Summary
Dit protocol presenteert een geïntegreerd biorepository-platform voor de gestandaardiseerde verzameling, annotatie en biobanking van hoogwaardige menselijke waterige humor en glasvochtbiopten voor moleculaire downstream-analyses, waaronder proteomics, metabolomics en glycomics.
Abstract
Een cruciale uitdaging in translationeel onderzoek is het tot stand brengen van een levensvatbare en efficiënte interface tussen patiëntenzorg in de operatiekamer (OK) en het onderzoekslaboratorium. Hier ontwikkelden we een protocol voor het verkrijgen van hoogwaardige vloeibare biopsieën voor moleculaire analyses van de waterige humor en het glasvocht van patiënten die een oogoperatie ondergaan. In deze workflow wordt een Mobile Operating Room Lab Interface (MORLI) -kar uitgerust met een computer, een barcodescanner en laboratoriuminstrumenten, inclusief koelopslag aan boord, gebruikt om menselijke biologische monsters te verkrijgen en te archiveren. Een webgebaseerde database die voldoet aan de gegevensprivacy, maakt het mogelijk om elk monster gedurende zijn levensduur te annoteren, en een cartesisch coördinatensysteem maakt het mogelijk om elk monster met streepjescode in opslag te volgen, waardoor snel en nauwkeurig monsters kunnen worden opgehaald voor downstream-analyses. Moleculaire karakterisering van menselijke weefselmonsters dient niet alleen als een diagnostisch hulpmiddel (bijvoorbeeld om onderscheid te maken tussen infectieuze endoftalmitis en andere niet-infectieuze intraoculaire ontsteking), maar vertegenwoordigt ook een belangrijk onderdeel van translationeel onderzoek, waardoor de identificatie van nieuwe medicijndoelen, de ontwikkeling van nieuwe diagnostische hulpmiddelen en gepersonaliseerde therapieën mogelijk is.
Introduction
Moleculaire profilering van vloeibare biopsieën uit het menselijk oog kan lokaal verrijkte vloeistoffen vangen die moleculen bevatten zoals DNA, RNA, eiwitten, glycanen en metabolieten uit zeer gespecialiseerde oculaire weefsels. Vloeibare biopten van het glasvocht in de achterste kamer van het menselijk oog bleken een over het algemeen veilige procedure te zijn1. Ze maken moleculaire karakterisering van oogziekten bij levende mensen mogelijk en bieden het potentieel om nieuwe diagnostische en therapeutische strategieën te identificeren 2,3,4. De waterige humor in de voorste oogkamer heeft een nog hogere chirurgische toegankelijkheid en kan in grote aantallen worden verkregen, bijvoorbeeld tijdens staaroperaties, wat een van de meest uitgevoerde operaties is. Er is echter tot nu toe geen gestandaardiseerd protocol beschikbaar voor het verzamelen, annoteren en biobankieren van menselijke waterige humor en glasvochtbiopten voor moleculaire downstream-analyses, waaronder proteomics, metabolomics en glycomics.
Hier ontwikkelden we een protocol voor het verzamelen en biobankieren van hoogwaardige vloeibare biopsieën voor moleculaire analyses van patiënten die een oogoperatie ondergaan. Een Mobile Operating Room Lab Interface (MORLI) stelt een onderzoeker in staat om de verzamelde monsters onmiddellijk in te vriezen in cryovialen met streepjescode op droogijs bij -80 °C in de operatiekamer (OK). Deze procedure zorgt voor een hoge en consistente monsterkwaliteit voor downstream moleculaire analyse. Naast een uitstekende monsterkwaliteit is nauwkeurige annotatie van monsters in een biobank van cruciaal belang. Met behulp van een webgebaseerde HIPAA (Health Insurance Portability and Accountability Act)-conforme REDCap (research electronic data capture) database5, maakt onze workflow de opslag van gedetailleerde metadata voor elk monster mogelijk, inclusief leeftijd, geslacht, ziekte, ziektestadium, monstertype en unieke kenmerken van de operatie. Dit zal een nauwkeurige toekomstige zoekcapaciteit mogelijk maken, bijvoorbeeld naar monsters van een specifieke ziekte of een bepaalde groep patiënten. Bovendien wordt de exacte locatie van elk monster in de vriezer gearchiveerd met behulp van een cartesisch rastersysteem, dat efficiënt monsteropvraging voor downstream-experimenten mogelijk maakt. We laten voorbeelden zien van DNA-, eiwit-, glycaan- en metabolietanalyses.
