Este artículo describe un protocolo para la extracción de ADN de diatomeas utilizando un kit de extracción de ADN común modificado.
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Artículo de método
Extracción de ADN de diatomeas a partir de muestras de agua y tejidos
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
La prueba de diatomeas es un medio auxiliar esencial en la práctica forense para determinar si el cadáver se ahogó en el agua e inferir el lugar del ahogamiento. Las pruebas de diatomeas también son un importante contenido de investigación en el campo del medio ambiente y el plancton. La tecnología de pruebas de biología molecular de diatomeas, que se centra en el ADN de diatomeas como objeto de investigación principal, es un nuevo método de prueba de diatomeas. La extracción de ADN de diatomeas es la base de las pruebas moleculares de diatomeas. En la actualidad, los kits comúnmente utilizados para la extracción de ADN de diatomeas son costosos, lo que aumenta el costo de llevar a cabo investigaciones relacionadas. Nuestro laboratorio mejoró el kit general de extracción rápida de ADN genómico de sangre entera y obtuvo un efecto satisfactorio de extracción de ADN de diatomeas, proporcionando así una solución alternativa de extracción de ADN económica y asequible basada en perlas de vidrio para la investigación relacionada. El ADN de diatomeas extraído mediante este protocolo podría satisfacer muchas aplicaciones posteriores, como la PCR y la secuenciación.
Introducción
En la práctica forense, determinar si un cadáver encontrado en el agua ahogándose o fue arrojado al agua después de la muerte es esencial para la correcta resolución del caso1. También es una de las cuestiones difíciles que deben resolverse con urgencia en la práctica forense2. Las diatomeas son abundantes en el medio natural (especialmente en el agua)3,4. En el proceso de ahogamiento, debido a la hipoxia y la respuesta al estrés, las personas tendrán movimientos respiratorios intensos e inhalarán una gran cantidad de líquido de ahogamiento. Por lo tanto, las dia....
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Protocolo
Este estudio fue aprobado por el Comité de Ética de la Universidad Médica de Hainan. Las muestras de tejido utilizadas en este estudio no se consideran estudios con seres humanos. Estos especímenes se obtuvieron con el propósito de realizar un diagnóstico patológico forense, y el resto se utilizó para la extracción de ADN de diatomeas en este experimento. Los investigadores no pueden identificar fácilmente a las personas para obtener el consentimiento informado de las partes interesadas pertinentes.
NOTA: Para garantizar la aplicabilidad general del método de investigación reportado en este experimento, este experimento siguió básicamente l....
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Resultados
Dado que la solución de ADN extraída por el método de extracción de ADN utilizado actualmente contiene todos los componentes de ADN de diferentes fuentes en la muestra, el ADN obtenido por este protocolo no fue una excepción. Por lo tanto, la solución de ADN no era solo una solución de ADN genómico de diatomeas. Los cebadores que pueden amplificar específicamente los fragmentos de ADNr de diatomeas 18S fueron seleccionados mediante la consulta de la literatura 22,23,24.
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Discusión
Las células de diatomeas están protegidas por paredes celulares silíceas duras17, y esta estructura debe ser destruida para extraer el ADN de diatomeas. Los kits ordinarios no destruyen fácilmente la cáscara silícea de las diatomeas; por lo tanto, es difícil extraer con éxito el ADN de diatomeas21. Nuestro laboratorio mejoró el kit de extracción de ADN sanguíneo más utilizado, añadiendo perlas de vidrio de diferentes diámetros y diferentes proporciones de masa en el proceso.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Este trabajo cuenta con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82060341,81560304) y del Proyecto de Investigación Científica de la Plataforma de Innovación Académica de la Provincia de Hainan (YSPTZX202134).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tampón de unión | BioTeke | B010006022 | células de lisis rápida |
| ChemoHS qPCR Mix | Monad | 00007547-120506 | qPCR Mix |
| D2000 escalera de ADN | en tiempo real(Pekín) Biotecnología | RTM415 | Medir la posición de las bandas electroforéticas |
| D512 | Taihe Biotechnology | TW21109196 | forword primer |
| D978 | Taihe Biotecnología | TW21109197 | imprimación inversa Tampón |
| elución | BioTeke | B010006022 | Un tampón de elución bajo en sal lava la perla de vidrio de ADN |
| Yingxu Chemical Machinery (Shanghai) | 70181000 | Perlas de vidrio especiales para dispersar y moler | |
| Importar columna de adsorción | BioTeke | B2008006022 | Columna de adsorción con membrana de matriz de sílice |
| Tampón de eliminación de inhibidores | BioTeke | B010006022 | Eliminación de inhibidores en la extracción de ADN |
| Isopropanol | BioTeke | B010006022 Precipitar o aislar ADN | |
| MIX-30S Mini Mezclador Miulab | MUC881206 | acción oscilatoria | |
| Proteinasa K | BioTeke | B010006022 Inactivación de nucleasas intracelulares y otras proteínas | |
| Rotor-Gene Q 5plex HRM | Qiagen | R1116175 | cuantificación de fluorescencia en tiempo real |
| Microcentrífuga PCR Speed | Centrífuga | Scilogex | 9013001121 |
| Tanon 3500R Generador de imágenes en gel | Tanon | 16T5553R-455 imagen de | gel |
| Taq Mix Pro | Monad | 00007808-140534 | PCR Mix |
| Thermo Cycler | Zhuhai Hema | VRB020A | ordinario |
| PCR Wash Buffer | BioTeke | B010006022 | Eliminar impurezas como metabolitos celulares |
Referencias
- Liu, C., Cong, B. Review and prospect of diagnosis of drowning deaths in water. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 3-13 (2022).
- Frisoni, P., et al. Forensic diagnosis of freshwater or saltwater drowning using the marker aquaporin....
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Reimpresiones y permisos
