencia de características de cripta-vellosidades que establecen un nicho adecuado de células madre. Las células estromalas, como los fibroblastos, desempeñan un papel vital en la producción de proteínas de la MEC y en la regulación de la morfogénesis intestinal34,35,36. La inclusión de células mesenquimales en este modelo tiene el potencial de mejorar tanto la morfogénesis como la eficiencia de la unión celular. Las capas endoteliales, que abarcan la vasculatura capilar y los vasos linfáticos, desempeñan un papel crucial en el control del transporte molecular y el reclutamiento de células inmunitarias37,38. La inclusión de células inmunitarias derivadas del paciente podría ser esencial en la modelización de enfermedades intestinales, ya que permite demostrar la interacción entre la inmunidad innata y la adaptativa, así como el establecimiento de una inmunidad específica de tejido39. Tras la finalización de la morfogénesis 3D en Gut-on-a-Chip, el medio de cultivo de organoides puede modificarse a un medio de diferenciación de organoides. Este puede ser un enfoque viable para inducir una diferenciación celular adicional, dependiendo de los objetivos experimentales.

Obtener imágenes de la microarquitectura 3D in situ es un desafío debido a la larga distancia de trabajo requerida, que se puede superar con un objetivo de larga distancia. Además, los métodos de microfabricación y unión capa por capa dificultan el acceso a las capas superiores para su examen con SEM. Para el diseño actual de Gut-on-a-Chip, se necesita una bomba de jeringa por microdispositivo Gut-on-a-Chip, lo que ocupa espacio en la incubadora deCO2 y evita experimentos a gran escala. Se necesitan innovaciones para aumentar la escalabilidad de una plataforma fácil de usar y un cribado de alto rendimiento.

Estos protocolos actuales permiten el desarrollo espontáneo de capas epiteliales 3D in vitro, superando las limitaciones de los organoides 3D tradicionales, las monocapas 2D y los sistemas de cultivo estático de microdispositivos. Este microambiente intestinal dinámico in vitro puede controlarse mediante la introducción del cocultivo de diversos tipos de células. Estudios anteriores han explorado métodos para manipular el microambiente Gut-on-a-Chip, incluyendo el cocultivo del microbioma intestinal14,23 y las células mononucleares periféricas30. Este microambiente reconstituido tiene numerosas aplicaciones potenciales, incluidas las pruebas de fármacos, los estudios mecanicistas fundamentales y el modelado de enfermedades. El microambiente reconstruido tiene un potencial significativo para una amplia gama de aplicaciones, como las pruebas de drogas 23,40,41 y el modelado de enfermedades 12,13,14,30, así como las investigaciones mecanicistas fundamentales de la morfogénesis intestinal 42. Se puede realizar una variedad de ensayos, ya sea mediante la recolección de sobrenadantes para la evaluación de metabolitos 43, mediante la recolección de células para el examen genómico 2,32, o mediante el examen visual de las células utilizando colorantes de células vivas o la fijación para la posterior obtención de imágenes de inmunofluorescencia 23,44.

Este estudio presenta un protocolo reproducible para el desarrollo de la morfogénesis 3D de las capas epiteliales intestinales caninas en una plataforma Gut-on-a-Chip. La estructura epitelial 3D resultante proporciona una representación más realista del microambiente intestinal, que tiene un inmenso potencial para aplicaciones en diversos estudios biomédicos. Al utilizar esta arquitectura intestinal, podemos llevar a cabo más investigación traslacional y potencialmente producir resultados prometedores.

Divulgaciones

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Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que declarar.

Agradecimientos

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Nos gustaría agradecer al servicio de Medicina Interna de Pequeños Animales de la WSU (Dra. Jillian Haines, Dra. Sarah Guess, Shelley Ensign LVT) y a la Coordinadora de Estudios Clínicos de WSU VTH, Valorie Wiss, por su apoyo en el reclutamiento de casos y la recolección de muestras de científicos ciudadanos (pacientes donantes). Este trabajo fue apoyado en parte por la Oficina del Director de los Institutos Nacionales de Salud (K01OD030515 y R21OD031903 a Y.M.A.) y el Programa de Desafío en el Extranjero de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia en el Extranjero para Jóvenes Investigadores (202280196 a I.N.). La Figura 1A y la Figura 3A se crearon con BioRender.com.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Organoide basal medio
avanzado DMEM/F12Gibco12634-010
GlutaMAXGibco35050-0612 mM, sustituto de glutamina
1 M HEPESVWR Life ScienceJ848-500ML10 mM
100x penicilina– estreptomicinaCorning MT30009CI1x
organoides y organoide medio
A-83-01 PeproTech 9094360500 nM
B27 suplemento Gibco17504-0441x
CHIR99021Reprocell04-0004-base2.5 µ Células
M HEK293 diseñadas para secretar Noggin Facultad de Medicina
de Baylor, Murine EGF, PeproTech 315-09-1MG50 ng/mL
Murine Wnt-3aPeproTech 315-20-10UG100 ng/mL
N-acetil-L-cisteínaSigmaA9165-25G1 mM
N2 MAX Suplemento de medios Gibco17502-0481x 
NicotinamidaSigmaN0636-100G10 mM
Medio Condicionado NogginNANA10% vol/vol 
PrimocinInvivoGenant-pm-1100 µ g/ml
Células R-spondin1 (Rspo1)Trevigen3710-001-01Células Rspo1
Medio acondicionado R-Spondin-1NANA20% vol/vol 
SB202190Sigma-AldrichS7067-25MG  10 y micro; M
Y-27632StemCellTechnologies7230810 µ M
[Leu15 ]-Gastrin I humano Sigma-AldrichG9145-.5MG10 nM
4% Solución de paraformaldehídoFisher ScientificAAJ19943K2
Alexa Fluor 647 PhalloidinThermo Fisher ScientificA22287x250
dilución Anti-Conejo IgG H& L marcado con Alexa Fluor 555Abcamab150078x1.000
dilución Anticuerpo policlonal anti-ZO-1Thermo Fisher Scientific61-7300x50 dilución
Solución de recuperación celularCorning354253
Colágeno I, cola de rata 3 mg/mLGibcoA10483-01
Diamidina-2-fenilindol (DAPI)Thermo Fisher Scientific62248Dilución x1.000
EMS Glutaraldehído acuoso 50%Ciencias de la microscopía electrónica16320
Matrigel MatrixCorning356255
solución de poli(etileneimina)Sigma408700-250ML
TrypLE ExpressGibco12604-021
Materiales y equipos
24-well placas de cultivoCorning3524
87V multímetro industrialCentrífuga Fluke Corporation
Eppendorf5910R
incubadora de CO2EppendorfC170i
DMi8 microscopio de fluorescenciaLeica microsystemsDMi8
Horno secoFisher Scientific15-103-0519
FlexCell FX-5000 Sistema de tensiónFlexcell International Corporation
Microscopio de contraste de fase invertidaLeica microsystemsDMi1
SP8-X Microscopio confocal invertidoLeica microsystemsSP8-X
Bomba de jeringaBraintree Scientificmodelo nº. BS-8000 Jeringa de 120 V
, 3 mL estérilBD Biosciences14-823-435
Jeringas, 1 mL estérilBD Biosciences14-823-434
Generador de UV/ozonoJelight Companymodelo n.º 30
Software
LAS X imaging software Microsistemas
Leica

Referencias

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