Onze workflow vertegenwoordigt een praktische en effectieve verbinding tussen de OK en het onderzoekslaboratorium en biedt een waardevolle basis voor translationeel onderzoek.
Protocol
Het protocol volgt de richtlijnen van de Institutional Review Board for Human Subjects Research (IRB) aan de Stanford University, VS.
LET OP: Dit protocol is een gids voor gekwalificeerde oogheelkundige chirurgen. In de context van intraoculaire maligniteiten kan extraoculaire tumorzaaiing in de setting van waterige humor of glasvochtbiopten niet worden uitgesloten. Het risico op extraoculaire extensie en orbitale betrokkenheid is echter extreem laag bij transvitreale choroïdale tumorbiopsie, die wordt gedaan op een veiligheidsverbeterde manier en met zorgvuldige overweging van de ingangsplaats6. Dit protocol dekt niet en kan gecontra-indiceerd zijn in gevallen van retinoblastoom of tumoren met een hoog gemetastaseerd risico.
1. Voordat het monster wordt genomen
- Goedkeuring door de institutionele toetsingscommissie
- Verkrijg de goedkeuringen van de lokale IRB vóór het begin van het experiment en voer dienovereenkomstig de monsterverzameling uit.
- Onderzoekspopulatie
- Inclusiecriteria: Omvatten alle patiënten (leeftijd 0 - 99 jaar) die intraoculaire chirurgie ondergaan in de instelling die een voldoende hoeveelheid waterige humor of glasvocht zal leveren die groter is dan die welke nodig is voor geschikte diagnostische tests om de toestand van de patiënt te evalueren en patiënten die willen deelnemen.
- Uitsluitingscriteria: Sluit patiënten uit die weigeren deel te nemen en zwangere vrouwen.
- Geïnformeerde toestemming
- Verkrijg schriftelijke geïnformeerde toestemming van elke patiënt volgens het door de IRB goedgekeurde protocol.
- Archiveer de ondertekende toestemming in een beveiligde database.
- Train betrokken personeel (chirurgen, laboranten, ok-personeel, wetenschappers) zoals beschreven in dit protocol.
- Stel een voorbeelddatabase voor het beheren van een database in. Gebruik REDCap als een HIPAA-compatibele webgebaseerde voorbeelddatabase die is ontworpen om gegevensverzameling voor onderzoeksstudieste ondersteunen 5.
OPMERKING: In dit artikel wordt het gebruik van de webinterface van REDCap beschreven om formulieren te ontwerpen, velden te definiëren, vertakkingslogica in te stellen en gegevensvalidatieregels toe te passen zonder dat uitgebreide programmeerkennis nodig is. Als alternatief kan ook andere software, zoals standaard spreadsheettoepassingen, geschikt zijn. - Zorg voor de beschikbaarheid van een koelbox, droogijs, spuit voor monsterverzameling en cryovials (zie materiaaltabel). Gebruik cryovialen met barcodes die permanent op de injectieflacons zijn geëtst. Dit elimineert de noodzaak om patiëntidentificaties op de injectieflacon toe te voegen en de mogelijkheid om een label te verliezen onder vriesomstandigheden.
- Breng de chirurg op de hoogte van de zaak en de laborant die zal helpen met het verzamelen van monsters in de OK ten minste 24 uur voorafgaand aan de geplande operatie.
2. Verwerving van chirurgische monsters in de operatiekamer
- Mobiele operatiekamer lab interface (MORLI)
- Stel een MORLI in de operatiekamer in. MORLI omvat een vlak labbankoppervlak, een computer/tablet met een barcodescanner met toegang tot de REDCap-database en een koelbox met droogijs (zie Materiaaltabel).
LET OP: Droogijs is extreem koud. Draag altijd handschoenen bij het hanteren van droogijs en raak het niet aan.
- Stel een MORLI in de operatiekamer in. MORLI omvat een vlak labbankoppervlak, een computer/tablet met een barcodescanner met toegang tot de REDCap-database en een koelbox met droogijs (zie Materiaaltabel).
- Voorbereiding van de monsterneming in de OK
- Log in op de computer/tablet op MORLI en open de REDCap database.
- Controleer of geïnformeerde toestemming is ondertekend door de patiënt en bevestig dat met de chirurg. Herinner hem/haar eraan dat een onverdund monster nodig is.
- Draag handschoenen. Verkrijg het juiste aantal cryovialen met streepjescode (0,5 ml voor waterige humor en 1,9 ml voor glasvochtmonsters) en plaats ze waar ze gemakkelijk toegankelijk zijn.
- Verzameling van vloeibare biopsieën van waterige humor
LET OP: Beschouw menselijke weefselmonsters als biologisch gevaarlijk materiaal, waarvoor passende voorzorgsmaatregelen nodig zijn, zoals een laboratoriumjas en handschoenen om de veiligheid van het betrokken personeel te garanderen.
OPMERKING: De volgende stappen mogen alleen worden uitgevoerd door een opgeleide oogheelkundige chirurg. Waterige humor vloeibare biopsieën kunnen bijvoorbeeld worden verkregen aan het begin van cataractchirurgie, een van de meest voorkomende operaties wereldwijd.
OPMERKING: Een steriel veld wordt onderhouden volgens de standaard van zorgprotocollen in de operatiekamer. Preoperatieve procedures met betrekking tot anesthesie van de patiënt volgen standaardzorgstappen voor anterieure kamer- en vitreoretinale operaties.- Bereid het oog voor en drapeer het voor een operatie en plaats een steriel ooglidspeculum voor optimale visualisatie van het steriele veld.
- Gebruik een operatiemicroscoop om een voorste kamer paracentese loodrecht op de limbus uit te voeren met behulp van een naald van 30-32 G die is aangesloten op een spuit van 1 ml. Gebruik een wattenstaafje of kleine tang om het oog tijdens deze procedure te stabiliseren.
OPMERKING: Zorg ervoor dat de naald en de spuit zijn vergrendeld en dat er geen druk in de spuit zit (door de zuiger te bewegen). Zorg ervoor dat de punt van de naald boven de perifere iris in de middelste voorste kamer blijft om schade aan intraoculaire structuren te voorkomen. In het geval van een staaroperatie kan de naald om de vloeibare biopsie te verkrijgen ook de voorste kamer binnendringen via een van de paracenteses die zijn gemaakt voor de staaroperatie. - Onder directe visualisatie via de microscoop, handmatig ongeveer 100 μL onverdunde waterige humor opzuigen met behulp van een spuit van 1 ml. Beweeg de zuiger van de spuit met de niet-dominante hand van de chirurg of door een getrainde assistent zonder de naald te bewegen.
OPMERKING: Verkrijg minder dan 100 μL waterige humor voor het geval de voorste kamer zou instorten. - Verwijder de naald voorzichtig uit de voorste kamer.
OPMERKING: Houd in een fakisch oog de naald over de iris om te voorkomen dat u de lens aanraakt. Positieve druk op de aardbol kan reflux verhogen. Het loslaten van de wattenpoot voordat de naald wordt teruggetrokken, helpt reflux te verminderen. - Trek de zuiger terug en kijk hoe de lucht en de verzamelde vloeistof bewegen.
- Injecteer de spuit in de cryovial. De extra lucht maakt de dode ruimte van de spuit vrij.
- Gebruik de streepjescode op de cryovial om het monster te scannen naar het REDCap-formulier op een computer in de operatiekamer (meer details in stap 3.1 tot en met 3.9).
- Breng de cryovial onmiddellijk over op droogijs in de koelbox.
- Ga door met de operatie die voor de patiënt is gepland (bijvoorbeeld een staaroperatie zoals eerder beschreven7 ).
- Verzameling van vloeibare biopsieën van glasvocht
OPMERKING: De volgende stappen mogen alleen worden uitgevoerd door een getrainde vitreoretinale chirurg. Glasvochtbiopten kunnen worden verkregen aan het begin van een vitrectomie8. Omdat het doel is om een onverdund glasvochtmonster te verzamelen, zal de vitrectomiesnijder niet worden geprimed met vloeistof1.
OPMERKING: Een steriel veld wordt onderhouden volgens de standaard van zorgprotocollen in de operatiekamer. Preoperatieve procedures met betrekking tot anesthesie van de patiënt volgen de standaardzorgstappen voor voorste kamer- en vitreoretinale operaties.- Bereid het oog voor en drapeer het voor een operatie en plaats een steriel ooglidspeculum voor optimale visualisatie van het steriele veld.
- Maak sclerotomieën met een 23-, 25- of 27-G trocar canule, volgens de standaardzorgprocedures. Breng de infusiecanule in en bevestig visueel de juiste plaatsing in de glasvochtholte.
- Activeer in de glasvochtholte de glasvochtsnijder zonder infusie om een onverdund glasvochtmonster te verzamelen. Zuig handmatig 0,5 tot 1,0 ml glasvocht aan met behulp van een spuit die is aangesloten op de glasvochtextrusiecanule1.
- Verwijder de glasvochtsnijder uit het oog en schakel de vloeistofinfusie in.
- Zuig de resterende vloeistof in de slang op in de spuit.
- Koppel de spuit los.
- Verwerk het monster zoals beschreven voor een waterig humormonster in punt 2.3 (stap 2.3.5 tot stap 2.3.9).
3. Verwerking van monsters in de OK en toevoeging van monsters aan de database
- Vraag de laborant om de voorbereide cryovial (0,5 ml voor waterige humor en 1,9 ml voor glasvochtmonsters) in te nemen en naar de chirurg te lopen zonder steriele OK-apparatuur aan te raken.
- Vraag de laborant om de cryovial te openen.
- Laad de spuit direct in de cryovial.
- Vraag de laborant om de cryovial onmiddellijk samen te vatten.
- Vraag de laborant om terug te lopen naar de MORLI en breng het monster onmiddellijk over op droogijs in de koelbox (-80 °C). Sluit het deksel van de doos.
- Open een nieuw formulier voor het verzamelen van voorbeelden. Voer de volgende informatie in het betreffende veld van het formulier in: casuschirurg, locatie en datum van verzameling, patiëntidentificatienummer en andere basisinformatie, zoals leeftijd, geslacht, rechter- of linkeroog, diagnose, preoperatieve geschiedenis (vrije tekst), informatie over de procedure (bijv. Type operatie), evenals informatie over de monsters, zoals het aantal verzamelde monsters, type monsters (waterige humor, glasvocht) en andere details zoals volumes. Voeg de streepjescode van de buis toe met behulp van de barcodescanner.
- Klik op Verzenden/Volgende.
- Herhaal stap 3.1 tot en met 3.7 als er aanvullende monsters zijn verzameld.
- Wanneer alle monsters zijn beveiligd, klikt u op Opslaan en verzenden op het formulier REDCap-monsterverzameling. Log vervolgens uit bij de database en de computer/tablet.
4. Cryovialen overbrengen naar opslag
- Transporteer de monsters op droogijs in de koelbox van de OK naar het lab en plaats deze op een laboratoriumbank naast een labcomputer.
- Meld u aan bij REDCap op de labcomputer met uw aanmeldings-ID en wachtwoord.
- Draag handschoenen. Neem een van de verzamelde monsters en scan de barcode van de cryovial in de database (meer details in rubriek 5). Plaats het monster onmiddellijk terug op droogijs.
- Zorg voor een tweede container gevuld met droogijs.
- Haal een rek voor de cryovialen uit de -80 °C vriezer. Plaats het in de tweede container op droogijs.
OPMERKING: Een 96-formaat rek is nodig voor de 0,5 ml waterige humorbuizen en een 48-formaat rek voor de 1,9 ml glasvochtbuizen. - Scan de barcode van het rack naar de database (meer details in sectie 5).
- Breng het monster over in het rek.
- Voeg de positie van de injectieflacons in het rek toe aan de database (meer details in rubriek 5).
- Klik op Opslaan en verzenden.
- Transporteer het rek met de injectieflacons op droogijs naar de koelkast voor opslag bij -80 °C. Voeg het rek toe aan een specifieke positie in de koelkast met behulp van een coördinatensysteem. Dit zal later toelaten om monsters voor downstream-analyse gemakkelijk op te halen.
5. Formulier voor monsteropslag
- Vul een opslagformulier in voor elk monster dat wordt verzameld tijdens de invoerformulierfase. Klik op de lege cirkel of de "+" onder Voorbeeldopslag om een nieuw opslagformulier te maken en te openen.
- Voer de datum in waarop dit formulier is ingevuld onder Archiefdatum vastleggen.
- Scan of typ de streepjescode van de buis onder Sample Tube Barcode. Plaats het monster onmiddellijk terug op droogijs.
- Selecteer of een monster wordt overgebracht of dat het monster naar interne biorepository-opslag gaat.
- Controleer of schriftelijke geïnformeerde toestemming is verkregen van de patiënt en schakel het vakje in onder Naleving van toestemming verifiëren en voer uw naam in onder Toestemming geverifieerd door.
- Selecteer een vrije en geschikte locatie voor de cryovial in het rek. Breng de cryovial op deze positie over in het rek (bijv. positie A1). Bewaar het rek op droogijs.
- Voer in de locatiefase de volgende informatie in: de locatie van de vriezer onder Vriezer, het schapnummer waar het monster onder Plank wordt opgeslagen, de streepjescode van de doos onder Streepjescode van de doos, de positie van de buis in de doos per rij (Buispositie (Rij)) en kolom (Buispositie (Kolom)).
OPMERKING: Optioneel kan ook een dooslabel worden ingevoerd onder Box Label, wat het gemakkelijker kan maken om de doos in de vriezer te vinden. - Voer in de sectie Gebruik de volgende informatie in: de naam van het project waarvoor het monster wordt gebruikt (projectnaam), het monstervolume in een van de volgende categorieën: volledig, gedeeltelijk, bijna leeg of leeg (monstervolume) en opslagnotities indien van toepassing onder Opslagnotities.
OPMERKING: De datum, tijd en gebruiker die het formulier het laatst heeft geopend, wordt automatisch ingevuld om een bewakingsketen te garanderen die indien nodig kan worden gecontroleerd en gecontroleerd. - Controleer of het formulier is ingevuld door onder Voltooien? te klikken.
- Klik op Formulier opslaan en afsluiten. Dit brengt u terug naar het patiëntenoverzicht.
- Voor elke buis die is verzameld, genereert u een ander formulier voor monsterverzameling door op de "+" onder Monsteropslag te klikken. Herhaal vervolgens stap 5.1 tot en met 5.10.
- Klik op Opslaan en afsluiten om het formulier in te vullen en u af te melden bij de database en de computer/tablet.
- Breng het monsterrek (op droogijs) over in de koelkast op de vooraf bepaalde positie.
6. Ophalen van chirurgische monsters voor downstream-analyse
OPMERKING: Specimens worden vaak enkele jaren gearchiveerd voordat ze worden geanalyseerd. De cryovialen met streepjescode en het doorzoekbare REDCap-databasesysteem maken het mogelijk om elk monster gemakkelijk te vinden en te lokaliseren voor downstream-analyse.
- Identificeer voorbeelden die interessant zijn voor het experiment met behulp van de zoekfunctie van de database. Dit zal het mogelijk maken om bijvoorbeeld alle waterige humormonsters te vinden van patiënten tussen 20 en 40 jaar met diabetische retinopathie.
- Verkrijg de locatie van de cryovialen van belang (vriezer, plank / rek, monsterrek, coördinaten in het rek). Schrijf ze op, print ze af of houd ze beschikbaar op een mobiele computer/tablet om het vinden van de monsters in de vriezer te vergemakkelijken.
- Markeer de voorbeelden zoals gebruikt in de database.
- Klik op Opslaan en afsluiten om het formulier in te vullen en u af te melden bij REDCap en de computer/tablet.
Representative Results
De verzamelde vloeibare biopsiemonsters kunnen worden onderworpen aan verschillende moleculaire analyses, waaronder de analyse van DNA, eiwitten, glycanen en metabolieten. Het is al eerder aangetoond dat langdurige opslag gedurende meerdere jaren bij -70 °C de integriteit van het proteomische profiel niet significant beïnvloedde9. De REDCap-database maakt het eenvoudig en snel ophalen van monsters mogelijk. De database kan worden doorzocht op monsters van een specifieke groep patiënten, bijvoorbeeld alle patiënten met diabetische retinopathie. De database geeft dan de barcodes van de buizen en de posities in opslag. Tot nu toe hebben we meer dan 1.000 vloeibare biopsieën verzameld en gearchiveerd. De database stelde ons in staat om snel de monsters te vinden voor downstream analyses 3,10 en hielp bij het uitvoeren van de volgende experimenten.
Een 17-jarige vrouw presenteerde zich met een netvlies- en oogzenuwontsteking. Ze was immuungecompromitteerd en er was bezorgdheid over infectie. Waterige humor werd verzameld uit haar rechteroog en verzonden voor DNA PCR-analyse. De resultaten waren positief voor cytomegalovirus en negatief voor herpes simplex-virus en toxoplasmose. Deze bevindingen illustreren dat vloeibare biopsieën met waterige humor kunnen helpen om infectieuze van niet-infectieuze vormen van intraoculaire ontsteking te onderscheiden, wat van cruciaal belang is om de juiste therapie te selecteren.
Vloeistofchromatografie-massaspectrometrie maakt een onbevooroordeelde en semi-kwantitatieve analyse van het proteoom mogelijk. In een vloeibare biopsie van het glasvocht van een patiënt die vitrectomie onderging, kon de techniek 484 unieke eiwitten identificeren, waaronder complement C3 (C3), optica (OPTC) en collageen type II alfa 1 (COL2A1) (figuur 1A).
Drie vloeibare biopsieën van glasvocht werden geanalyseerd met behulp van een glycoproteomics multiplex ELISA (zie Materiaaltabel)11. De test detecteerde de glycosylatieprofielen van 500 menselijke eiwitten en legde een verscheidenheid aan biologische routes vast, zoals metabolisme, immuunrespons, celadhesie en actine-organisatie (figuur 1B).
Een metabolomics-screening met capillaire elektroforese in combinatie met Fourier getransformeerde massaspectrometrie12 (zie tabel met materialen) identificeerde 292 verschillende metabolieten in drie waterige humorvloeistofbiopsiemonsters. Een routeanalyse (zie tabel met materialen)13 identificeerde een verscheidenheid aan metabole routes, waaronder aminozuurmetabolisme, ureumcyclus en carnitinesynthese (figuur 1C).
Figuur 1: Representatieve resultaten . (A) Proteomics analyse van menselijk glasvocht met behulp van vloeistofchromatografie en tandem massaspectrometrie (LC-MS/MS) identificeerde 484 unieke eiwitten in een enkele vloeibare biopsie. Eiwitniveaus worden weergegeven en gerangschikt op basis van spectrale tellingen. Representatieve eiwitten zijn blauw gemarkeerd. (B) Een glycoproteomics multiplex ELISA detecteerde glycosyleringsniveaus van 500 unieke eiwitten in drie glasachtige vloeibare biopten. Een STRING-eiwitinteractieanalyse identificeerde clusters van eiwitinteracties (clusters met ten minste 10 eiwitten worden getoond). Het meest significant verrijkte pad wordt voor elk cluster weergegeven. (C) Metabolomics-analyse met behulp van massaspectrometrie identificeerde 292 verschillende metabolieten in drie vloeibare biopsieën met waterige humor. Elk punt vertegenwoordigt één voorbeeld. De hoogte van de staaf komt overeen met het gemiddelde aantal metabolieten, de foutbalk vertegenwoordigt de standaarddeviatie. Het rechterpaneel toont aanzienlijk verrijkte paden. Het aantal gedetecteerde metabolieten (teller) en het totale aantal metabolieten in elke route (noemer) worden weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Chirurgische monsters van patiënten maken directe moleculaire karakterisering van ziekte bij levende mensenmogelijk 2,3,4,14, en kunnen helpen de beperkingen van cel- en dierziektemodellen te overwinnen die de menselijke ziekte niet volledig samenvatten 15,16. Moleculaire analyse van menselijk weefsel kan de selectie van nieuwe geneesmiddeldoelen verbeteren en kan bijdragen tot een hoger slagingspercentage van klinische proeven en goedkeuring van geneesmiddelen17. Bovendien biedt deze aanpak het potentieel voor gepersonaliseerde geneeskunde, omdat het verkregen weefsel de unieke genomische, epigenomische, metabolomische, glycomische en proteomische vingerafdruk van elk individu behoudt 2,18,19.
Een hoge en consistente monsterkwaliteit is van fundamenteel belang voor alle moleculaire analysetoepassingen. Eerdere studies hebben aangetoond dat onmiddellijke bevriezing na het ophalen van het monster en het vermijden van herhaalde vries-/dooicycli van cruciaal belang zijn voor hoge monsterkwaliteiten 9,20. Langdurige opslag gedurende meerdere jaren bij -70 °C had geen significante invloed op de integriteit van het proteomische profiel9. Een gestandaardiseerd protocol is een belangrijke basis om bias te verminderen en de vergelijkbaarheid van wetenschappelijke gegevens te verbeteren, vooral wanneer meerdere mensen (chirurgen, technici en anderen) of verschillende instellingen betrokken zijn bij het bemonsteringsproces. Afgezien van de kwaliteit van het monster, is de annotatie van monsters een andere belangrijke factor die standaardisatie vereist om de correlatie van moleculaire bevindingen met klinische gegevens mogelijk te maken. Ons protocol is gebaseerd op drie essentiële principes om dit te bereiken: 1) een gestandaardiseerde bemonsteringsprocedure voor waterige humor en glasvocht biopsieën door een oogheelkundig chirurg, 2) de onmiddellijke verwerking en snap-freezing van monsters in de OK door laboratoriumpersoneel, en 3) een metadata-annotatie van elk monster in een webgebaseerde database waarmee onderzoekers snel monsters kunnen vinden voor latere experimenten.
Naast glasvochtmonsters20 stelt deze workflow ook de gestandaardiseerde verzameling waterige humorvloeistofbiopten vast voor moleculaire analyse. De waterige humor is een zeer toegankelijke, complexe vloeistof in de voorste oogkamer die niet alleen oogziekten van de voorste maar ook van het achterste segment van het oog weerspiegelt, waaronder netvliesaandoeningen18,21. Samen met het feit dat een groot aantal waterige humormonsters kan worden verzameld, bijvoorbeeld tijdens cataractchirurgie, een van de meest uitgevoerde operaties wereldwijd, maken deze kenmerken het een interessante bron voor vloeibare biopsieën van het menselijk oog. De gestandaardiseerde metadata-annotatie van elk monster dat in deze workflow is vastgesteld, kan ook de correlatie van proteoomgegevens met prospectieve klinische follow-upgegevens mogelijk maken. Dit biedt de opwindende mogelijkheid om nieuwe prognostische biomarkers te identificeren die kunnen helpen bij het schatten van de prognose voor toekomstige patiënten.
Moleculaire analyse van menselijke chirurgische monsters heeft echter ook belangrijke beperkingen. Zo zijn complexe experimentele manipulaties vaak alleen mogelijk in dier- en celmodellen. Een oplossing kan zijn om het moleculaire profiel van dier- of celmodellen te vergelijken met dat van menselijke ziekten. Deze strategie kan overlappende eiwitbiomarkers en therapeutische doelen identificeren die kunnen worden gevalideerd in dier- of celmodellen om de meest veelbelovende kandidaten te identificeren die correleren met menselijke ziekten en waarschijnlijk zullen slagen in klinische onderzoeken 4,16.
Kortom, onze workflow creëert een praktische interface tussen de OK en het onderzoekslaboratorium die gestandaardiseerde en high-throughput verzameling, annotatie en opslag van hoogwaardige chirurgische monsters voor moleculaire downstream-analyse mogelijk maakt, wat een waardevolle basis biedt voor toekomstig translationeel onderzoek.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
VBM wordt ondersteund door NIH-subsidies (R01EY031952, R01EY031360, R01EY030151 en P30EY026877), het Stanford Center for Optic Disc Drusen en Research to Prevent Blindness, New York, VS. JW en DR worden ondersteund door de VitreoRetinal Surgery Foundation, USA. DR wordt ondersteund door de DARE Fellowship, die wordt gesponsord door de Lundbeck Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5ml Tri-coded Tube, 96-format, External Thread | Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA | 68-0703-12 | used for aqueous humor samples |
| 1 mL syringe | surgical grade, whatever available in hospital | - | for aqueous humor biopsies |
| 1.9ml Tri-coded Tube, 48-format, External Thread | Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA | 65-7643 | used for vitreous samples |
| 3 mL syringe | surgical grade, whatever available in hospital | - | for vitreous biopsies |
| 30-32-gauge needle | surgical grade, whatever available in hospital | - | for aqueous humor biopsies |
| Capillary electrophoresis coupled with Fourier transformed mass spectrometry (CE-FTMS) | Human Metabolome Technologies, Inc., Tsuruoka, Japan | - | - |
| Constellation vitrectomy system with 23-, 25-, or 27-gauge trocar cannula system | Alcon Laboratories Inc, Fort Worth, TX, USA | - | for vitreous biopsies |
| Cooling box | Standard styrofoam box, whatever available in lab | - | - |
| Dry ice | Whatever available in lab | - | - |
| Handsfree Standard Range Scanner Kit with Shielded USB Cable | Zebra Symbol | DS9208-SR4NNU21Z | Barcode scanner |
| Human Glycosylation Antibody Array L3 | RayBiotech, Peachtree Corners, GA, USA | GAH-GCM-L3 | - |
| Mac mini | Apple Inc., Cupertino, CA 95014, USA | - | - |
| MetaboAnalyst software | Pang et al., 2021, PMID: 34019663 | - | - |
| Rack for 0.5ml tubes, 96-Format | Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA | 66-51026 | for aqueous humor samples |
| Rack for 1.9ml tubes, 48-Format | Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA | 65-9451 | for vitreous samples |
| REDCap browser-based sample database | REDCap Consortium, Vanderbilt University, https://www.project-redcap.org | - | - |
References
- Mishra, K., et al. Intraoperative complications with vitreous biopsy for molecular proteomics. Ophthalmic Surgeries, Lasers Imaging Retina. 54 (1), 32-36 (2023).
- Velez, G., Bassuk, A. G., Colgan, D., Tsang, S. H., Mahajan, V. B. Therapeutic drug repositioning using personalized proteomics of liquid biopsies. JCI Insight. 2 (24), (2017).
- Velez, G., et al. Liquid biopsy proteomics of uveal melanoma reveals biomarkers associated with metastatic risk. Molecular Cancer. 20 (1), 39 (2021).
- Wert, K. J., et al. Metabolite therapy guided by liquid biopsy proteomics delays retinal neurodegeneration. EBioMedicine. 52, 102636 (2020).
- Harris, P. A., et al. The REDCap consortium: Building an international community of software platform partners. Journal of Biomedical Informatics. 95, 103208 (2019).
- Finn, A. P., Materin, M. A., Mruthyunjaya, P. Choroidal tumor biopsy: A review of the current state and a glance into future techniques. Retina. 38 Suppl 1, S79-S87 (2018).
- Tarantola, R. M., Graff, J. M., Somani, R., Mahajan, V. B. Temporal approach for small-gauge pars plana vitrectomy combined with anterior segment surgery. Retina. 32 (8), 1614-1623 (2012).
- Mahajan, V. B., et al. Sutureless triplanar sclerotomy for 23-gauge vitrectomy. Archives in Ophthalmology. 129 (5), 585-590 (2011).
- Mitchell, B. L., Yasui, Y., Li, C. I., Fitzpatrick, A. L., Lampe, P. D. Impact of freeze-thaw cycles and storage time on plasma samples used in mass spectrometry based biomarker discovery projects. Cancer Informatics. 1 (1), 98-104 (2005).
- Velez, G., et al. Proteomic insight into the pathogenesis of CAPN5-vitreoretinopathy. Science Reports. 9 (1), 7608 (2019).
- Montgomery, M. R., Hull, E. E. Alterations in the glycome after HDAC inhibition impact oncogenic potential in epigenetically plastic SW13 cells. BMC Cancer. 19 (1), 79 (2019).
- Okamoto, N., et al. Comparison of serum metabolomics pathways and patterns between patients with major depressive disorder with and without type 2 diabetes mellitus: An exploratory study. Journal of Integrated Neuroscience. 22 (1), 13 (2023).
- Pang, Z., et al. MetaboAnalyst 5.0: narrowing the gap between raw spectra and functional insights. Nucleic Acids Research. 49 (W1), W388-W396 (2021).
- Wolf, J., et al. The Human Eye Transcriptome Atlas: A searchable comparative transcriptome database for healthy and diseased human eye tissue. Genomics. 114 (2), 110286 (2022).
- Seok, J., et al. Genomic responses in mouse models poorly mimic human inflammatory diseases. Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 110 (9), 3507-3512 (2013).
- Wolf, J., et al. Comparative transcriptome analysis of human and murine choroidal neovascularization identifies fibroblast growth factor inducible-14 as phylogenetically conserved mediator of neovascular age-related macular degeneration. Biochimca et Biophysica Acta Molecular Basis of Diseases. 1868 (4), 166340 (2022).
- Dowden, H., Munro, J. Trends in clinical success rates and therapeutic focus. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (7), 495-496 (2019).
- Li, H. T., et al. Characterizing DNA methylation signatures of retinoblastoma using aqueous humor liquid biopsy. Nature Communication. 13 (1), 5523 (2022).
- Velez, G., et al. Personalized proteomics for precision health: identifying biomarkers of vitreoretinal disease. Translational Vision Science and Technology. 7 (5), 12 (2018).
- Skeie, J. M., et al. A biorepository for ophthalmic surgical specimens. Proteomics Clin Applications. 8 (3-4), 209-217 (2014).
- Rinsky, B., et al. Analysis of the aqueous humor proteome in patients with age-related macular degeneration. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 62 (10), 18 (2021).
